煙草黑脛病對不同類型植煙土壤化學性狀及細菌群落的影響

摘要：為探究不同土壤類型對煙草黑脛病發生的響應差異，明確與黑脛病發病程度相關的因素，通過田間調查，收集黃壤土、水稻土煙草黑脛病不發病、中度發病和重度發病煙株根際土壤，測定土壤化學指標，并采用高通量測序技術分析不同發病程度下煙株根際土壤細菌群落結構。結果表明，黃壤土中隨黑脛病發病程度增加SOM和NO-3-N含量逐漸增加，AP含量中度發病最高。而在水稻土中，土壤NO-3-N和AP含量升高，SOM和AN含量呈先減后增的變化趨勢。黃壤土中Chao1、ACE指數隨發病程度增加呈增加趨勢且顯著高于不發病和中度發病土壤，水稻土中細菌Shannon和Simpson指數隨發病程度增加呈下降趨勢。芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬和苔蘚桿菌屬在中度發病土壤中富集。2種土壤類型下有機質含量和硝態氮含量對土壤細菌群落變化的貢獻率較大，是影響土壤細菌群落結構發生變化的重要非生物因素。綜上所述，不同土壤類型細菌群落α多樣性變化不一致，芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、苔蘚桿菌屬相對豐度隨病害加重而增加；有機質和硝態氮含量是影響黑脛病發生和細菌群落結構改變的重要非生物因素。

關鍵詞：煙草；黑脛病；發病程度；細菌群落結構；化學性狀

中圖分類號：S435.72 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0255-07

收稿日期：2023-09-06

基金項目：貴州省煙草公司重點研發項目（編號：2021XM15）。

作者簡介：高正鋒（1997—），男，云南祥云人，碩士研究生，研究方向為煙草病害。E-mail：766799325@qq.com。

通信作者：呂 芬，碩士，副教授，主要從事煙草栽培及病害方面的研究。E-mail：lvfen18@163.com。

煙草是我國重要的經濟作物，近年來由于集約化程度的提高，農業生產復種指數增加，造成植煙土壤養分失衡、土傳病害頻發［1］，嚴重制約著我國煙草產量及品質的提升［2-3］。煙草黑脛病的病原菌在土壤中有著較強的生命力，在沒有寄主植物存在的情況下也能存活數年，且較難清除，因而成為對煙草危害較為嚴重的土傳病害之一［4］。目前，對于煙草黑脛病的防治主要有培育抗性品種、農業防治、化學防治等，但抗性品種受到煙草工業原料需求和地域差異的影響，推廣難度大，只依靠農業防治措施的效果也十分有限，長期使用化學藥劑防治極易影響土壤微生態環境的穩定，導致病原菌抗藥性增加，因此尋找本土的關鍵致病因子，從當地植煙土壤本身進行改良和調控是煙草土傳病害防控的重要措施之一。

土傳病害的發生與土壤微生態環境的變化密不可分［5-7］。有研究表明，煙草黑脛病的發生與土壤理化性質間有一定聯系［8］，其中pH值對黑脛病的發生影響較為顯著，當植煙土壤pH值為酸性時黑脛病發病率較高［9］，還有研究指出健康土壤中的有機質、堿解氮和有效磷含量低于患病土壤［10］。微生物參與了土壤生態系統運轉和植物發育獲取營養物質的諸多關鍵過程，包括土壤質量維持和毒素降解，營養循環、有機質周轉等，是植株健康成長和保證土壤持續利用的重要組成部分之一，有研究指出土壤微生物的群落組成、結構、多樣性及生態網絡關系都與植物土傳病害的發生有關［11-13］。史普酉等發現，黑脛病不同發病程度煙株細菌群落組成和結構發生趨向性改變，土壤微生物的多樣性降低［14］。前人通過研究土壤微生物群落結構是否會影響煙草青枯病的發生得出，相對復雜的土壤微生態系統可能有助于抑制病原菌的入侵［15］。感染煙草青枯病的根際土壤微生物與未染病的根際土壤微生物相比，其健康土壤微生物多樣性較低［16］。向立剛等研究發現，健康煙株根際土壤中細菌群落的α多樣性高于感青枯病和黑脛病煙株的根際土壤［17］。盡管如此，以往的研究更多偏向于發病土壤與健康土壤之間的比較［18-19］，對于不同類型植煙土壤細菌群落結構變化的研究相對較少，這對于解釋在不同環境中煙草黑脛病菌對植煙土壤微生物的影響關系具有重要意義。基于此，本研究在貴州安順煙區挑選了煙草黑脛病持續發生的地塊進行試驗，從而比較在2種類型植煙土壤環境中，不同發病程度黑脛病煙株根際土壤的化學性狀和細菌群落結構之間的差異，以期為豐富煙株感病機制和煙草黑脛病的防治提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗點概況

試驗于2022年3—9月在貴州省楊武鎮（106°11′9.99″E，26°01′5.61″N，海拔1 162.54 m）和紫云縣干龍壩（106°10′58＂E，25°54′08″N，海拔為 1 183.8 m）進行。種植品種均為云煙87，移栽方式為井窖式移栽。試驗地基礎土壤理化性狀如表1所示。

1.2 土壤樣品采集

按照GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調查方法》中煙草病蟲害分級與調查的方法，對2種土壤類型（黃壤土記為C，水稻土記為F）下的煙株進行黑脛病等級劃分，并基于病情指數將煙株劃分為不同發病程度煙株（正常煙株：整株無病，編號為0；中度發病：煙株莖部莖圍 1/2 以上有病斑或煙株葉片中1/2～2/3凋萎，編號為1；重度發病：煙株莖部莖圍全部被病斑環繞，煙株葉片中2/3以上凋萎，編號為2）。待煙株病級確定后將其全部挖出，去除根部所有雜物后，將距離根部 2 mm 范圍內的土壤抖落并收集，發病程度相同的煙株土壤不少于3株，待充分混勻后一部分儲存于-80 ℃冰箱用于微生物群落測定，剩余土壤通過自然風干后用于測定理化性狀［20］。

1.3 土壤理化性狀的測定

土壤懸浮液中的pH值采用電位法測定。參照鮑士旦的方法［21］測定土壤有機質、堿解氮、有效磷和速效鉀含量。硝態氮含量采用紫外分光光度法測定；銨態氮含量采用可見分光光度法測定。

1.4 土壤細菌的測定

土壤細菌：用HiPure Soil DNA Kits提取土壤中的DNA；利用341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′）對16S rDNA基因高變區V3～V4進行PCR擴增，擴增產物的高通量測序在Illumina Hiseq平臺進行，通過NanoDrop微量分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和完整性，將純化的PCR產物進行文庫構建。經過Qubit和Q-PCR驗證文庫合格后，使用NovaSeq 6 000對DNA文庫進行測序。測序數據通過Qiime V1.9.1去除平均質量分數低（Q<20）和長度短（<100 bp）的低質量序列，使用Usearch軟件進行聚類，獲得OTU的豐度和OTU代表序列。基于OTU的序列、豐度數據，開展物種注釋、物種組成分析、α多樣性分析、β多樣性分析、相關性分析等。

1.5 統計方法

利用Excel 2010和SPSS 22.0進行數據處理，利用LSD法進行顯著性檢驗（α=0.05），利用R語言進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 黑脛病對不同類型土壤化學性質的影響

黑脛病不同發病程度下土壤的化學性質存在差異（表2）。黃壤土中隨發病程度變化pH值、堿解氮、速效鉀和銨態氮含量無顯著差異，有機質和硝態氮含量逐漸增加且處理間差異顯著（P<0.05），有效磷含量中度發病（C1處理）最高，為771.16 mg/kg。水稻土中，隨發病程度變化pH值和銨態氮含量無顯著差異，有機質含量先減少后增加，且各處理間達到顯著差異。堿解氮含量重度發病（F2處理）顯著高于其他處理，整體呈先減少后增加的變化趨勢。速效鉀和硝態氮含量呈增加趨勢，均為重度發病（F2處理）最高，和正常煙株根際土壤（F0處理）達到顯著差異。

2.2 黑脛病對不同類型土壤細菌群落結構和多樣性變化的影響

2.2.1 細菌α多樣性變化

由圖1可知，黃壤土的Chao1、ACE指數隨發病程度增加呈增加趨勢，且重度發病土壤顯著高于不發病和中度發病土壤，而細菌群落多樣性（Shannon、Simpson）指數在各發病程度間差異不顯著。水稻土中隨黑脛病發病程度加重豐富度（Chao1和ACE）指數變化不顯著，多樣性指數則逐漸下降，且Shannon指數重度發病土壤顯著低于不發病土壤，Simpson指數無顯著差異。

2.2.2 細菌β多樣性變化

主坐標分析（PCoA，基于Bray-curtis距離）下的結果均有顯著差異（P<0.05）。由圖2可知，第1坐標軸和第2坐標軸共能解釋85.99%，黃壤土細菌群落主要分布在二、三象限，而水稻土細菌群落則主要分布在一、四象限。其次，隨發病程度增加，黃壤土和水稻土中沿PCo2軸重度發病土壤細菌群落與不發病土壤和土壤細菌群落顯著分開，而中度發病土壤細菌群落和不發病土壤細菌群落未顯著分開。以上結果表明，黃壤土和水稻土間細菌群落結構存在差異，其次，重度發病煙株根際土壤細菌群落顯著區別于不發病和中度發病煙株根際土壤細菌群落。

2.2.3 細菌門、屬水平群落豐度變化

選取2種土壤細菌群落中豐度TOP10的門水平物種進行比較分析，如圖3-A所示，在黃壤土中，隨發病程度增加，厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度降低，變形菌門（Proteobacteria）相對豐度增加，不發病土壤中放線菌門（Actinobacteria）和髕骨細菌門（Patescibacteria）豐度高于發病土壤。在水稻土中，隨發病程度增加厚壁菌門豐度逐漸升高，變形菌門、擬桿菌門（Bacteroidetes）和綠彎菌門（Chloroflexi）相對豐度逐漸降低。

對細菌屬水平相對豐度TOP10的物種進行分析，如圖3-B所示，黃壤土和水稻土中共有的6個優勢菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）、Clostridium_sensu_stricto_10（未命名，屬于厚壁菌門）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Clostridium_sensu_stricto_12（未命名 屬于厚壁菌門）、 芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、Clostridium_sensu_stricto_1（未命名，屬于厚壁菌門）。在黃壤土中，隨發病程度增加，芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬豐度升高。在水稻土中，隨發病程度增加，芽孢桿菌屬豐度升高，鞘氨醇單胞菌屬、苔蘚桿菌屬（Bryobacter）和芽單胞菌屬相對豐度先增后減。

2.2.4 土壤環境因子與微生物間的冗余分析和方差分解分析

土壤化學性狀指標結合細菌OTU數據矩陣進行冗余分析（RDA）和方差分解分析（variance partitioning analysis，簡稱VPA），結果見圖4。在黃壤土中（圖4-A-1），對細菌群落影響較大的土壤化學性狀指標為有機質含量、堿解氮含量和硝態氮含量，且方差分解分析（圖 4-A-2）表明，有機質含量和硝態氮含量對土壤細菌群落變化的貢獻率較大，分別為1.73%和1.68%，從而說明有機質和硝態氮含量可能是影響黃壤土中土壤細菌群落結構改變的重要非生物因素。在水稻土中（圖4-B-1）有機質、堿解氮、硝態氮和速效鉀含量對細菌群落影響較大，VPA結果表明有機質和硝態氮含量對土壤細菌群落發生變化的貢獻率較大，為影響水稻土中細菌群落結構改變的主要非生物因素。

3 討論

土傳病害的發生往往導致土壤養分的不平衡，而土壤養分平衡是作物健康生長的關鍵［22］。煙草黑脛病為典型的土傳病害，其發生與傳播主要受土壤溫度、濕度、酸堿度及土壤養分等環境因素的影響［23-25］。本研究結果表明，黃壤土中隨黑脛病發病程度增加，SOM和NO-3-N含量逐漸增加，AK含量中度發病最高。而在水稻土中，AP和NO-3-N含量總體呈增加趨勢，SOM及AN含量總體呈先減后增變化，這與方宇等的研究結果［10］基本一致。造成土壤速效養分含量積累的可能原因是，發病植株內部組織結構被破壞，導致植株營養物質運輸受阻，對土壤養分吸收效率降低，造成土壤養分累積［26-27］。有研究表明，有機質含量偏高可能會導致煙草青枯病更加嚴重［28-29］，本研究結果與之類似。土壤中較高的硝態氮含量可以抑制土傳真菌病害的發生［30］，同時也有研究表明，硝態氮可以降低香蕉枯萎病和白菜斑點病的發生［31-32］，而在本研究中，2種類型土壤中硝態氮含量均隨發病程度的加重呈增加的趨勢，可能原因是該環境下病原菌更易獲取營養物質進行生長繁殖對抗具有拮抗作用的根際微生物，加劇了煙株的病害程度，也可能是植株和土壤間相互作用，通過硝態氮累積來抵御病害發生，具體機制還需進一步試驗證明。此外，冗余分析和方差分解分析結果表明，在2種土壤類型下有機質和硝態氮含量對土壤細菌群落變化的貢獻率較大，可能是土壤中影響細菌群落結構發生改變的主要因子。

越豐富的土壤微生物結構，物種的均勻度越高，其擁有的生態系統也較為穩定和平衡，有利于提高作物對病害的抵御［33-34］，而病原微生物的大量生長和繁殖打破了種群平衡機制，導致作物病害的發生。本研究結果表明，黃壤土中Chao1、ACE指數隨發病程度增加呈增加趨勢且重度發病土壤顯著高于不發病和中度發病土壤。可能原因是病害發生后，煙株的正常代謝受到干擾，煙株會通過內生細菌或根系分泌物的改變來進行調節，故煙株根際土壤微生物的種類會隨之發生改變［35］，也可能是增加了有害菌群數量和豐度，從而不利于抵抗病害的發生。水稻土中隨發病程度增加Shannon和Simpson指數呈下降趨勢，這與前人的研究結果［36］相同。此外，PCoA結果表明，2種類型土壤間細菌群落存在差異，在相同土壤類型下重度發病煙株根際土壤細菌群落顯著區別于不發病和中度發病煙株根際土壤細菌群落。以上結果表明，煙株發病會導致根際土壤細菌群落豐富度和多樣性發生改變，且不同土壤類型細菌群落α多樣性變化不一致，煙株發病會顯著影響細菌的群落結構。2種土壤類型的細菌群落結構組成基本相似，但相對豐度存在差異，這與前人的研究結果一致，齊虹凌等的研究表明，不同土壤類型下真菌、細菌、放線菌以及古菌等微生物的生長發育和數量會受到影響［37-38］。本研究結果表明，在黃壤土中，隨黑脛病發病程度增加厚壁菌門豐度降低，變形桿菌門豐度增加，而在水稻土中，隨發病程度增加厚壁菌門豐度逐漸升高，變形桿菌門、擬桿菌門和綠彎菌門豐度逐漸降低。前人研究表明，土壤細菌的變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門在土壤養分充足時表現出較快的生長速度和更高的相對豐度［39-40］。在2種土壤類型下有益菌屬芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、苔蘚桿菌屬［41-43］在中度發病土壤中富集，可能與煙草植株在受到病菌侵染后，為了抵抗這種侵染，在根際募集了大量能夠誘導抗病和促進植物生長的微生物有關［44-45］，這與黎妍妍等對青枯病不同發病階段根際微生物群落變化的研究結果［41］類似。而水稻土黑脛病重度發病土壤中，鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、苔蘚桿菌屬相對豐度有下降趨勢，可能是土壤類型及煙株瀕死導致，具體原因還需進一步試驗驗證。

4 結論

煙草黑脛病的發生會導致根際土壤細菌群落豐富度和多樣性發生改變，且不同土壤類型的細菌群落α多樣性變化不一致。與不發病土壤相比，芽胞桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、苔蘚桿菌屬等有益菌屬相對豐度在中度發病土壤中增加。2種土壤類型下有機質（SOM）和硝態氮（NO-3-N）含量是影響黑脛病發生和土壤細菌群落結構改變的主要非生物因素。

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