黃瓜逆境脅迫響應基因CsABI5的克隆與表達分析

摘要：脫落酸不敏感蛋白5（abscisic acid insensitive 5，ABI5）屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛參與植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應。本研究采用同源克隆的方法獲得了黃瓜CsABI5基因，對其進行了生物信息學分析和組織特異性表達分析，并分析了其在鹽脅迫和ABA處理下的表達情況。結(jié)果表明，CsABI5基因的CDS為1 230 bp，編碼409個氨基酸，其編碼蛋白的分子量為44. 88 kDa，理論等電點為9.53，親水性平均系數(shù)為-0.603，屬于親水性堿性蛋白。多序列比對顯示該蛋白與其他物種的ABI5蛋白具有較高的相似性，C端均含有典型的保守bZIP結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示葫蘆科的ABI5聚為一支，CsABI5與甜瓜的CmABI5親緣關(guān)系最近。實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）測定發(fā)現(xiàn)，CsABI5在黃瓜營養(yǎng)器官和生殖器官中均有表達，在果刺中相對表達量最高。四葉期幼苗受100 mmol/L NaCI和100 μmol/L ABA處理后CsABI5表達量顯著上調(diào)，均在處理6h升至最高。本研究結(jié)果可為抗逆黃瓜品種的選育提供參考。

關(guān)鍵詞：黃瓜：ABI5蛋白：鹽脅迫：生物信息學分析：表達特性

中圖分類號：S642.2：Q786 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 08-0030-07

脫落酸（abscisic acid，ABA）是植物五大內(nèi)源激素之一，不僅在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，還能響應極端溫度、干旱、鹽堿等各種環(huán)境脅迫，是平衡植物生長代謝的關(guān)鍵因子。通過對擬南芥突變體的研究，鑒定到許多對ABA不敏感（ABA-insensitive，ABI）的基因，例如ABI1、AB12、ABI3、ABI4、ABI5。其中，ABI1和ABI2是兩個高度同源的蛋白磷酸激酶，是ABA信號通路中的負調(diào)控因子：ABI3和ABI4分別屬于B3蛋白家族和AP2/ERF家族：ABI5屬于堿性亮氨酸拉鏈類（basic leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子，具有一個典型的bZIP結(jié)構(gòu)域。目前，在擬南芥、水稻、小麥、玉米、蘋果等植物中對ABI5基因功能均開展了相關(guān)研究，明確其在調(diào)控種子萌發(fā)、開花時間、根生長以及響應逆境脅迫等生命活動中發(fā)揮著重要作用。此外，ABI5還與其他植物激素信號通路中的因子相互作用，以調(diào)控植物生長發(fā)育。

黃瓜（Cucumis sativus）是葫蘆科一年生草本植物，是中國設(shè)施栽培蔬菜中的第二大作物。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過表達黃瓜RELATED TOABI3/VP1（CsRAV1）基因能提高轉(zhuǎn)基因植株對ABA的抗性：黃瓜CHY ZINC-FINGER ANDRING PROTEIN1（CsCHYR1）基因的表達受ABA誘導，并且通過與NAC轉(zhuǎn)錄因子CsATAF1相互作用調(diào)節(jié)植株的耐旱性。ABI5在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要功能，然而在黃瓜中卻鮮有報道。本研究采用同源克隆方法從黃瓜中克隆了CsABI5基因，并對其進行了生物信息學分析以及在不同器官中和NaCl、ABA處理下的表達模式分析，以期為抗逆黃瓜品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用華北型黃瓜自交系9930，2023年8月種植于上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院五厙實訓基地。選擇長至5片真葉的黃瓜植株，取其根、莖、子葉、真葉；選擇長至20節(jié)位的黃瓜植株，取其花瓣、果刺、果皮和卷須。選擇具有4片真葉的幼苗，一部分用100 mmol/L NaCl溶液澆灌進行鹽脅迫處理，澆灌量約500 mL;另一部分用100 μmol/LABA噴施植株葉片，并均在處理0、1、3、6、12 h取葉片。所取樣品液氮速凍后置于-80℃冰箱中備用。

1.2 基因克隆

基于黃瓜9930 V2版基因組（http：//cucurbit-genomics.org/ftp/genome/cucumber/Chinese_long/v2/）設(shè)計特異性引物CsABI5_F（5’- AT-GAATITCAGAAACTITGAGGATATCC-3’）和CsABI5_R（5’- CCATGGGCCAGTCAGTGTTC-3’）。使用植物RNA提取試劑盒（康為世紀生物科技股份有限公司）提取黃瓜葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，選用高保真酶PrimeSTAR Max Premix（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）進行PCR擴增，電泳回收后將目的片段連接至pClone007 Blunt Vector克隆載體（上海擎科生物科技有限公司），轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，12 h后挑取單菌落進行PCR篩選，對陽性克隆進行測序驗證。擴增體系：PrimeSTARMax Premix 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2μL，模板DNA 200 ng，ddH，O補充至50 μL。擴增程序：94℃5 min;98℃10 s，55℃15 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃5 min。

1.3 CsAB15的生物信息學分析

通過ExPACy網(wǎng)站的ProtParam對CsABI5蛋白的理化性質(zhì)進行預測分析。通過Cell-PLoc 2.0網(wǎng)站對CsABI5的亞細胞定位進行預測。利用SOPMA網(wǎng)站對CsABI5的二級結(jié)構(gòu)進行預測。利用PlantCARE對CsAB15的轉(zhuǎn)錄起始點上游2 000bp的序列進行啟動子元件預測。利用MEME對CsABI5的保守基序（Motif）進行預測。將CsABI5的蛋白序列提交到NCBI網(wǎng)站，進行序列比對，下載不同物種的bZIP蛋白序列（表1），利用DNA-MAN對9種植物的ABI5蛋白序列進行比對，通過MEGA X對21種bZIP蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。使用TBtools對進化樹和Motif進行可視化展示。

1.4 CsABI5的表達分析

分別提取黃瓜各器官的總RNA，檢測合格后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)CsABI5編碼區(qū)序列設(shè)計引物RT-CsABI5F（5’-CTAAGGCACAAGGAAATTT-CACAT-3’）和RT - CsABI5R（5’- CGGCAGTC-CATATGTTTTTAAGAA -3’），進行RT - qPCR實驗，檢測CsAB15在黃瓜不同器官中以及NaCl和ABA處理后的表達情況。使用康為世紀的Ultra-SYBR Mixture試劑盒進行分析，PCR體系和程序見試劑盒說明書。用黃瓜Actin（Csa6C484600）基因作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsABI5基因克隆及其編碼蛋白理化性質(zhì)

以黃瓜cDNA為模板，對CsAB15基因的編碼區(qū)進行擴增，電泳后獲得一條約1 200 bp的條帶（圖1）。測序結(jié)果表明，CsAB15基因的CDS長度為1230 bp，編碼409個氨基酸。CsABI5蛋白的分子式為C1943 H3131 N579 0612 S15，分子量為44. 88kDa，理論等電點為9.53，親水性平均系數(shù)為-0.603，屬于親水性堿性蛋白。CsABI5蛋白二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角組成，其中無規(guī)則卷曲占比最高（57.46%），其次是α -螺旋（31.78%），延伸鏈（8.80%）和β-轉(zhuǎn)角（1.96%）占比較小。Cell-PLoc 2.0預測CsABI5蛋白定位于細胞核中。

2.2 CsABI5的進化分析

將克隆得到的黃瓜CsABI5序列與其他9個物種的ABI5序列進行同源性分析，結(jié)果（圖2）顯示：CsABI5與其他物種的ABI5蛋白相似系數(shù)介于32.1% - 96. 8%，與甜瓜CmABI5的相似性最高，其次是與冬瓜、野生灰籽南瓜、苦瓜、印度南瓜和美洲南瓜的ABI5蛋白，相似系數(shù)分別為96.8%、94. 4%、82. 9%、82. 5%、82. 2%0和82. 2%.此外，這些序列在C端均含有典型的bZIP結(jié)構(gòu)域。

利用21條不同植物的bZIP家族蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果（圖3）表明，21個蛋白分為3組，所有葫蘆科植物的ABI5聚在Ⅱ組，擬南芥的ABI5單獨聚為Ⅲ組，其余物種的bZIP蛋白聚在Ⅰ組。CsABI5與甜瓜的CmABI5親緣關(guān)系最近。用MEME對21條蛋白序列的保守基序進行分析，結(jié)果（圖3）顯示，所有蛋白序列均含有Motif5、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 9、Motif 1，其中Motif 1是bZIP結(jié)構(gòu)域。

2.3 啟動子元件分析

由表2可見，CsAB15啟動子區(qū)除了含有核心元件TATA和CAAT外，還包含1個脫落酸響應元件（abscisic acid responsive）、1個防御脅迫響應元件（defense and stress responsive）、1個干旱響應元件（drought-inducibility）、2個赤霉素響應元件（GA-responsive）以及10個光周期響應元件（lightresponsive）。表明該基因可能在響應逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。

2.4 CsAB15基因在黃瓜不同器官中的表達模式

利用RT-qPCR對CsABI5基因在黃瓜不同器官中的表達量進行分析，結(jié)果（圖4）顯示，CsAB15在黃瓜所有器官中均表達，但在果刺中的表達量最高，其次是子葉、莖、根、卷須、果皮、花瓣和葉。

2.5 CsABI5基因在鹽脅迫和ABA處理下的表達模式

將黃瓜幼苗用100mmol/L NaCl和100μmol/L ABA處理，利用RT - qPCR檢測CsAB15在處理不同時間的表達水平，結(jié)果（圖5）表明：CsABI5在NaCl處理后，表達量先升高，處理6h達到最高，是未處理的4.6倍，之后表達量快速下降，12 h后基本恢復到初始水平。ABA處理可誘導CsAB15顯著上調(diào)表達，處理6h的相對表達量最高，是未處理的15.1倍，之后也快速下降。

3 討論與結(jié)論

bZIP轉(zhuǎn)錄因子是植物生長發(fā)育中重要的一類調(diào)節(jié)因子，能夠響應多種生物和非生物脅迫，并賦予植物多種脅迫抗性。本研究采用同源克隆的方法在黃瓜中克隆到一個bZIP轉(zhuǎn)錄因子Cs-ABI5，CsAB15基因的CDS全長1230 bp，編碼409個氨基酸。CsABI5蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角組成，含有保守的bZIP結(jié)構(gòu)域。進化分析顯示CsABI5與甜瓜的CmABI5親緣關(guān)系最近，這與經(jīng)典的系統(tǒng)分類結(jié)果一致。

擬南芥abi5突變體對ABA處理不敏感，種子萌發(fā)不受ABA抑制，而AB15過表達植株對ABA超敏感。ABI5可以直接結(jié)合靶基因啟動子的ABA響應元件抑制種子的萌發(fā)，能通過調(diào)控FLOWERING LOCUSC（FLC）的表達控制開花時間，能通過調(diào)控葡萄糖的合成抑制根分生組織的生長。水稻AB15-Likel（ABL1）在根、莖、葉等多個器官中表達，并受ABA以及鹽、干旱和滲透脅迫等的誘導。玉米ZmAB15受高溫、低溫、脫落酸、水楊酸、氯化鈉等多種脅迫誘導表達，過表達ZmAB15植株呈現(xiàn)出明顯的脅迫敏感表型。擬南芥AB15在受到ABA誘導后，表達量增加，在6h后升至最高。本研究結(jié)果表明，黃瓜CsABI5受100 μmol/L ABA誘導顯著上調(diào)表達，處理6h時表達量最高，與擬南芥中的結(jié)果相似。另外，在CsABI5啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了脫落酸響應元件、防御脅迫響應元件、干旱響應元件，Cs-ABI5可能通過這些元件響應脅迫信號。

CsABI5在黃瓜各器官中均有表達，在果刺中相對表達量最高。草莓FaABI5同樣在所有器官中表達，但在根中相對表達量最高。而擬南芥AB15主要在成熟種子和花朵中表達，營養(yǎng)組織中幾乎不表達。這說明雖然ABI5在不同植物中的功能相對保守，但表達部位存在差異。

綜上，本研究通過同源克隆獲得了黃瓜CsA-BI5基因，其編碼蛋白含有保守的bZIP結(jié)構(gòu)域，與甜瓜CmABI5親緣關(guān)系最近，啟動子區(qū)含有多種逆境應答元件，在100 mmol/L NaC1和100μmol/L ABA處理6h內(nèi)上調(diào)表達且表達水平逐漸升高，之后表達量快速下降。本研究結(jié)果可為CsABI5參與黃瓜逆境脅迫響應相關(guān)研究提供理論依據(jù)，并為黃瓜耐逆品種選育奠定基礎(chǔ)。

基金項目：上海市“科技創(chuàng)新行動計劃”農(nóng)業(yè)領(lǐng)域項目（20392001300）