自體顱骨深低溫保存方案的探索性研究

【摘要】 目的 探索自體顱骨冷凍保存方案，包括保存溫度、保存時間、保存方法以及管理流程。方法回顧性分析2016年1月—2021年12月于寧夏醫科大學總醫院神經外科行去骨瓣減壓術+自體顱骨回植術的325例患者的臨床資料，并結合相關文獻進行復習。依據探索性保存方案使用之前和使用之后，將2016—2018年的數據分為舊管理組，2019—2021年的數據分為新管理組，進行兩組數據自體顱骨回植效果的評價研究。結果 自體顱骨冷凍保存平均時間122.9 d。行回植術后平均住院時間為12.3 d，經過新保存方案和管理流程應用之后，顱內感染率由3.4%降低到1.7%。結論 -80 ℃深低溫保存自體顱骨效果良好，可有效減少顱內感染發生率。

【關鍵詞】 自體顱骨；深低溫保存；管理方案；凍存架；顱內感染

【中圖分類號】 R651 【文獻標志碼】 B 【文章編號】 1672-7770（2024）04-0424-06

Exploratory study on cryopreservation scheme of autologous skull ZHAO Fang， MA Jiaxiang， ZHAO Dan， ZHANG Qing， PAN Xiaoliang， CUI Peng. Tissue amp; Organ Bank， General Hospital of Ningxia Medical University， Yinchuan 750001， China

Corresponding author： CUI Peng

Abstract： Objective To explore autologous skull cryopreservation protocol， including storage temperature， storage time， storage method， and management process. Methods The clinical data of 325 patients who underwent decompressive craniectomy and autogenous skull transplantation in the Department of Neurosurgery， General Hospital of Ningxia Medical University from January 2016 to December 2021 were analyzed retrospectively. The relevant literature were reviewed. According to the exploratory preservation plan， the data from 2016 to 2018 were divided into the old management group and the data from 2019 to 2021 were divided into the new management group. The evaluation study on the effect of autologous skull transplantation was conducted for both groups of data. Results The average cryopreservation time of autogenous skull was 122.9 days. The average hospital stay after replantation was 12.3 days. After the application of the new preservation scheme and management process， the intracranial infection rate decreased from 3.4% to 1.7%. Conclusions Cryopreservation of autologous skull at -80 ℃ is effective and can reduce the incidence of intracranial infection.

Key words： autogenous skull; cryopreservation; management plan; freezer rack; intracranial infection

作者單位：750001 銀川，寧夏醫科大學總醫院組織器官庫（趙芳，馬佳祥，趙丹，張慶，潘小亮）；寧夏回族自治區健康教育所（崔鵬）

通信作者：崔鵬

去骨瓣減壓術（decompressive craniectomy，DC）是神經外科常用的一種手術方式，隨著醫學科學的發展，顱骨修補術（cranioplasty，CP）的材料不斷更新改進，自體顱骨被認為是理想的修補材料^[1-2]。-80 ℃保存顱骨被認為是保存組織生物活性的有效方法，不僅對顱骨的生物力學性能損傷最小，而且仍保持著骨誘導能力。-80 ℃保存簡單、易操作、成本低，基層醫院易開展，但如何有效地在-80 ℃保存和管理自體顱骨是神經外科醫生長期面臨的挑戰。為此，本研究納入2016年1月—2021年12月于寧夏醫科大學總醫院神經外科行DC+自體顱骨回植術的325例患者，通過優化自體顱骨保存方法和管理流程，對自體顱骨冷凍保存方案進行探索性研究，最終優化了一套自體顱骨冷凍保存的管理方案，擬在寧夏地區及周邊省份的醫療單位進行推廣應用，為更多的病患減輕就醫負擔。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共納入325例行自體顱骨回植術患者，其中男232例（71.4%），女93例（28.6%）；年齡2～73歲，平均年齡43.6歲；自體顱骨冷凍保存（-80 ℃）時間20～390 d，平均保存時間122.9 d。年齡分組根據聯合國世界衛生組織提出的年齡新分段，未成年為0～17歲，青年人為18～65歲，中年人為66～79歲，老年人為80～99歲，長壽老人為100歲以上。行自體顱骨回植術至出院時間間隔，即回植術后平均住院時間為12.3 d。車禍傷及其他外傷占比較大，分別為32.3%和16.6%。雙側顱骨缺陷病例較少，主要以右側或者左側為主，二者比例相當。見表1。納入標準： （1）行DC并行自體顱骨回植術患者；（2）臨床資料完整，可追溯；（3）患者和家屬知情同意。排除標準：（1）選擇鈦網或其他材料行CP的患者；（2）行DC后，頭皮切口愈合不佳或合并感染；（3）回植術前頭顱計算機斷層掃描（computed tomography，CT）檢查提示顱內有器質性病變的患者；（4）回植術后顱內壓高于正常范圍或腦組織顯著膨出的患者；（5）合并有嚴重系統性疾病而無法耐受手術者；（6）存在精神異常或無手術意愿的患者。

1.2 方法

1.2.1 新管理方案保存方法 （1）顱骨瓣從患者身上取下之后，刮除骨膜；（2）生理鹽水沖洗兩遍；（3）用雙層抗低溫無菌袋包裝，并進行標記；（4）用4 ℃冷藏轉運箱轉運至深低溫保存室；（5）登記入庫信息，簽署知情同意；（6）確定存儲位置信息；（7）將顱骨放在指定格子內，并記錄；（8）24 h實時監控溫度變化情況；（9）需要回植時，登記出庫；（10）轉運箱轉運至手術室；（11）經過復溫、沖洗后行回植術。

1.2.2 新管理方案冰箱凍存架設置與管理 -80 ℃冰箱內設置專用的顱骨凍存架（圖1），架子的儲存區域按照月份進行分區，從上至下，第一層標記備用層；第二層5個架子從左往右分別標記為1～5月，第三層5個架子從左往右分別標記為6～10月，第四層2個架子從左往右分別標記為11月和12月。每一個架子共有3層，從上至下，分別編號為A、B、C；A、B、C三層每一層分別有5個格子；5個格子的順序從外向內，分別是1、2、3、4、5；于是每一個架子共有15個格子。最終形成如5-B-3的存儲位置編號，其中5代表的是5月份架子，B代表的是5月份架子的第二層，3代表的是5月份架子的第二層里的第3號格子。工作人員根據存放日期選擇相應月份的架子進行存儲。

1.2.3 舊管理方案 2019年之前，自體顱骨瓣從患者身上取下，刮除骨膜，用生理鹽水沖洗兩遍后；直接用雙層無菌一次性手套包裝，標記后置于-80 ℃冰箱；無凍存架。需要進行回植時，登記出庫，經過復溫、沖洗后行回植術。

1.2.4 分組 依據探索性保存方案使用之前和使用之后，將2019—2021年的數據分為新管理組。新管理組顱骨保存方案見圖2。將2016—2018年的數據分為舊管理組，舊管理組顱骨保存方法與新管理方案相比，直接用雙層無菌手套包裹后，置于-80 ℃冰箱，冰箱內無凍存架。

1.3 隨訪 選取行去顱骨瓣減壓術+自體顱骨回植術患者，簽署知情同意書后，將患者自體顱骨分別存放在-80 ℃冰箱，保存時間分別選取≤3個月、4～6個月、7～9個月、10～12個月、＞12個月。行回植術后，于術后3個月、6個月、1年進行隨訪，收集相關臨床數據對并發癥進行回顧性分析。

1.4 統計學分析 數據處理均采用SPSS 26.0軟件進行，正態分布的計量資料采用均數±標準差（x-±s）表示，使用獨立樣本t檢驗進行組間比較；計數資料以率（%）表示，組間比較采用 χ²檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 術后并發癥 不同顱骨回植術后并發癥發生率見表2，自體CP患者共325例，62例并發癥患者；鈦網修補術患者44例，7例并發癥患者，二者差異無統計學意義（P＞0.05）。自體CP患者中，有1例硬膜外血腫患者和2例硬膜下血腫患者，后期均采取保守治療。不同冷凍保存時間自體顱骨回植患者術后并發癥發生率見表3，不同顱骨保存時間回植后腦積水和其他并發癥（煩躁、失眠、易怒等）發生率差異有統計學意義（P＜0.05），顱骨保存時間低于6個月，回植后更易發生其他并發癥。

2.2 新管理方案和舊管理方案的對比分析 依據探索性保存方案使用之前和使用之后，將2016—2018年數據分為舊管理組，2019—2021年數據分為新管理組。舊管理組117例（50%），新管理組117例（50%）。對兩組患者病因發生率進行比較，發現近年來顱內腫瘤和腦梗的患者發生率增多，車禍傷發生率減少，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表4；兩組患者顱骨回植術后主要并發癥比較發現，經過新方案應用之后，顱內感染率由3.4%降低到1.7%，腦脊液漏發生率由0.9%降低到0%，腦積水的發生率由2.6%降低到0%，頭痛的發生率沒有發生變化。但是術后癲癇的發生率由3.4%升高到5.1%，差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。

3 討 論

DC是神經外科常用的一種手術方式，常見原因包括：創傷、感染、血管病變、腫瘤和先天畸形等^[3]，但需要隨后的手術來修復由此產生的骨缺損，稱為CP。CP的目的是恢復顱骨的完整性，為潛在的神經組織提供機械保護，改善美容效果，減輕社會心理因素的干擾，并恢復與氣壓變化相關的腦脊液動力學^[4-6]。目前可供選用的顱骨修補材料主要有自體顱骨、金屬材料（主要為鈦網）、各種高分子合成材料以及各種組織工程復合材料。但是，顱骨成形術最佳材料的選擇仍然存在爭議，因為無論選擇何種修補材料，都會使神經外科醫生面臨如何保持骨瓣生物活性、如何提高生物相容性、抗菌性能以及如何降低厚度和成本的長期挑戰^[7]，尤其是自體顱骨如何保存，如何降低回植后感染率。研究發現，使用自體移植骨瓣置換通常是減壓手術后顱骨成形術的第一個也是最常見的選擇，而且自體顱骨移植因其較低的感染率和成本以及可改善宿主免疫反應等優點，已被廣泛使用并被認為是黃金標準^[8]。

近年各臨床中心關于顱骨修補材料的研究證實，冷凍低溫保存自體顱骨原位回植是解決患者顱骨缺損的最佳選擇^[9]，目前-80 ℃保存是保存組織生物活性的有效方法。-80 ℃低溫能夠抑制引起組織破壞的膠原酶活性和降低抗原性，對骨組織的機械強度影響也較小，因此臨床采用-80 ℃保存自體顱骨時多未應用凍存保護劑^[10]，這與本研究的保存方案達成一致。但是，對于低溫冷凍保存自體顱骨原位回植后臨床效果如何，目前缺乏相關臨床數據支持。各種保存方法以及組織病理學的對比資料有限，且對于術后并發癥及影像學的資料不足，目前仍不能明確證實哪一種儲存條件最佳，亦無法確定哪一種更經濟實惠、方便易行，能使顱骨瓣保持體外活性的方法。而且，DC后如何有效管理和保存自體顱骨目前業內并沒有達成統一共識，因此迫切需要一個冷凍保存機構，在不影響安全性的情況下提供具有較高臨床標準和指南的管理體系。

針對以上存在的問題，本研究探索了一種自體顱骨冷凍保存方案，包括保存溫度、保存時間、保存方法以及管理流程。關于保存溫度的研究顯示，外植顱骨瓣的冷凍保存模式長期以來一直是一個值得爭論的問題，特別是適當的儲存溫度。選擇自體骨在皮下儲存還是冷凍儲存的研究中，Dowlati等^[11]研究發現，與合成皮瓣相比，自體骨皮瓣可能是一種經濟有效的選擇，但當保存在腹部組織中時，隨著時間的推移，它們會增加腹部部位并發癥、再次手術和吸收的風險。Rosinski等^[12]首選冷凍儲存，但據Agrawal等^[13]研究顯示，迄今為止還沒有研究比較過在同一機構以不同程度冷凍保存的用于神經外科的顱骨皮瓣的微生物特征和感染潛力。在Agrawal等^[13]的研究中，由于樣本量的限制，未能識別儲存在-23 ℃或-80 ℃ 下顱骨瓣的不同感染行為。所以，未來仍需要進行大型前瞻性研究來進一步闡明這一結論。車東方等^[14]研究顯示，深低溫（-80 ℃）保存自體CP感染率低，能夠避免或推遲進行人工材料二次修補。李斌等^[15]的研究顯示，于DC后12周內（-80 ℃保存時間＜3個月）接受顱骨瓣修補術的并發癥總發生率低于12周后（-80 ℃保存時間＞3個月）的發生率。Chan等^[16]發現，冷凍超過4個月的顱骨瓣沒有成骨細胞存活，而且骨瓣細菌污染率為27.8%。本研究顯示，自體顱骨冷凍保存平均時間122.9 d，感染率為1.7%。Mirabet等^[17]發現，將自體顱骨儲存在-80 ℃～-70 ℃的比例為69.6%，儲存前刮除骨膜的比例為31.2%，不使用冷凍保護劑的比例為95.8%，在室溫下解凍的比例為79.1%。本研究的儲存方法是刮除骨膜，生理鹽水沖洗兩遍，雙層無菌袋包裝后置于-80 ℃冰箱保存。本研究發現，經過新方案應用之后，顱內感染率由3.4%降低到1.7%，腦脊液漏發生率由0.9%降低到0%，腦積水的發生率由2.6%降低到0%，頭痛的發生率沒有發生變化。如何降低自體顱骨回植后感染率及并發癥，對于臨床醫生一直是一個挑戰。而且，Sahoo等^[18]研究發現，任何重建術的并發癥都是多因素的，顱骨成形術的并發癥廣泛歸因于最初基礎病理的性質、重建材料的類型以及顱骨成形術手術的技術。近年來，對于自體顱骨的保存方法的探索報道很少。陳小川等^[19]提供了一種自體顱骨深低溫保存方法，通過改變骨組織的包裝介質（納米羥基磷灰石聚乙烯醇凝膠），來降低骨組織因感染而廢棄的情況，同時能夠提高植入后的成骨效果。林衛軍等^[20]將顱骨瓣進行超聲波清洗后進行真空包裝，然后用放射性元素（鈷60的輻照劑量為20 kGy～25 kGy）對真空包裝的顱骨瓣進行輻照滅菌，之后放入溫度為-80～-40 ℃的環境下保存即可。該方法雖然對細胞有破壞，但蛋白活性未被滅，骨引導物活性存在，與高壓高溫消毒比較有明顯優點。Melin等^[21]的研究顯示，在冷凍保存前，使用脈沖灌洗的方法處理骨瓣，可有效降低細菌培養陽性率，且不增加顱骨成形術后SSI感染頻率。

綜上，經過不斷優化和改良，本研究已制定專用的顱骨凍存架和相應的管理流程，其不僅可以隔絕外界環境對顱骨的污染，而且可以準確快速定位，杜絕查找時出現差錯，降低存取操作對其他顱骨溫度的影響。另外，新保存方案和管理流程應用之后，顱內感染率由3.4%降低到1.7%，這說明本研究的保存方案是可行的。本研究會進一步優化自體顱骨保存方法（-80 ℃和-196 ℃）和相對應的管理流程，并通過臨床病案調查和電話隨訪調查研究、實驗室研究、影像學檢查等對創新管理保存方案應用之前和應用之后的數據進行回植效果評價研究。最終的目標是優化一套標準的自體顱骨冷凍保存的管理方案及流程，在寧夏地區乃至周邊省份的縣級醫療單位進行推廣應用，為更多的病患減輕就醫負擔。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：趙芳負責論文的整體實施、包括研究設計、數據收集、整理和分析以及論文的撰寫和修改；馬佳祥主要負責凍存架的設計和協助隨訪數據的收集；趙丹、張慶主要協助隨訪數據的收集、整理；潘小亮主要協助管理流程的制定和隨訪數據的收集；崔鵬主要負責研究設計和數據分析以及論文修改。

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（收稿2023-07-19 修回2023-08-02）