PLOD1 在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞中的表達及其意義

［摘 要］ 目的：探討前膠原賴氨酸，2-酮戊二酸 5-雙加氧酶 1 （PLOD1） 在口腔鱗狀細胞癌（OSCC） 組織和細胞中的表達及其對OSCC 細胞生物學行為的影響，闡明PLOD1 作為OSCC 預后標志物的潛力。方法：采用腫瘤免疫評價資源 （TIMER） 數據庫、基因表達譜交互分析 （GEPIA） 數據庫和Kaplan-Meier Plotter 數據庫分析頭頸部鱗狀細胞癌（HNSC） 組織中PLOD1 mRMA 表達水平及其與HNSC 患者生存期的關聯。免疫組織化學法檢測110 例OSCC 組織和64 例癌旁組織中PLOD1蛋白表達情況，分析其與OSCC 患者臨床病理特征和預后的關系。采用受試者工作特征（ROC） 曲線下面積（AUC） 評估PLOD1 在OSCC 診斷中的價值。實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法和Westernblotting 法檢測人正常口腔上皮HOK 細胞和OSCC SCC15 和CAL27 細胞中PLOD1 mRNA 和蛋白表達水平。利用脂質體法將小干擾RNA （siRNA） 片段轉染至SCC15 細胞，分為si-NC 組（轉染陰性對照si-NC） 和si-PLOD1 組（轉染si-PLOD1），采用CCK-8 法、細胞劃痕愈合實驗和Transwell 小室實驗分別檢測 2組細胞增殖活性、劃痕愈合率和侵襲細胞數。結果：公共數據庫分析，HNSC 組織中PLOD1 mRNA 表達水平高于癌旁組織（Plt;0. 05）； 與 PLOD1 低表達組比較， PLOD1 高表達組HNSC 患者生存期較短（HR=1. 41， P=0. 018）。PLOD1 蛋白主要表達于 OSCC 細胞的細胞質中，OSCC 組織中PLOD1 表達強度高于癌旁組織（Plt;0. 01），并與 OSCC 患者 T 分期和 TNM 分期有關（P=0. 021， P=0. 004）。PLOD1 診斷 OSCC 的 AUC 為 0. 811， 特異度和靈敏度分別 63. 64% 和90. 63%。Kaplan-Meier 生存分析，與PLOD1 低表達組比較，PLOD1 高表達組OSCC 患者生存率降低（Plt;0. 01）；COX 回歸分析，PLOD1 高表達是影響OSCC 預后的獨立危險因素（P=0. 012）。OSCC細胞中PLOD1 mRNA 和蛋白表達水平高于HOK 細胞（Plt;0. 05）。與si-NC 組比較，si-PLOD1 組細胞增殖活性和劃痕愈合率降低 （Plt;0. 05），侵襲細胞數減少 （Plt;0. 01）。結論：PLOD1在OSCC組織和細胞中高表達，沉默PLOD1 表達可抑制OSCC 細胞增殖、遷移和侵襲。PLOD1 可能是OSCC 新的治療靶點和預后標志物。

［關鍵詞］ 口腔鱗狀細胞癌； 前膠原賴氨酸，2-酮戊二酸5-雙加氧酶1； 細胞增殖； 細胞侵襲； 預后

［中圖分類號］ R739. 8 ［文獻標志碼］ A

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cellcarcinoma，OSCC） 約占頭頸部腫瘤的90%，盡管近年來綜合治療（手術、放療、化療和分子靶向治療） 取得重大進展，但由于早期診斷和預后指標的不足， OSCC 患者5 年生存率僅為55% ［1-3］。因此尋找新的有效的OSCC 生物標志物和治療靶點具有重要意義。前膠原賴氨酸，2-酮戊二酸5-雙加氧酶（procollagen-lysine， 2-oxoglutarate 5-dioxygenase，PLOD） 1 是負責賴氨酸羥化的PLOD 蛋白家族成員之一，位于染色體1p36. 2-36. 3 上，作為端肽賴氨酸羥化酶， PLOD1 對分子間沉積和交聯的穩定性具有重要作用［4］。 PLOD1 基因突變可導致Ehlers-Danlos 綜合征［5］。近年來，許多研究［6-8］ 報道了PLOD1 在多種實體腫瘤中具有促進腫瘤進展的作用，但在OSCC 發生發展中的作用尚不明確。本研究首先基于生物信息學方法初步預測PLOD1在頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cellcarcinoma，HNSC） 中的表達情況及其與HNSC 患者預后的關系， 進一步利用免疫組織化學法、Western blotting 法和實時熒光定量PCR （real-timefluorcesence quantitative PCR， RT-qPCR） 法分析PLOD1 在OSCC 組織和細胞中的表達情況， 評估其診斷和預后價值，同時利用細胞表型實驗檢測其對OSCC 細胞增殖、遷移和侵襲的影響， 為尋找OSCC 新的有效的治療靶點和預后標志物提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 細胞、主要試劑和儀器

人正常口腔角質HOK 細胞購自河北北納生物科技有限公司，OSCC SCC15 和CAL27 細胞購自美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。免疫組織化學試劑盒和 PLOD1 多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，β-actin 單克隆抗體、HRP-羊抗鼠抗體和HRP-羊抗兔抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，PLOD1 引物序列購自生工生物工程（上海） 股份有限公司，PLOD1- 小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA） 序列（si-PLOD1） 及陰性對照序列（si-NC） 購自上海吉瑪制藥技術有限公司。細胞培養箱、超凈工作臺和?80℃冰箱購于美國賽默飛世爾科技有限公司，電泳儀、濕轉轉膜儀和多功能酶標儀購于美國Bio-rad 公司，熒光定量PCR 儀購于美國Agilent 公司。

1. 2 組織標本來源

收集石河子大學第一附屬醫院2008—2020 年確診為原發性OSCC 的石蠟標本，獲得 110 例 OSCC 組織標本和64 例癌旁組織（距離癌組織 2 cm 以上）， 參照美國癌癥聯合會（American Joint Committee on Cancer， AJCC） 標準第8 版對OSCC 患者進行TNM 分期。收集OSCC 患者臨床病理特征參數，包括年齡、性別、分化程度、淋巴結轉移和TNM 分期等。后期通過醫院病歷、電話或其他方法進行隨訪（至2023 年7 月或死亡日期）。本研究經石河子大學第一附屬醫院倫理委員會批準（編號：KJX2022-072-01）。

1. 3 生物信息學方法分析 HNSC 組織中 PLOD1mRNA 表 達 水 平

采 用 腫 瘤 免 疫 評 價 資 源（Tumor Immune Estimation Resource， TIMER）數據庫和基因表達譜交互分析（Gene ExpressionProfiling Interactive Analysis，GEPIA） 數據庫分析HNSC 組織和正常組織中PLOD1 mRNA 表達水平， 采用Kaplan-Meier Plotter 數據庫評估PLOD1表達與HNSC 患者預后的關系。

TIMER數據庫［9］（https：//cistrome. shinyapps.io/timer/） 主要用于系統分析不同類型癌癥的免疫浸潤情況，并通過Wilcoxon 檢驗進行統計學分析。GEPIA 數據庫［10］（http：//gepia. cancer-pku. cn/）是一種新的交互式網絡服務器， 使用標準處理流程分析來自 TCGA 和 GTEx 項目的 9 736 個腫瘤樣本和 8 587 個正常樣本的 RNA 測序表達數據。Kaplan-Meier Plotter 數據庫［11］ （https：//kmplot.com/analysis/） 用于分析基因表達與患者存活率之間的相關性，通過Cox 比例風險回歸和錯誤發現率發現和驗證新的生存生物標志物。

1. 4 免疫組織化學染色檢測OSCC組織中PLOD1蛋白表達強度

所有組織標本經病理科切片后低溫保存，切片經EnVision 兩步法進行染色。由2 名高年資的病理科醫師采用雙盲法對染色結果進行評定。染色強度：0 分（無著色），1 分（黃色），2 分（淺褐色）， 3 分（深褐色）； 陽性細胞范圍： 1 分（陽性細胞范圍0%～25%）， 2 分（陽性細胞范圍26%～50%）， 3 分（陽性細胞范圍51%～75%），4 分（陽性細胞范圍76%～100%）。結果判定：表達強度= 陽性細胞范圍× 染色強度， 其中0～1 分為陰性（－），2～4 分為弱陽性（+），5～7 分為陽性（++）， 8～12 分為強陽性（+++）；“ － ” 和“ + ” 為低表達組，“ ++ ” 和“ +++ ” 為高表達組。 根據 PLOD1 表達強度得分，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC） 曲線并計算ROC 曲線下面積（area under curve，AUC），評估PLOD1 在OSCC 診斷中的價值。

1. 5 細胞培養和轉染

所有細胞在含1%青-鏈霉素和10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養基中，置于37 ℃ 、5% CO2 細胞培養箱中靜置培養。按每孔5×104 個細胞的密度將 SCC15 細胞鋪于 6 孔細胞培養板中， 待細胞融合度達到 70%～80% 時進行轉染。 實驗分為 si-NC 組和 si-PLOD1 組， 按照LipofectamineTM 2000 轉染試劑盒說明分別轉染si-NC 和si-PLOD1， 培養24 h 后采用RT-qPCR 法和Western blotting 法檢測轉染效果，并收集細胞用于后續實驗。

1. 6 RT-qPCR 法 檢 測 OSCC 細 胞 中 PLOD1mRNA表達水平

采用 TRIzol法提取各組細胞中總RNA， 利用逆轉錄試劑盒將 RNA 逆轉錄為cDNA，采用 RT-qPCR 試劑盒進行 mRNA 定量分析。引物序列： PLOD1， 正向引物5'-GTCCTGGTCGGCGTGTTCATC-3'，反向引物5'- TTGTGGTGCTGCTCGTGGTTG-3'； β-actin， 正向引物5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'， 反向引物5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'。反應條件：95 ℃、120 s；95 ℃、5 s，60 ℃、35 s，40 個循環。以 β-actin 為內參基因，采用2-△△Ct 法計算各組細胞中PLOD1 mRNA 表達水平。

1. 7 Western blotting法檢測OSCC細胞中PLOD1蛋白表達水平

提取各組細胞中總蛋白，定量后進行SDS-PAGE 電泳轉膜， 5% BSA 室溫封閉1 h，分別滴加PLOD1 抗體（1∶ 3 000） 和β-actin 抗體（1∶ 5 000） ４℃ 孵育過夜， 加入HRP 標記的IgG抗體（1∶20 000） 室溫孵育2 h，ECL 化學發光儀顯色拍照， 以β-actin 作為內參蛋白， 采用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1. 8 CCK-8法檢測2組SCC15細胞增殖活性

細胞分組見“1. 5”。轉染24 h 后， 胰酶消化2 組細胞，以每孔5 000 個細胞的密度接種于96 孔培養板中，繼續常規培養3 d，每隔24 h （即種板后的第0、1、2 和3 天） 取出后避光加入10 μL CCK-8 溶液。采用酶標儀檢測2 組細胞在450 nm 波長處吸光度（A） 值，以A 值代表各組細胞增殖活性。每組設置5 個復孔，實驗重復3 次。

1. 9 細胞劃痕愈合實驗檢測2組SCC15細胞劃痕愈合率

細胞分組見“1. 5”。 轉染 24 h后，細胞單層鋪滿孔底時，用100 μL 移液器槍頭劃3 條平行線，PBS 緩沖液清洗3 次，在0、24 和48 h 時間點觀測并拍照相同劃痕位置。采用Image J 軟件分析劃痕面積并計算劃痕愈合率，以劃痕愈合率代表細胞遷移能力。細胞劃痕愈合率= （0 h 劃痕面積?24 h 或48 h 劃痕面積） /0 h 劃痕面積×100%。

1. 10 Transwell小室實驗檢測 2組 SCC15細胞中侵襲細胞數

細胞分組見“1. 5”。收集轉染后2組細胞，制備單細胞懸液并調整細胞密度為5×10 4 mL-1。上室加入60 μL 稀釋基質膠后置于37 °C 培養箱中培養2 h，使基質膠完全凝固；吸棄上室中殘余液體， 并加入100 μL 無血清培養基， 培養箱中靜置水化30 min； 上室棄去殘液后加入200 μL 細胞懸液， 下室加入600 μL 完全培養基， 置于細胞培養箱中培養36 h， 冰甲醇固定20 min， 結晶紫染色10 min， 流動水沖洗， 棉簽擦凈上室內細胞及染料。隨機選取3 個以上視野，顯微鏡下觀察拍照并計數侵襲細胞。

1. 11 統計學分析

采用 GraphPad Prism 9. 5 和SPSS 26. 0 統計軟件進行統計學分析。OSCC 組織和癌旁組織中PLOD1 蛋白表達強度比較采用Fisher’s 確切概率法；不同臨床病理特征OSCC 患者癌組織中PLOD1 蛋白表達強度比較采用χ2檢驗。按照隨訪信息中患者是否存活進行二分類（0 為死亡，1 為存活），采用Kaplan-Meier 法（Log-rank檢驗） 進行生存分析，對影響預后的因素進行COX 回歸分析。各組細胞中PLOD1 mRNA 和蛋白表達水平、細胞增殖活性、劃痕愈合率及侵襲細胞數均符合正態分布，以-x±s 表示，2 組間樣本均數比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt; 0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 生 物 信 息 學 方 法 分 析 結 果

TIMER 和GEPIA 數據庫均顯示： HNSC 組織中PLOD1mRNA 表達水平明顯高于癌旁組織（Plt;0. 05）；生存分析結果顯示： 與PLOD1 低表達組比較，PLOD1 高表達組HNSC 患者生存期較短（HR=1. 41，P=0. 018）。見圖1。

2. 2 OSCC患者癌旁組織和癌組織中PLOD1蛋白表達強度

免疫組織化學染色結果顯示：PLOD1蛋白主要分布于細胞質，其在癌旁組織中多為低表達，而在OSCC 組織中多呈高表達。見圖2。與癌旁組織比較， OSCC 患者癌組織中PLOD1 蛋白表達強度升高（Plt;0. 01）。見表1。癌旁組織和OSCC患者癌組織PLOD1 蛋白表達評分等級比較差異有統計學意義（Plt;0. 01）。見表2。

2. 3 不 同 臨 床 病 理 特 征 OSCC 患 者 癌 組 織 中PLOD1 蛋白表達強度

PLOD1 蛋白表達強度與OSCC 患者不同T 分期和TNM 分期有關聯（P=0. 021， P=0. 004）， 與患者年齡、性別、分化程度和淋巴結轉移無關聯（Pgt;0. 05）。見表3。

2. 4 ROC曲線評估 PLOD1在 OSCC診斷中的價值

ROC 曲線顯示： AUC 值為0. 811 （95% CI：0. 750～0. 873）， 采用 PLOD1 臨界值診斷 OSCC的特異度和靈敏度分別為 63. 64% 和 90. 63%。見圖3A。

2. 5 Kaplan-Meier生存曲線評估PLOD1在OSCC預后評價中的價值

Kaplan-Meier生存曲線顯示：與PLOD1 低表達組比較，PLOD1 高表達組患者生存率降低（Plt;0. 01）。見圖3B。單因素和多因素COX 回歸分析顯示： PLOD1 高表達（HR=10383. 695，P=0. 012） 可作為OSCC 患者預后的獨立危險因素。見表4。危險因素。見表4。

2. 6 不同細胞中 PLOD1 mRNA 和蛋白表達水平

RT-qPCR 法檢測結果顯示： 與HOK 細胞（1. 00±0. 14） 比較，SCC15 細胞和CAL27 細胞中PLOD1 mRNA 表達水平（2. 60±0. 24 和2. 11±0. 22） 升高（Plt;0. 01）。Western blotting 法檢測結果顯示： 與HOK 細胞（1. 00±0. 03） 比較，SCC15 細胞和CAL27 細胞中PLOD1 蛋白表達水平（1. 58±0. 20 和1. 57±0. 23） 升高（Plt;0. 05）。見圖4。

2. 7 SCC15細胞中si-PLOD1轉染效果

RT-qPCR法和Western blotting 法檢測，與si-NC 組（1. 00±0. 25 和1. 00±0. 03） 比較，si-PLOD1 組SCC15 細胞中PLOD1 mRNA 和蛋白表達水平（0. 15±0. 01和0. 45±0. 02） 降低（Plt;0. 01）， 表明si-PLOD1轉染成功。見圖5。

2. 8 2 組 SCC15 細胞增殖活性

CCK-8 作用 24、48 和72 h 后， 與si-NC 組比較， si-PLOD1 組細胞增殖活性明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖6。

2. 9 2組 SCC15細胞劃痕愈合率

劃痕 24和 48 h后， 與si-NC 組（55. 49%±0. 57% 和89. 91%±2. 77%） 比較，si-PLOD1 組SCC15 細胞劃痕愈合率（28. 75%±2. 80% 和74. 87%±1. 39%） 降低（Plt;0. 01）。見圖7。

2. 10 2組 SCC15細胞中侵襲細胞數

與 si-NC組（230. 00 個±14. 12 個） 比較，si-PLOD1 組細胞中侵襲細胞數（121. 60 個±17. 44 個） 減少（Plt;0. 01）。見圖8。

3 討 論

PLOD1 異常表達改變了細胞外基質中膠原纖維的形態， 有助于形成腫瘤轉移的“ 高速公路”。此外， PLOD1 可驅動腫瘤發生和血管生成， 為癌細胞的增殖、遷移和侵襲提供了必要的生化和物理支持［12-14］。目前，已有研究［8，15］ 證實： PLOD1 在多種惡性腫瘤中異常表達且與腫瘤進展有密切關聯；PLOD1 在小鼠的卵巢癌組織中表達上調；在胰腺癌組織中PLOD1 高表達，并與胰腺癌患者的T 分期、組織學和病理學分級有密切關聯。本研究基于公共數據庫初步探索顯示： PLOD1 在HNSC組織中高表達， 是HNSC 患者預后不良的危險因素，而HNSC 中OSCC 占90%，因此推測PLOD1在OSCC 組織中同樣呈現高表達。在此基礎上，本研究中免疫組織化學方法檢測結果顯示： PLOD1蛋白在OSCC 組織中高表達， 其蛋白表達強度與OSCC 患者T 分期和TNM 分期有關聯， 提示PLOD1 高表達與OSCC 患者較高的腫瘤侵襲性有關。一般認為當AUCgt;0. 5 時就具有一定診斷預測能力，本研究中ROC 曲線分析結果顯示：AUC 值為0. 811，PLOD1 對OSCC 患者具有良好的診斷效力；生存分析顯示： PLOD1 高表達患者生存率更低，提示預后不佳。CHEN 等［16］ 研究發現：膀胱癌組織中 PLOD1 表達水平越高，膀胱癌患者的生存率越低。本研究中 COX 多因素回歸分析顯示：PLOD1 表達是 OSCC 患者獨立預后指標，進一步證明 PLOD1 與 OSCC 患者預后有關聯。同時，本研究結果顯示：在OSCC 細胞中 PLOD1 mRNA 和蛋白表達水平均升高，以上結果與既往研究結果和生物信息學分析結果相一致，充分證實PLOD1 高表達可能是促進OSCC 進展的重要因素， 可作為OSCC 診斷和預后判斷的新指標。

增殖、轉移和侵襲是腫瘤惡變的重要特征，其過程受多種機制的調控［17］。已有研究［18］ 證實：低氧誘導因子1 （hypoxia inducible factor-1，HIF-1） 可激活膠質瘤細胞中PLOD1轉錄，進而上調PLOD1的表達，增加腫瘤細胞的遷移能力。YAMADA 等［19］發現：miR-140-5p 可直接調控膀胱癌細胞中PLOD1的表達，PLOD1 抑制劑可明顯降低膀胱癌細胞的惡性表型。為進一步分析PLOD1 對OSCC 細胞生物學行為的影響，本研究利用siRNA 技術沉默SCC15細胞中PLOD1 的表達后發現： 轉染si-PLOD1 后SCC15 細胞增殖能力減弱，遷移和侵襲能力下降。本研究結果與XU 等［20］ 有關腎細胞癌的研究結果一致， 提示敲低PLOD1 的表達， 可以降低OSCC細胞的惡性表型， 間接表明 PLOD1 可能作為促癌基因參與OSCC 的發展，靶向PLOD1 是一種潛在的治療策略，但其具體分子機制仍有待進一步研究。

研究［21-23］ 證實：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B，PI3K/AKT） 信號通路在癌癥（包括OSCC） 中普遍存在過度激活，其通過一系列信號調節細胞的生長、分化、存活、代謝和細胞骨架重組。研究［24］結果顯示：PLOD1 可以通過激活PI3K/Akt 信號傳導促進胃癌細胞的增殖和轉移， 推測本研究中OSCC 細胞增殖、遷移和侵襲能力的降低可能與PI3K/AKT 通路受到抑制有關。

綜上所述， PLOD1 在OSCC 組織和細胞中高表達，與OSCC 患者預后不良有關，是OSCC 患者獨立預后指標。沉默PLOD1 能抑制OSCC 細胞的增殖、遷移和侵襲， PLOD1 可能是OSCC 潛在的治療靶點和預后標志物。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：

郭超杰參與論文選題、實驗設計、數據整理和論文撰寫，張佳佳和曾潔參與數據收集，王暉予和艾爾法提·艾麥爾參與數據整理和分析，徐江參與論文審校。

[參考文獻]

［1］ BUGSHAN A， FAROOQ I. Oral squamous cellcarcinoma： metastasis， potentially associated malignantdisorders， etiology and recent advancements indiagnosis［J］. F1000Res， 2020， 9： 229.

［2］ AUPéRIN A. Epidemiology of head and neck cancers：an update［J］. Curr Opin Oncol， 2020， 32（3）： 178-186.

［3］ SUNG H， FERLAY J， SIEGEL R L， et al. Globalcancer statistics 2020： GLOBOCAN estimates ofincidence and mortality worldwide for 36 cancers in185 countries［J］. CA Cancer J Clin， 2021， 71（3）：209-249.

［4］ QI Y F， XU R. Roles of PLODs in collagen synthesisand cancer progression［J］. Front Cell Dev Biol， 2018，6： 66.

［5］ FOY M， MéTAY C， FRANK M， et al. A severe caseof PLOD1-related kyphoscoliotic Ehlers-Danlossyndrome associated with several arterial and venouscomplications： a case report［J］. Clin Case Rep， 2023，11（2）： e6760.

［6］ QI Q， HUANG W H， ZHANG H， et al. Bioinformaticanalysis of PLOD family member expression andprognostic value in non-small cell lung cancer［J］. TranslCancer Res， 2021， 10（6）： 2707-2724.

［7］ 何 平， 何成彥， 鄭 巖， 等. PLOD1在結直腸癌組織中的表達及意義［J］. 中國實驗診斷學， 2023， 27（3）：273-275.

［8］ ZHANG J， TIAN Y Z， MO S J， etal. OverexpressingPLOD family genes predict poor prognosis in pancreaticcancer［J］. Int J Gen Med， 2022， 15： 3077-3096.

［9］ LI T， FAN J， WANG B， et al. TIMER： a web serverfor comprehensive analysis of tumor-infiltrating immunecells［J］. Cancer Res， 2017， 77（21）： e108-e110.

［10］LI C W， TANG Z F， ZHANG W J， et al.GEPIA2021： integrating multiple deconvolution-basedanalysis into GEPIA［J］. Nucleic Acids Res， 2021，49（W1）： W242-W246.

［11］NAGY á， MUNKáCSY G， GY?RFFY B. Pancancersurvival analysis of cancer hallmark genes［J］. Sci Rep，2021， 11（1）： 6047.

［12］CHEN Y L， GUO H F， TERAJIMA M， et al. Lysylhydroxylase 2 is secreted by tumor cells and can modifycollagen in the extracellular space［J］. J Biol Chem，2016， 291（50）： 25799-25808.

［13］SUN Y W， WANG S， ZHANG X W， et al.Identification and validation of PLOD2 as an adverseprognostic biomarker for oral squamous cellcarcinoma［J］. Biomolecules， 2021， 11（12）： 1842.

［14］鄺新紅， 衛曉慧， 孫 立， 等. 膠原翻譯后修飾酶與腫瘤關系的研究進展［J］. 腫瘤防治研究， 2016， 43（12）：1085-1089.

［15］GUO T， GU C， LI B， et al. PLODs are overexpressedin ovarian cancer and are associated with gap junctionsvia connexin 43［J］. Lab Invest， 2021， 101（5）： 564-569.

［16］CHEN R， JIANG M， HU B， et al. Comprehensiveanalysis of the expression， prognosis， and biologicalsignificance of PLOD family in bladder cancer［J］. Int JGen Med， 2023， 16： 707-722.

［17］田堰鑫， 李 娜， 高 雷， 等. 腫瘤微環境與肝癌干細胞相互作用對肝細胞癌發生發展的影響［J］. 臨床肝膽病雜志， 2023， 39（3）： 684-692.

［18］WANG Z L， SHI Y P， YING C T， et al. HypoxiainducedPLOD1 overexpression contributes to themalignant phenotype of glioblastoma via NF-κBsignaling［J］. Oncogene， 2021， 40（8）： 1458-1475.

［19］YAMADA Y， KATO M， ARAI T， et al. Aberrantlyexpressed PLOD1 promotes cancer aggressiveness inbladder cancer： a potential prognostic marker andtherapeutic target［J］. Mol Oncol， 2019， 13（9）： 1898-1912.

［20］XU F S， GUAN Y B， XUE L， et al. The effect of anovel glycolysis-related gene signature on progression，prognosis and immune microenvironment of renal cellcarcinoma［J］. BMC Cancer， 2020， 20（1）： 1207.

［21］NOOROLYAI S， SHAJARI N， BAGHBANI E， et al.The relation between PI3K/AKT signalling pathway andcancer［J］. Gene， 2019， 698： 120-128.

［22］AOKI M， FUJISHITA T. Oncogenic roles of thePI3K/AKT/mTOR axis ［J］. Curr Top MicrobiolImmunol， 2017， 407： 153-189.

［23］符良斌， 廖天安， 王 鴻， 等. TGF-β1對人舌鱗狀細胞癌上皮-間質轉化的誘導作用及其對PI3K/AKT信號通路的影響［J］. 吉林大學學報（醫學版）， 2015， 41（4）：790-793.

［24］ZHANG Y X， WU Y J， SU X B. PLOD1 promotes cellgrowth and aerobic glycolysis by regulating the SOX9/PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in gastriccancer［J］. Front Biosci， 2021， 26（8）： 322-334.

[基金項目] 國家自然科學基金項目（82160572）