lncRNA H19 和IGF2 基因在乳腺癌組織中的表達水平及印記狀態

［摘 要］ 目的：研究長鏈非編碼 RNA （lncRNA） H19和胰島素樣生長因子 2（IGF2） 基因在乳腺癌組織中的表達水平，分析其印記狀態。方法：采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 法檢測乳腺癌組織及癌旁組織中H19 和IGF2 mRNA 表達水平，分析H19 和IGF2 mRNA 在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達差異，利用單核苷酸多態性（SNP） 區分等位基因表達情況（純合或雜合），基因組DNA中IGF2 （ApaⅠ位點） 或H19 （AluⅠ位點） 為雜合則進行印記分析，確定H19 和IGF2 在乳腺癌組織中的印記狀態，即印記保持（MOI） 或印記丟失（LOI）。分析乳腺癌組織中H19 和IGF2 表達與分子分型的關系。結果：RT-qPCR 法檢測，乳腺癌組織中 H19和 IGF2 mRNA 表達水平高于癌旁組織（Plt;0. 01），H19 mRNA 表達水平與IGF2 mRNA 表達水平呈正相關關系（r=0. 567，Plt;0. 01）。不同分子分型乳腺癌患者癌組織中H19 mRNA 表達水平均高于癌旁組織（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。H19 和IGF2 在乳腺癌組織中均存在LOI，IGF2 的LOI 發生率為36. 7%，高于H19 的LOI 發生率（4. 3%）。RT-qPCR 法檢測， IGF2 LOI 組乳腺癌組織中IGF2 mRNA 表達水平明顯高于IGF2 MOI 組（Plt;0. 01）。結論：乳腺癌組織中H19和IGF2 mRNA表達水平明顯高于癌旁組織，IGF2的LOI發生率高于H19 的LOI 發生率，IGF2 的LOI 可能是乳腺癌發病的關鍵因素之一。

［關鍵詞］ 乳腺腫瘤； 長鏈非編碼RNA； H19； 胰島素樣生長因子2； 印記丟失； 單核苷酸多態性

［中圖分類號］ R737. 9 ［文獻標志碼］ Ａ

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，同時也是女性因癌癥死亡的主要原因［1］。盡管個體化靶向治療和分子生物學技術的進步已經使部分乳腺癌患者的生存期得到延長， 但其復發率和死亡率仍高居不下［2］，主要是因為乳腺癌表現出高異質性，其轉移和對化療的耐藥性仍是目前治療的主要難題。

基因印記是一種重要的表觀遺傳調控機制［3］。印記基因是僅一方親本來源的同源基因表達，而來自另一親本的同源基因不表達的一種基因。印記基因的雙等位基因表達即印記丟失（loss ofimprinting，LOI） 在多種惡性腫瘤中存在，長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA） H19 和胰島素樣生長因子2 （insulin-like growth factor 2， IGF2）是最早被研究的印記基因，二者位于 11 號染色體p15. 5 的同一印記結構域內， 受印記控制區（imprinting control region， ICR） 的調控， 并共同受H19 下游的增強子調節。lncRNA H19 為母源等位基因表達，IGF2 為父源等位基因表達［4-5］。H19和IGF2 交互印記，其適度的表達在生長發育過程中的多個信號通路中發揮作用，且在腫瘤中的印記狀態呈現多樣性。研究［6］ 表明： H19 啟動子可被轉錄因子E2F1 激活，加速乳腺癌細胞周期進展并進入S 期，促進癌細胞增殖和腫瘤的發生。但關于H19 在乳腺癌中是促癌還是抑癌的作用目前尚存爭議。研究［7］ 顯示：IGF2 LOI 引起雙等位基因表達，參與腫瘤的發生并加速腫瘤的進展，IGF2 過表達既可以阻止細胞凋亡，也能促進細胞的增殖。在乳腺癌組織中H19 和IGF2 的表達情況與基因印記是否具有相關性，基因印記在乳腺癌中是否具有潛在聯系，尚有待進一步探討。本研究通過實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 法檢測乳腺癌組織中H19 和IGF2mRNA 表達水平，分析IGF2 （ApaⅠ位點） 和H19（AluⅠ位點） 的印記狀態及其潛在關聯。

1 資料與方法

1. 1 臨床資料

收集 2017年 1月—2019年 6月于吉林大學第一醫院乳腺外科行乳腺癌改良根治術和單純乳房切除術191 例患者的組織樣本，所有樣本均經病理學檢查明確診斷為乳腺癌。分子分型：管腔A/B 型（Luminal 型） 100 例， 即雌激素受體（estrogen receptor， ER） 和孕激素受體（progesterone receptor，PR） 均陽性；人表皮生長因子受體2 （human epithelial growth factor receptor 2，HER2） 陽性型48 例； 三陰性乳腺癌43 例， 即ER、PR 和HER2 均陰性。癌組織及癌旁組織均由病理學專家認定。191 例患者均為女性，平均年齡52. 5 歲（30～85 歲）， 其中浸潤性導管癌174 例，浸潤性小葉癌3 例，其他類型癌13 例，浸潤性混合癌1 例。納入標準：①患者均經病理檢查確診為乳腺癌；②患者的病歷和病理資料均齊全；③患者術前未經激素治療、放療和化療等。排除標準：①并發其他惡性腫瘤者；②并發精神障礙者；③妊娠或哺乳期女性。本研究經吉林大學第一醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1. 2 主要試劑和儀器

細胞/組織基因組 DNA提取試劑和細胞總RNA 提取試劑（美國ThermoFisher 公 司）， Fast start Universal SYBR GreenMaster 試劑盒（瑞士Roche 公司）， 逆轉錄試劑盒（美 國 Invitrogen 公 司）。 PCR 擴 增 儀（美 國Perkin-Elmer 公 司），凝 膠 成 像 分 析 系 統（美 國Bio-Rad 公司）。

1. 3 乳腺癌組織和癌旁組織中DNA的提取

按照細胞/組織基因組DNA 提取試劑說明書中的步驟，從乳腺組織和癌旁組織中提取患者全基因組DNA。在液氮中將組織研磨成粉末狀，將50 mg 組織轉移至1. 5 mL 離心管中，加入0. 6 mL dBIOZOL 試劑，充分混勻，室溫放置10 min。4 ℃～25 ℃、13 000 g離心10 min。將上清液轉移至1. 5 mL 無菌離心管中。DNA 沉淀向裂解混合物內加入0. 7 mL 異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5 min 后室溫下6 000 g 離心10 min，棄上清液。在含有DNA 沉淀的離心管中加入1 mL 75% 乙醇，顛倒混勻，室溫下2 000 g離心2 min，棄上清。將DNA 溶解于50 μL 緩沖液中并測定濃度。

1. 4 總RNA提取和逆轉錄合成cDNA

按照TRIReagent 操作說明提取細胞總RNA，具體操作步驟如下：加入 TRI Reagent 1 mL，室溫放置 5 min，反復吹打而后用吸頭轉移至1. 5 mL 刻度離心管中，吹打使其充分消化裂解。加入200 μL 氯仿， 使用渦旋振蕩器振蕩混勻15 s，室溫放置15 min。4 ℃、12 000 g 離心5 min， 混合物分為3 個液相， RNA在上層水中。吸取上層水相時勿吸取中間界面，至另一個離心管中，加入0. 5 mL 異丙醇，室溫放置10 min。4 ℃、12 000 g 離心10 min，白色沉淀物即RNA。棄上清，加入預冷的75% 乙醇1 mL，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4 ℃、7 500 g 離心5 min，棄上清液。室溫晾干或真空干燥5～10 min。用30 μLDEPC 水溶解RNA 樣品，55 ℃～60 ℃金屬浴10 min。檢測吸光度（A） 值定量RNA （A260） 濃度，?80℃保存。采用cDNA 逆轉錄試劑盒進行cDNA的合成，取500 ng 總RNA 在終體積為6 μL 的反應體系中進行逆轉錄。

1. 5 PCR法和基因測序法檢測乳腺癌組織中H19和 IGF2基因多態性及印跡表達分析

在美國國家生物技術信息中心（National Center forBiotechnology Information， NCBI） 數據庫中搜索位于H19 和IGF2 表達區域內的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism， SNP） 位點， 針對該SNP 位點設計引物，PCR 覆蓋此SNP 位點的目的條帶。采用RT-PCR 法擴增目的基因轉錄產物（72 ℃、3 min； 96 ℃ 、20 s， 58 ℃ 、20 s， 72 ℃ 、20 s，共40 個循環），特異性擴增人H19 和IGF2 基因最后一個外顯子片段，包括2 個具有多態性的限制性內切酶（ApaⅠ和AluⅠ） 位點。

印記表達分析方法：將目的條帶膠回收純化，克隆后進行測序，直接鑒定其基因表達。印記保持（maintenance of imprinting， MOI） 的細胞為單等位基因表達，LOI 細胞為雙等位基因表達。H19 基因組DNA 同時攜帶A 和C 等位基因，而cDNA 只表達A 等位基因或C 等位基因，另一個則被沉默。在cDNA 樣本中均檢測到了A 和C 等位基因，顯示H19 發生了LOI。IGF2 基因組DNA 同時攜帶T 和C 等位基因，而cDNA 只表達T 等位基因或C 等位基因，另一個則被沉默。在cDNA 樣本中均檢測到了T 和C 等位基因， 顯示IGF2 發生LOI。用于印記檢測的PCR 引物見表1。

1. 6 RT-qPCR 法檢測乳腺癌組織和癌旁組織中IGF2 和 H19 mRNA 表 達 水 平

采 用 Fast startUniversal SYBR Green Master 試劑盒進行RTqPCR檢測， 反應過程在ABI Prism 7900HT PCR擴增儀上進行。 RT-qPCR 反應體系20 μL：10 μL 2×KAPA SYBR mix， 4 μL cDNA， 2 μLPrimer，4 μL H2O。整個體系的配制在冰上避光操作， 體系加入PCR 儀器前離心避免產生氣泡， 每個反應設3 個復孔。實驗重復3 次，結果取平均值。反應結束后， 采用Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR 系統進行分析，并繪制熔解曲線，確定RT-qPCR 產物的同質性。采用2－△△Ct 法計算目的基因表達水平， 以β -actin 作為內參。擴增H19、IGF2 和β-actin 基因所用的引物見表2。

1. 7 統計學分析

采用 SPSS 22. 0統計軟件進行統計學分析，所有實驗均重復3 次。乳腺癌組織和癌旁組織中H19 和IGF2 mRNA 表達水平呈正態分布，以-x±s 表示，2 組間樣本均數比較采用t 檢驗，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t 檢驗； H19 與IGF2mRNA 表達水平相關性采用Pearson 相關分析；不同分子分型乳腺癌患者H19 和IGF2 基因多態性以百分率表示，組間比較采用χ2 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 乳 腺 癌 患 者 癌 組 織 和 癌 旁 組 織 中 H19 和IGF2 mRNA 表達水平及兩者相關性

134例乳腺癌患者癌組織中H19 mRNA 表達水平（0. 088±0. 014） 高于癌旁組織（0. 024±0. 005）（Plt;0. 01）；120 例乳腺癌患者癌組織中IGF2 mRNA 表達水平（0. 348±0. 036） 高于癌旁組織（0. 095±0. 018）（Plt;0. 01）。見圖1。乳腺癌患者癌組織中H19mRNA 表達水平與IGF2 mRNA 表達水平呈正相關關系（r=0. 567，Plt;0. 01）。

2. 2 不 同 分 子 分 型 乳 腺 癌 患 者 癌 組 織 中H19 mRNA表達水平

Luminal型、HER2陽性型和三陰性乳腺癌患者癌組織中H19 mRNA 表達水平均高于癌旁組織（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖2。

2. 3 不同分子分型乳腺癌患者癌組織中 H19 和IGF2基因多態性

對 117例乳腺癌患者乳腺癌組織中H19 和IGF2 基因多態性進行分析，結果顯示：在不同分子分型乳腺癌患者癌組織中H19 與IGF2基因多態性分布比較差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。Luminal 型乳腺癌患者86 例， 基因多態性分析中H19 和IGF2 均為純合狀態占38. 4%， H19和IGF2 均為雜合狀態占22. 1%； HER2 陽性型和三陰性乳腺癌患者中H19 和IGF2 純合狀態分別占42. 9% 和35. 3%， H19 和IGF2 雜合狀態分別占42. 9% 和41. 2%。見表3。

2. 4 乳腺癌患者癌組織中 IGF2和 H19的印記狀態

161 例乳腺癌患者接受了SNP 檢測（位點：AluⅠ/ApaⅠ）。IGF2 LOI 發生率為36. 7% （22 例LOI， 38 例 MOI）， 明顯高于 H19 LOI 發生率（4. 3%）（2 例LOI，45 例MOI）。所有組織樣本中H19 或 IGF2 的基因組DNA （genomic DNA，gDNA） 被鑒定為雜合子（A/G，T/C），用于后續分析，H19 和IGF2 的基因分型及LOI 見表4。H19和IGF2 雙基因同時LOI 僅1 例；IGF2 LOI 而H19MOI 22 例，H19 基因組DNA 雜合子A/C 共14 例，純合子A 8 例。H19 LOI 的樣本編號為R0242，IGF2 LOI 的樣本編號為R0249， 測序結果見圖3。在不同分子分型乳腺癌患者癌組織中H19 和IGF2基因印記狀態（同一患者） 構成見表5。

2. 5 IGF2 LOI與 IGF2 mRNA表達的關系

SNP檢測結果顯示： IGF2 gDNA 雜合子60 例， 其中LOI 22 例，MOI 38 例。IGF2 LOI 組乳腺癌患者癌組織中IGF2 mRNA 表達水平（0. 127 ± 0. 226）明顯高于IGF2 MOI 組（0. 053 ± 0. 156）（Plt;0. 01）， 表明IGF2 的LOI 可促進IGF2 mRNA 表達。見圖4。

3 討 論

腫瘤的發生發展與印記基因的調控有密切關聯。許多腫瘤的發生，如前列腺癌、結直腸癌、頭頸部腫瘤和胚胎癌與LOI 有關。lncRNA H19 和IGF2 為最早被研究的印記基因，其相互作用在機體生長發育的多個信號通路中起關鍵作用［8］。

在許多惡性腫瘤組織中存在H19 和IGF2 的LOI，但不同組織的印記模式不同［9］。本研究結果顯示：H19 在乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，提示H19 與乳腺癌的發生有關聯。研究［10］ 顯示：乳腺癌組織中H19 表達上調，與本研究結果一致。WEI 等［11］ 研究顯示： H19 作為一種競爭性RNA， 通過隔離抑癌因子Let-7c 來調節表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR） 的高表達，進而促進細胞增殖。H19 可通過miR-200b/c 和let-7b 介導上皮- 間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），參與腫瘤細胞從原發部位擴散到遠處形成繼發腫瘤的過程［12］。H19 還可在基因水平、轉錄水平和蛋白質翻譯水平調控機體生物學活動， 如參與染色質重構、DNA 甲基化和作為miRNA 前體對組蛋白進行修飾。研究［13］ 表明：H19 基因沉默可降低乳腺癌細胞的增殖能力和皮下成瘤能力。

以往研究［14］ 顯示：H19 作為ER 調節劑介導雌二醇誘導的乳腺癌細胞增殖分化。研究［14-15］ 表明：ER 陽性乳腺癌細胞中H19 表達水平是ER 陰性乳腺癌細胞表達水平的10 倍以上。H19 通過影響雌激素而發揮作用。由于本研究47 例雜合病例中H19 LOI 例數僅為2 例，乳腺癌組織中H19 高表達與LOI 的相關性有待進一步研究，可能存在其他調控機制激活H19 表達。研究［16］ 顯示：H19 啟動子可被轉錄因子E2F1 激活，進而影響其印記狀態。

研究［8，17］ 顯示：IGF2 可促進腫瘤細胞的惡性增殖，其持續表達可促進腫瘤發展。在本研究中，乳腺癌組織中IGF2 mRNA 表達水平高于癌旁組織。以往研究［18］ 顯示：IGF2 表達水平上調并非在腫瘤組織，而是發生在腫瘤周圍的正常組織，因此腫瘤能通過刺激旁分泌IGF2 的方式，改善自身生存環境。HEFFELFINGER 等［19］ 證實： 在腫瘤與正常組織的過渡區IGF2 表達水平明顯升高。本研究結果顯示：IGF2 的 LOI 引起 IGF2 mRNA 表達水平升高，乳腺癌患者出現 IGF2 LOI 的比例約為36. 7%。在乳腺癌轉移過程中腫瘤相關成纖維細胞發揮著重要作用。研究［20］ 表明：乳腺癌患者轉移部位的腫瘤相關成纖維細胞可通過增加IGF2 的表達實現促進腫瘤進展的作用。

目前對于H19 和IGF2 印記基因間相互作用的研究較少。 人類乳腺癌組織中高遷移率族 ATHook 蛋白1 （ high mobility group AT Hook protein1HMGA1） P7 表達與H19 和IGF2 表達有明顯相關性， HMGA1P7 表達上調可能通過內源性競爭RNA 機制上調H19 和IGF2 的表達，進而促進癌癥的進展［21］。也有研究［22］ 表明：H19 基因反義轉錄本91H RNA 不影響H19 的表達和基因組印記，而是調節IGF2 的表達。本研究乳腺癌患者癌組織中H19 和IGF2 mRNA 表達水平均高于癌旁組織，其機制有待進一步研究。

綜上所述， 本研究分析了印記基因H19 和IGF2 在乳腺癌組織中的表達水平及印記狀態，初步驗證了H19 和IGF2 mRNA 在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，IGF2 LOI 可能是促進乳腺癌發生的關鍵因素之一。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：

魏雪和文雪參與文獻檢索、實驗設計和論文撰寫，謝瀟、王月媛和黃丹參與數據收集整理、結果分析和討論，楊明參與論文寫作指導和論文審校。

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[基金項目] 吉林省財政廳科研基金資助項目（JLSCZD2019-042）