基于p38 MAPK/NF-κB信號通路探究芍藥醇對創傷性腦損傷小鼠神經保護作用的機制研究

【摘要】 目的 預測芍藥醇對創傷性腦損傷（TBI）后神經功能恢復和神經炎癥的影響，以評估其在臨床實踐中的潛在價值。方法 采取控制皮質撞擊（CCI）法建立成年小鼠TBI模型，尾靜脈注射后評估觀測芍藥醇的治療效能。網絡藥理學預測了p38 MAPK/NF-κB是作為芍藥醇治療TBI的潛在路線。通過蛋白質印跡及酶聯免疫吸附試驗進行評估目標蛋白質和炎癥因子的表達。采用尼氏染色法觀察神經元損傷情況。通過改良神經功能缺損評分（mNSS）評價TBI后的神經恢復情況。結果 TBI后給予芍藥醇可預防CCI小鼠的神經元死亡，減少神經炎癥，促進神經功能恢復。網絡藥理學研究表明芍藥醇可能通過p38 MAPK/NF-κB路徑體現其治療效能。結論 芍藥醇給藥后在TBI疾病病程發展過程中具有較好的神經保護和抗炎特性。其機制可能與p38 MAPK/NF-κB信號通路的調節有關。

【關鍵詞】 芍藥醇；創傷性腦損傷；神經功能；炎癥

【中圖分類號】 R651 【文獻標志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2024）04-0371-06

Mechanism of neuroprotective effect of paeoniflorol on traumatic brain injury mice based on p38 MAPK/NF-κB signaling pathway JIANG Qiaoji， YANG Hongwei， DING Liang， WEI Min， WAN Zhengqiang. Department of Neurosurgery， The Yancheng Clinical College of Xuzhou Medical University， The First people’s Hospital of Yancheng， Yancheng 224001， China

Corresponding author： WAN Zhengqiang

Abstract： Objective To predict the effect of paeoniflorol on neurological function recovery and neuroinflammation after traumatic brain injury（TBI） and evaluate its potential value in clinical practice. Methods A model of TBI in adult mice was established by controlled cortical impingement（CCI） method， and the therapeutic efficacy of paeoniflorol was evaluated after tail vein injection. Network pharmacology predicted that p38 MAPK/NF-κB was a potential route for the treatment of TBI with paeoniflorol. Western blotting and enzyme-linked immunosorbent assay were used to evaluate the expression of target proteins and inflammatory cytokines. Nissl staining was used to observe neuronal damage. Modified Neurological Severity Score（mNSS） was used to evaluate neurological recovery after TBI. Results Paeoniflorol administration after TBI prevented neuronal death， reduced neuroinflammation and promoted neurological recovery in CCI mice. Network pharmacology studies had shown that paeoniflorol may reflect its therapeutic efficacy through the p38 MAPK/NF-κB pathway. Conclusions Paeoniflorol has superior neuroprotective and anti-inflammatory properties during the course of TBI disease development， and its mechanism may be related to the regulation of the p38 MAPK/NF-κB signaling pathway.

Key words： paeoniflorol; traumatic brain injury; nerve function; inflammation

基金項目：江蘇省醫學創新中心建設項目（CXZX202212）；江蘇省研究生科研與實踐創新計劃課題項目（SJCX23_1405）

作者單位：224001 鹽城，徐州醫科大學鹽城臨床學院，鹽城市第一人民醫院神經外科（姜喬繼，楊紅偉，丁亮，萬政強）；徐州醫科大學附屬醫院放射科（韋敏）

通信作者：萬政強

創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是因頭部受到重擊或震動而造成，也可因為腦組織被穿透所導致，例如顱骨碎片。這通常會導致嚴重的神經損傷，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔，同時這也是神經外科手術中最常見的創傷性疾病^[1]。隨著研究的進展，中醫藥材單體的提取物成為炎癥損傷領域研究的新渠道。芍藥醇（Paeonol，PAE，2′-羥基-4′-甲氧基苯乙酮）是從芍藥根皮中分離得到的天然酚類單體，已廣泛用于一些炎癥相關疾病和心血管疾病的臨床治療^[2]。隨著醫療技術的進步，芍藥醇的臨床應用越來越多，例如對炎癥的抑制作用^[3-6]。然而，芍藥醇對創傷性腦損傷所導致的繼發性神經炎癥能否有明確的療效尚不明確。本研究通過網絡藥理學以創傷性腦損傷為靶標，明確了其針對性的治療靶點，使用小鼠模型評價芍藥醇抑制創傷性腦損傷后過度的神經炎癥反應以及抑制減輕炎癥導致的神經元細胞的凋亡及其潛在的生物學作用機制，旨在改善創傷性腦損傷患者的預后和生活質量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性C57BL/6J小鼠，SPF級，7周齡，50只，體質量（30±3）g，江蘇醫藥職業學院動物實驗中心提供[許可證號 SYXK（蘇）2023-0005]。小鼠均在每12 h明/暗循環，20～24 ℃溫度和50%±5%濕度的標準條件下飼養，自由攝取水和食物。經江蘇醫藥職業學院實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 藥物、試劑和儀器 芍藥醇（純度≥99%，美國Merck公司），白細胞介素（interleukin，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）和IL-10酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒（美國Invitrogen公司），p38、p-p38、NF-κB抗體（美國Proteintech公司）， β-actin抗體（日本Wako公司），尼氏（Nissl）染色液（上海碧云天生物），多功能酶標儀（BioTek synergy2），WB凝膠電泳、轉膜配套儀器、化學發光凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司），低溫高速離心機（Eppendorf艾本德中國有限公司），徠卡全自動倒置顯微鏡（美國LEICA公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 小鼠隨機分為假手術組（Sham組）、模型組（TBI組）、芍藥醇低劑量、芍藥醇高劑量組（PAE組），光暗適應1周，24 ℃恒溫普通飼養。每組小鼠各6只。造模前，假手術組和模型組小鼠每天尾靜脈注射1 mL生理鹽水，芍藥醇低、高劑量組小鼠分別尾靜脈注射芍藥醇30 mg·kg^-1·d^-1、100 mg·kg^-1·d^-1連續給藥2 d。造模后，假手術組和模型組小鼠每天尾靜脈注射1 mL生理鹽水，芍藥醇低、高劑量組小鼠分別尾靜脈注射芍藥醇30 mg·kg^-1·d^-1、100 mg·kg^-1·d^-1連續給藥14 d。

1.2.2 控制皮質撞擊（controlled cortical impingement，CCI）模型建立 小鼠用異氟烷氣體麻醉，并固定在立體定向裝置上。在頭皮上做一個正中切口，在人字形縫線后1.0 mm和正中矢狀線外側2.0 mm處創建一個直徑為2.0 mm的骨窗。液壓沖擊連接器置于骨窗上方，硬腦膜保持完整。頂葉皮質受到與液壓沖擊工具的連續擊打后，立即用醫用無菌骨蠟密封骨瓣，并縫合皮膚。小鼠被放置在帶有直腸溫度計的加熱墊上，以保持體溫在36.0～37 ℃。將小鼠安置于籠子里，自由飲水、喂食。假手術組除液壓撞擊腦皮質外，其余手術操作模型組及芍藥醇給藥組相同。

1.2.3 改良神經功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS） 評估小鼠的神經功能，分別在創傷前后第-2、-1、0、1、3、5、7、14天由兩名對實驗組不知情的研究者在造模前后進行mNSS測試。mNSS測試是包括平衡、運動、感覺、反射評估的組合。每一次無反射或異常反應均得1分。在0～18分中，無神經功能缺陷為0分，嚴重的神經功能缺陷記至18分。

1.2.4 基因靶點篩選以及富集分析 使用“創傷性腦損傷”術語，在GeneCards數據庫（https：//genealacart.genecards.org/）搜索疾病相關靶點。通過SwissTargetPredicition（https：//www.swisstargetprediction.ch）靶點預測平臺對芍藥醇進行靶點預測。取交集以獲得兩者共有基因靶點。使用R語言軟件的生物導體生物信息學軟件包對創傷性腦損傷的交叉目標進行基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能富集分析。

1.2.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 準確稱取損傷側腦組織重量，按重量（mg）：體積（μL）=1∶9的比例加入9倍體積的勻漿介質（0.9%的生理鹽水），冰水浴條件下，機械勻漿制備成10%的勻漿液，2 500～3 000 r/min，離心10 min，取上清液進行測定。使用ELISA試劑盒根據使用方法說明書操作，計算定量組織中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10水平。

1.2.6 Western Blot法檢測p38 MAPK通路相關因子蛋白表達 將損傷的腦組織（損傷中心周圍0.5 cm）分離，RIPA裂解液冰上裂解（100∶1加入PMSF），高速離心后取上清測定濃度后變性蛋白，SDS-PAGE 凝膠電泳等量樣品蛋白，轉膜，5%脫脂乳封閉2 h; 加p38、p-p38、NFkB、β-actin一抗（1∶1 000）4 ℃孵育12～16 h，Tris鹽緩沖液（Tris buffer solution Tween，TBST）洗膜，辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000 稀釋）室溫孵育2 h，TBST再次洗膜，增強型化學發光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影，化學發光凝膠成像系統成像。Image J軟件量化條帶灰度值，蛋白相對表達量以目的蛋白灰度值/內參灰度值表示。

1.2.7 尼氏染色 用4%多聚甲醛固定冰凍切片10 min，取出切片蒸餾水洗滌殘余甲醛。浸泡于尼氏染色液5 min。蒸餾水洗滌2次（每次10 s）。95%乙醇，70%乙醇將切片脫水。在顯微鏡下觀察和拍攝尼氏小體。

1.3 統計學分析 所有數據均采用GraphPad Prism 9.1進行分析，并以平均數±標準差（x-±s）表示。采用t檢驗、單因素方差分析和雙因素方差分析來比較數據。以P＜0.05認為差異有統計學意義。所有實驗至少重復3次。

2 結 果

2.1 芍藥醇可能通過MAPK信號通路發揮治療創傷性腦損傷的治療效果 為了探討芍藥醇在治療創傷性腦損傷中的潛在分子生物學機制，本研究利用GeneCards數據庫進行了綜合分析，用關鍵詞“創傷性腦損傷”檢索，剔除相關性極小基因后總共得到了2 943個與創傷性腦損傷相關的靶點；隨后，本研究提供芍藥醇的分子結構通過SwissTargetPredicition，預測出了34個與芍藥醇相關的靶點；對這34個潛在的治療靶點與2 943個創傷性腦損傷疾病靶點進行了交叉分析，最終確定了23個常見靶點，見圖1A。對23個相交靶點的相應的柱狀圖進行分析顯示，AKT1、PTGS2、TNF、BCL2和MAPK3這些基因相鄰節點數量最多，見圖1B。結果表明，這些基因，包括AKT1、PTGS2、TNF、BCL2和MAPK3，可能是芍藥醇靶標創傷性腦損傷控制的核心基因。GO分析結果顯示，芍藥醇關鍵靶點主要涉及了絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）、MKK這兩種激酶在創傷性腦損傷的病程發展過程中能依次激活，并受到芍藥醇對其細胞的生長、分化、對環境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理病理過程的調節。同時GO分析結果還顯示，芍藥醇參與了調控G蛋白偶聯受體相關的信號通路，影響了G蛋白偶聯神經遞質受體活性和鉀通道調節劑活性、蛋白酶結合等生物過程，見圖1C。此外，KEGG分析表明，芍藥醇可能通過HTLV-1感染信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等發揮作用，見圖1D。

2.2 芍藥醇抑制NF-kappaB和p38（MAPK）通路相關因子蛋白的表達 本研究使用蛋白質印跡檢測從網絡藥理學分析中預測得到的MAPK通路相關分子。蛋白質印跡結果顯示，與TBI+載模型組（TBI組）相比，芍藥醇給藥組（PAE組）的p-p38和NF-κB表達顯著降低（P＜0.05），表明芍藥醇抑制p38/MAPK激活，其中創傷性腦損傷后增加了p-p38的表達，芍藥醇處理后抑制了這種表達。見圖2。

2.3 芍藥醇抑制創傷性腦損傷區的神經炎癥反應 本研究對假手術組（Sham組）、模型組（TBI組）、芍藥醇治療組（PAE組）從損傷部位獲得的腦組織進行了炎癥因子水平的測定。與模型組比較發現芍藥醇給藥后，損傷區域抗炎細胞因子IL-10水平顯著增加（P＜0.000 1），促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低（P＜0.000 1），見圖3A、B、D。

2.4 創傷性腦損傷后腦組織中神經元凋亡變形為了評估芍藥醇對創傷性腦損傷區神經元缺失壞死的影響，采用尼氏染色法觀察神經元損傷情況。尼氏染色的腦切片顯示，在損傷區域，與芍藥醇處理組相對比，模型組的切片染色顯示尼氏小體缺失更明顯（P＜0.001），表明神經元細胞嚴重缺失。因此可以看出芍藥醇的給藥一定程度上挽救了損傷區域神經元細胞數量的缺失。見圖4。

2.5 mNSS在損傷前后的測定 本研究評估了芍藥醇給藥對小鼠的神經保護作用，結果表明，與模型組相比，芍藥醇處理組的小鼠神經功能較好（P＜0.05）。從評分結果中可以看出，持續尾靜脈注射芍藥醇后，從第3～14天，小鼠在遭受創傷性腦損傷后神經功能的缺損得到有效地抑制。見圖5。

3 討 論

盡管迄今為止已經對創傷性腦損傷進行了廣泛的基礎和臨床科學研究，但尚未成功實施治療干預來改善患者的預后^[7]。過度的神經炎癥被認為是TBI病理生理學的關鍵因素，盡管確切的機制仍不完全清楚。創傷性腦損傷可引發放大的炎癥級聯反應，導致細胞死亡、血腦屏障破壞和腦水腫，包括小膠質細胞和星形膠質細胞的激活、白細胞的募集以及細胞因子和趨化因子的釋放^[8-9]。因此，減少創傷性腦損傷后過度的神經炎癥反應以及抑制減輕炎癥導致的神經元細胞凋亡是治療創傷性腦損傷、繼發性腦損傷的關鍵策略。根據最近的研究，天然黃酮類化合物表現出大量有益的抗神經炎癥作用，如下調促炎介質的表達、加速抗炎細胞因子的分泌、抑制星形細胞增多作用、抑制小膠質細胞的活化和極化等，天然黃酮類化合物對神經炎癥的主要機制包括抑制NLRP3炎癥小體激活和MAPKs、JAK/STAT、 NF-κB 和凋亡通路，以及 Nrf2、AMPK、BDNF/CREB、Wnt/β-連環蛋白、PI3K/Akt通路和SIRT1介導的HMGB1脫乙酰化^[10]。在過去十年中，數據表明MAP激酶[包括c-Jun N末端激酶（JNK）、細胞外信號調節激酶 1和2（ERK1/2）以及p38]的失調與炎癥過程的幾個階段有關，這反過來又會導致與年齡相關的神經退行性疾病^[11]。創傷性腦損傷后觀察到的p38/MAPK信號轉導的激活與早期的發現一致，即小膠質細胞中p38/MAPK的缺失可以減弱創傷性腦損傷誘導的炎癥反應^[12-13]。應激活化蛋白激酶、c-Jun N-末端激酶、p38 MAPK、ERK和NF-κB在大腦中起重要作用^[14]。因此，p38/MAPK亞型在創傷性腦損傷的發病機制中發揮著重要作用，使其成為一個有吸引力的治療靶點。針對創傷性腦損傷繼發炎癥的治療，通過皮質酮、黃體酮和促紅細胞生成素等具有已知抗炎特性的藥物迄今為止都沒有顯示出任何益處^[15-17]。

本研究建立了一個控制CCI小鼠模型，以確定一種有效的治療創傷性腦損傷的方法，發現芍藥醇改善了創傷性腦損傷后的小鼠神經功能，減少了炎癥反應，并防止持續的腦功能障礙；芍藥醇抑制p38 MAPK/NF-κB信號通路以減輕創傷性腦損傷模型中的繼發性炎癥。

顱腦損傷后的繼發性腦損傷包括谷氨酸興奮性毒性、線粒體紊亂、鈣穩態、DNA損傷、氧化應激和炎癥的連續病理過程^[18]。炎癥反應是創傷性腦損傷后神經功能恢復的重要因素。適當的炎癥反應可以清除損傷并幫助神經元重塑，而過度炎癥可以導致持續的神經元損傷并誘導隨后的氧化應激和腦水腫^[19]。當炎癥發生時，免疫細胞通過從受損的神經元組織中釋放趨化因子而被募集到損傷區域^[20]。創傷性腦損傷患者在受傷后第一年的血清IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平升高， 與抗炎標志物IL-10相比，IL-6的促炎負荷更高^[21]。本研究對損傷部位獲得的腦組織進行了炎癥因子水平的測定。與模型組比較發現芍藥醇給藥后，損傷區域抗炎細胞因子IL-10水平顯著增加，促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低。基于實驗結果可以認為芍藥醇降低了創傷性腦損傷引起的神經損傷和繼發性炎癥反應的程度。

為了探討芍藥醇在治療創傷性腦損傷中的潛在分子生物學機制，本研究通過網絡藥理學將潛在的治療靶點與疾病靶點進行了交叉分析，最終確定了23個關鍵靶點。通過GO分析結果顯示，芍藥醇關鍵靶點主要涉及了MAPK、MKK。這兩種激酶在創傷性腦損傷的病程發展過程中能依次激活，并受到芍藥醇對其細胞的生長、分化、對環境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理病理過程的調節。有證據表明，創傷性腦損傷激活p38/MAPK通路，該通路與許多炎癥調節機制有著共同的聯系^[22-24]。同時大量證據表明，MAPK家族（JNK、p38和ERK）和NF-κB是參與產生與炎癥反應相關的細胞因子和介質的關鍵信號分子^[25]。本研究利用蛋白質印跡分析揭示，相較于假手術組，模型組小鼠在創傷性腦損傷后，損傷側腦部組織顯著增加了p-p38和NF-κB蛋白的表達，進而表現為損傷部位的細胞快速死亡。相反，經過對模型組小鼠的芍藥醇給藥治療后發現，損傷側腦部組織p-p38和NF-κB蛋白的表達量相較于未給藥治療的模型組顯著降低。同時尼氏染色的腦切片顯示，在損傷區域，與芍藥醇處理組相對比，模型組的切片染色中顯示尼氏小體缺失更明顯。本研究結果表明，芍藥醇治療抑制了p38的磷酸化，導致MAPK通路的抑制，以及對其下游信號NF-κB表達的抑制，從而減少神經元細胞的死亡并減少損傷區域炎癥細胞因子的合成。

綜上所述，芍藥醇通過抑制繼發性炎癥反應，抑制p38 MAPK/NF-κB信號通路，保護腦組織免受創傷性腦損傷的影響，p38 MAPK信號通路主要抑制炎癥介質的釋放。基于這些結果，芍藥醇顯示出抑制創傷性腦損傷后過度的神經炎癥反應以及減輕炎癥導致的神經元細胞凋亡的潛力，且緩解了持續的腦功能障礙。然而，芍藥醇對創傷性腦損傷的保護作用涉及復雜的分子機制。因此，需要進一步的分析來充分了解芍藥醇減輕創傷性腦損傷患者繼發性神經損傷并促進學習記憶功能恢復的具體機制。這將是本研究今后工作的重點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：姜喬繼負責課題設計、實驗研究;楊紅偉、丁亮負責實驗數據統計分析、指導;韋敏負責查閱文獻和論文數據分析、撰寫文章;萬政強負責課題監督、獲取研究經費、文章的審閱及修訂。

[參 考 文 獻]

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（收稿2023-11-03 修回2023-12-17）