小麥大、小粒材料的細胞學鑒定及其粒重相關基因表達研究

摘要：籽粒大小是影響小麥產量的重要農藝性狀，開展控制籽粒大小相關基因的篩選鑒定和表達研究對小麥高產育種具有借鑒意義。本研究利用染色體計數和熒光原位雜交（FISH）的方法對15份大粒材料（千粒重高于50 g）和15份小粒材料（千粒重低于21 g）進行鑒定，結果顯示，京5044、京5085、藏1783、黑72-0484、uis鑒010共5份大粒材料的染色體條數為28，為四倍體小麥：其余材料染色體條數均為42，為六倍體小麥。選取六倍體的大粒和小粒材料各3份作為試驗材料，用水稻和擬南芥的64個粒重相關基因在小麥基因組中篩選同源基因，對其進行qRT-PCR分析，選出6個在大、小粒材料中表達量存在顯著差異的基因進行對比分析。結果表明，基因RiGSK2、RiGW8和RiGGC2在大粒材料HR2015-1-1- 2-9中表達量較高，RiGS3和RiD11在小粒材料紅禿頭3中表達量較高，ArTTG2在3份小粒材料中表達量均較高，推測這6個基因可能是控制小麥粒重的關鍵基因，在后續研究中將進一步驗證它們對小麥產量的貢獻。

關鍵詞：小麥：籽粒大小：熒光原位雜交（FISH）：粒重相關基因：表達分析

中圖分類號：S512.1：Q786 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 08-0010-07

種子大小是植物最重要的產量性狀之一，因此，開展控制籽粒大小的基因的相關研究，對培育高產小麥具有重要意義。目前已從小麥中鑒定出一些籽粒大小相關基因，主要包括負調控粒寬和千粒重的TaGW2基因及其同源基因，負調控種子大小的泛素激活蛋白酶基因TaDA1，編碼具有重復類似Kelch - like結構的磷酸激酶基因TaGL3，調節細胞分裂素穩態的細胞分裂素氧化酶基因TaCKX，參與淀粉合成的關鍵基因TaACP-S1，控制粒寬和粒長的小麥蔗糖合成酶基因TaSUS1，正調控籽粒大小和重量的編碼絲氨酸羧肽酶的基因TaGS5，與粒重、粒寬、粒長相關的谷氨酰胺合成酶基因TaGS1，以及其他一些參與小麥籽粒大小形成的基因如TaC-YP78A3、TaGS3等。然而小麥基因組復雜龐大，仍存在大量重要的控制大小籽粒形成的基因未被挖掘出來，因此，繼續深入挖掘籽粒大小與重量相關基因對于小麥品種改良意義重大。

目前控制種子大小的信號途徑在擬南芥和水稻中研究較多，已經發現了如泛素—蛋白酶體途徑、G蛋白信號途徑、絲裂原活化蛋白激酶信號途徑、植物激素和轉錄調控因子途徑等多種相關信號途徑。研究發現，絲裂原活化蛋白激酶信號途徑中，擬南芥MKK4/5在MAPK6的上游控制胚形成：轉錄調控因子途徑中，擬南芥TTG2編碼一個WRKY家族轉錄因子，導致ttg2突變體被皮中的細胞長度減小：泛素一蛋白酶體途徑中，水稻GW2編碼一個環型E3泛素連接酶，通過加速籽粒灌漿，增加粒寬、粒重和產量；G蛋白信號途徑中，水稻RGB1 -DEP1/GGC2二聚體和分離的RGA1可能通過促進穗殼中的細胞增殖激活未知的下游效應因子來調節籽粒的大小。但以上基因是否參與控制小麥大小粒發育的信號通路仍不清楚。

本研究以15份大粒和15份小粒小麥材料為基礎，通過染色體計數和FISH核型分析選出含42條染色體、千粒重最高的3份大粒材料和最低的3份小粒材料，利用64個控制水稻和擬南芥大小籽粒發育的基因，通過同源比對的方法從小麥基因組中鑒定出同源基因，并用qRT-PCR法分析其在6份大、小粒材料中的表達差異，篩選出控制小麥籽粒大小的重要基因，為后續驗證這些基因對小麥產量的貢獻并用于品種改良提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

千粒重超過50 9的15份大粒小麥材料：DA-LI-1、DALI-2、京5044、京5085、藏1783、黑72-0484由山東省農業科學院作物研究所（以下簡稱作物所）張榮志副研究員提供；DASUIDALI、LJ15鑒010和章丘大穗由作物所劉建軍研究員提供：HR2015-1-1-2-9、咸陽超大穗101、咸陽超大穗362、咸陽超大穗901、咸陽超大穗965由作物所韓冉博士提供：大穎殼由四川農業大學甯順宗教授提供。

千粒重低于21 9的15份小粒材料：紅禿頭3、紅穗、白穗白、小白麥、小白穗、腰珠紅、蘆麥、改麥、亮麥、小禿頭、紅芒麥、紅半芒、紅禿頭1、齊頭子和紅禿頭2為地方品種，由作物所樊慶琦研究員提供。

1.2 植物材料培養及樣品處理

將30份供試小麥材料的種子放于鋪有濕潤濾紙的培養皿中，置于22-24℃恒溫光照培養箱中培養約24 h。待種子萌發后，將培養皿轉到4℃冰箱處理24 h。將處理過的種子轉入22 - 24℃恒溫光照箱中培養24-35 h，待根尖長至1.0-1.5 cm時采集根尖，用冰水混合物處理24 h后用卡諾固定液I（無水乙醇：冰醋酸=3：1）固定3-7 d，放人4℃冰箱備用。

將篩選出的3份大粒材料HR2015-I-I-2-9、大穎殼、咸陽超大穗101和3份小粒品種白穗白、紅穗和紅禿頭3的種子種在10 cm×10 cm的花盆中，每個品種種5盆，每盆6株，在光照培養室培養（24℃，濕度60％，14 h光照/10 h黑暗）；孕穗期取幼嫩小穗，液氮處理后于-80℃冰箱保存備用。每份材料選3株長勢一致的單株作為3個生物學重復。

1.3 千粒重的調查統計

2021年9月在山東省農業科學院試驗田（36°2＇N，117°5＇E）種植15份大粒材料和15份小粒材料，2022年6月成熟期采收并調查千粒重。

1.4 染色體計數與FISH核型分析

將備用根尖的分生組織切下，放人含2%果膠酶R-IO（日本Yakult公司）和2％纖維素酶Y-23（日本Yakult公司）的10 μL混合酶液中，37℃水浴50 min酶解；酶解后，用70%乙醇沖洗2次，然后用解剖針搗碎，2 000 r·min-1離心10 s，倒掉乙醇，加入100％乙酸20 μL，渦旋混勻；取7μL根尖分生組織細胞懸浮液，滴到載玻片上，停留約5 min待乙酸完全揮發后鏡檢，鏡檢合格的染色體制片置于-20℃冰柜中備用。

取濃度約為10μmol·L-1的雙色FISH探針（Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1）各0.2 μL加入到8 μL 2x檸檬酸鈉（SSC）溶液（pH=7）中，渦旋混勻配成雜交液。將雜交液滴至上述制備好的玻片上，蓋上蓋玻片，置于濕潤的塑料盒中80℃變性5 min，然后將塑料盒置于37℃雜交箱中雜交Sh。取出染色體制片，放于裝有2xSSC溶液的洗脫缸中，洗掉蓋玻片和雜交液，然后再用ddH，O沖洗一遍，晾干，避光滴加一滴抗褪色劑，蓋上蓋玻片，用OLYMPUS BX53熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本）鏡檢，DP70CCD鏡頭下拍照。

1.5 RNA提取及qRT-PCR分析

將采集的3份大粒材料和3份小粒材料的幼嫩小穗分別利用miRcute多糖多酚植物miRNA提取分離試劑盒（天根，北京）提取RNA，利用Nanodrop 2000/2000C分光光度計（Thermo，美國）測定RNA濃度。用PrimeScript RT reagent Kitwith gDNA Eraser（TaKaRa，大連）將RNA反轉錄成cDNA，用于qRT-PCR分析。

選取已報道的34個控制水稻籽粒大小發育和30個控制擬南芥籽粒大小發育的基因，在NC-BI網站（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov）搜索相應的小麥同源基因，根據其保守序列區段，通過Primer3Plus軟件設計qRT-PCR引物，對其在3份大粒材料和3份小粒材料幼嫩小穗中的表達量進行qRT-PCR測定，發現有6個基因的表達量在大粒和小粒材料間存在顯著差異，對這6個基因在大、小粒材料中的表達情況進行對比分析。這6個基因的引物序列見表1。PCR反應體系為20 μL，包括：SYBR@ Green PCR Master Mix 10μL，稀釋的cDNA 2 μL，0.1 μmol·L-1正、反向引物各0.4 μL，用RNase free water補齊至20 μL。PCR反應程序：95℃預變性5 min;95℃變性10s，60℃延伸30 s，40個循環。設置3次技術重復，用2-△△Ct法計算基因相對表達量。利用SPSSStatistics 21.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 供試小麥材料的細胞學鑒定

利用染色體計數和FISH法對15份大粒材料和15份小粒材料進行細胞學分析，結果（表2）顯示，京5044、京5085、藏1783、黑72-0484、LJ15鑒010共5份大粒材料的染色體為28條，是四倍體小麥：其余大粒材料及所有小粒材料的染色體均為42條，是六倍體小麥。FISH鑒定結果以四倍體小麥黑72-0484和六倍體小麥HR2015 -1-1-2-9為例展示，見圖1。

2.2 用于分析粒重相關基因表達的小麥材料篩選

2022年6月收獲供試小麥材料，統計千粒重，結果見表2，大粒材料的千粒重在50.2 - 86.7 9范圍內，小粒材料的千粒重在16.9 - 20.8 9范圍內。從染色體條數為42的材料中，選千粒重高的前3位大粒材料以及千粒重低的前3位小粒材料，分別為HR2015-1-1-2-9、大穎殼和咸陽超大穗101以及白穗白、紅穗和紅禿頭3，用于后續粒重相關基因分析。

2.3 粒重相關基因在小麥大、小粒材料中的表達分析

利用64個控制水稻和擬南芥大小籽粒發育的基因，通過同源比對的方法從小麥基因組中找出同源基因，對其在3份大粒材料和3份小粒材料中的表達情況進行qRT-PCR分析，其中有6個基因在大、小粒材料中的表達有顯著性差異，如圖2顯示。RiGSK2和RiGW8均在HR2015 -1-1-2-9中的表達量最高，且均顯著高于其他材料，分別為大粒材料大穎殼、咸陽超大穗101的3.0、1.9倍和1.6、1.6倍，分別為小粒材料紅禿頭3、紅穗、白穗白的8.1，3.6、2.2倍和2.3、1.8、1.3倍；RiG-GC2也是在HR2015-1-1-2-9中的表達量最高，顯著高于在紅禿頭3和紅穗中的表達量，約是兩者的2.9倍和1.3倍，但與其他材料差異不顯著。上述3個基因均在紅禿頭3中的表達量最低，在紅穗中的表達量較低。RiGS3在紅禿頭3中的表達量最高，顯著高于其他材料，約是小粒材料紅穗和白穗白的2.0倍和5.6倍，依次是大粒材料HR2015-1-1-2-9、大穎殼、咸陽超大穗101的3.4、3.0、4.8倍；其在白穗白和咸陽超大穗101中的表達量顯著低于其他材料。ArTTG2、RiD11在小粒材料中的表達量高于大粒材料，且ArTTG2在3份小粒材料中均達到差異顯著水平，而RiD11僅在紅禿頭3中達到差異顯著水平：ArTTG2在紅穗中的表達量最高，分別是紅禿頭3和白穗白的1.2倍和1.7倍，依次是大粒材料HR2015 -1-1-2-9、大穎殼、咸陽超大穗101的3.1、3.1、14.0倍；RiD11則是在紅禿頭3中表達量最高，分別是紅穗和白穗白的2.0倍和2.7倍，依次是大粒材料HR2015-1- 1- 2-9、大穎殼、咸陽超大穗101的3.3、3.7、2.8倍。

3 討論與結論

3.1 控制籽粒大小的小麥同源基因在大粒材料中的作用

小麥產量由單位面積穗數、穗粒數和千粒重三要素決定，其中千粒重是影響產量的關鍵因素。挖掘小麥籽粒大小關鍵基因對于提高粒重進而提高產量意義重大。如：Su等根據水稻中OsGV2基因調控粒重，同源克隆了小麥中與粒重相關的基因TaGW2。Ma等克隆了TaGS5 -3A基因，發現TaGS5-3A -T比TaGS5-3A -G基因型有更高的酶活：過表達該基因后，小麥籽粒增大，千粒重提高。Li等發現過表達CKX2導致擬南芥iku2種子增大。可見，挖掘并過表達控制大粒發育的基因可提高小麥產量。

本研究利用水稻和擬南芥中調控籽粒發育的基因進行同源比對，篩選到6個小麥同源基因，通過其在小麥大、小粒材料中的表達分析發現，RiG-SK2、RiGW8和RiGGC2可能為控制小麥大粒形成的基因，其在3份大粒材料中的表達量顯著高于小粒材料紅禿頭3：RiGSK2、RiGW8在HR2015-1-1-2-9中的表達量顯著高于其他兩份大粒材料和3份小粒材料。這可為小麥高產育種提供重要的基因資源，今后可將其用于小麥的高產育種。

3.2 控制籽粒大小的小麥同源基因在小粒材料中的作用

Hong等利用RNA干擾（RNAi）技術，降低了調控小粒形成的TaGV2A、TaGW2B、TaGV2D基因的轉錄水平，使得小麥粒寬、粒重增加。Wang等[28]利用CRISPR/Cas924產生OsOTUB1敲除突變體，使得水稻穗粒數和千粒重增加，從而提高了籽粒產量。Zhao等驗證發現轉基因水稻OsGSK2的RNAi系（OsGSK2-Gi-2）使得水稻籽粒長度增加了22%。可見，挖掘調控小粒形成基因，通過基因編輯干擾其表達可以提高作物產量。本研究發現，RiGS3、ArTTG2、RiD11基因可能與小麥小粒形成有關。其中ArTTG2在3份小粒材料中的表達量均顯著高于3份大粒材料：RiGS3、RiD11在紅禿頭3中的表達量顯著高于3份大粒材料，與其他兩份小粒材料紅穗及白穗白之間也存在顯著差異。因此可通過基因編輯技術將小粒形成基因RiGS3、ArTTG2和RiD11用于小麥高產育種，實現小麥增產。

綜上，本研究利用控制水稻和擬南芥大小籽粒發育的基因，從小麥基因組中鑒定出同源基因，并利用qRT-PCR法分析了各籽粒大小相關基因在不同大粒和小粒材料中的表達差異，初步篩選到可能控制大粒發育的基因RiGSK2、RiGW8和RiGGC2以及控制小粒發育的基因RiGS3、ArT-TG2、RiD11，為進一步驗證其功能及調控機制奠定了基礎，同時可為小麥高產分子育種提供重要的基因資源。

基金項目：山東省自然科學基金項目（ZR202IQC198，ZR2020MC098）；山東省重點研發計劃項目（2022LZG002）