高效液相色譜-串聯質譜法測定不同地區釀酒高粱中蜀黍氰苷含量

摘要：基于高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS），建立了一種靈敏度高、快速簡便檢測高粱中蜀黍氰苷含量的方法。高粱樣品經95%甲醇溶液提取，UPLC BEH C18色譜柱分離，采用正離子多反應監測（MRM）模式進行檢測。結果表明，蜀黍氰苷儀器檢出限為1.0 ng/mL，定量限為3.0 ng/mL，在5.0～200.0 ng/mL范圍內呈現良好的線性關系，相關系數R2=0.999 152 6，精密度RSD為2.29%，3個水平加標回收率為94.3%～101.5%。黑龍江、吉林、遼寧、陜西、山西和貴州6個高粱主產省份中，陜西省高粱中蜀黍氰苷平均含量最低，為1.45 mg/kg；吉林省高粱中蜀黍氰苷平均含量最高，為3.50 mg/kg。西南、華北和東北3個高粱主要產區中，西南地區高粱中蜀黍氰苷平均含量最低，為1.84 mg/kg；華北地區高粱中蜀黍氰苷平均含量最高，為3.97 mg/kg。紅纓子和晉雜22兩種優質釀酒高粱的蜀黍氰苷含量均不高。說明不同地區不同品種的高粱蜀黍氰苷含量有所差異，且優質釀酒高粱蜀黍氰苷含量較低。

關鍵詞：高效液相色譜-串聯質譜法；釀酒高粱；蜀黍氰苷

中圖分類號：TS210.7 文獻標志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20240223

Determination of dhurrin content in brewing sorghum from different producing regions by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Han Yuhui1， Xu Guangchao2

（ 1. Anhui Grain and Oil Products Quality Supervision and Testing Station， Hefei， Anhui 230000； 2. Standards and Quality Center of National Food and Strategic Reserves Administration， Beijing 100037 ）

Abstract： A high efficiency， accurate， simple， and convenient method to detect the content of dhurrin in brewing sorghum by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. The sample was extracted by 95% methanol， separated by UPLC BEH C18 column， and then detected by HPLC-MS/MS under multiple reaction monitoring mode （MRM）. The results showed that the limits of detection （LOD） of dhurrin was 1.0 ng/mL， while the limit of quantification （LOQ） was 3.0 ng/mL， and a good linear relationship was shown in the range of 5.0 to 200.0 ng/mL ， with a correlation coefficients （R2） of 0.999 152 6， the relative standard deviations（RSD） was 2.29%， the recovery rate for three levels of spiking ranges from 94.3% to 101.5% Among the six main producing provinces of sorghum in Heilongjiang， Jilin， Liaoning， Shaanxi， Shanxi， and Guizhou， the dhurrin content in brewing sorghum from Shaanxi Province was the lowest （1.45 mg/kg）， and the highest content （3.50 mg/kg） was detected in brewing sorghum from Jilin Province. Among three producing regions of sorghum in Southwest， North China， and Northeast China， the dhurrin content in brewing sorghum from Southwest China was the lowest （1.84 mg/kg）， and the highest content （3.97 mg/kg） was detected in brewing sorghum from North China. The content of dhurrin in two high-quality brewing sorghum varieties， Hongyingzi and Jinza-22， was low. The study indicated content of dhurrin in brewing sorghum varied greatly from different producing regions and varieties with high-quality sorghum having a lower content of dhurrin.

Key words： HPLC-MS/MS； brewing sorghum； dhurrin

高粱是全球第五大谷類作物，產量僅次于小麥、水稻、玉米和大麥[1]。高粱是我國最早栽培的谷類作物之一，主要分布在東北（黑龍江、吉林和遼寧）、華北（山西和內蒙古）和西南（四川、貴州和重慶）3個主要產區[2]。高粱不僅是重要的糧食作物，也是釀造白酒的主要原料，尤其在我國，以高粱作為白酒釀造的原料有近800年的歷史。高粱中不僅含有大量的淀粉、蛋白質和礦物質，而且還含有釀酒所需的一種特殊有機化合物——單寧[3]。適量的單寧可以抑制白酒發酵過程中有害微生物的生長，還能轉化為丁香酸和丁香醛等芳香物質，增加白酒的馥郁度[4]。高粱中還存在一定量的蜀黍氰苷，蜀黍氰苷是一種生氰糖苷，在一定條件下可以分解為對羥基苯甲醛和游離氫氰酸（HCN）[5]，對人類和動物的生命健康具有一定的威脅。不同地區和品種的高粱中普遍檢測出了蜀黍氰苷的存在，且含量差異較大，有研究[6]指出蜀黍氰苷在糯高粱中的平均含量要普遍低于粳高粱。

目前，蜀黍氰苷的檢測方法主要分為直接法和間接法。間接法主要通過檢測糖苷類化合物水解產生的氫氰酸含量從而間接計算出植物樣品中生氰糖苷的含量，包括硝酸銀滴定法[7]、巴比妥酸比色法[8]、苦味酸比色法[9]等。直接法是通過儀器直接測定樣品中蜀黍氰苷的含量，常用的有高效液相色譜-蒸發光散射法（HPLC-ELSD）[10]和高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）[11-12]，HPLC-MS/MS法與HPLC-ELSD相比具有靈敏度高、準確性好、分析時間短等優勢，是現階段測定蜀黍氰苷含量優先選擇的一種方法。

高粱中淀粉、蛋白質、脂質、單寧等營養成分的含量因品種、生長地域、氣候條件和種植技術不同而各有差異，因此釀造出的白酒品質差異較大[13-15]。但是，目前關于釀酒用高粱的安全品質研究較少。蜀黍氰苷作為白酒中可能存在的致癌物質氨基甲酸乙酯的前驅物質[16]，可作為釀酒高粱的一個安全性指標進行研究。本研究擬基于HPLC-MS/MS，建立一種靈敏度高、快速簡便檢測高粱中蜀黍氰苷含量的方法，并選取國內釀酒高粱主產區的新收獲樣品，對其中的蜀黍氰苷進行定量分析，以期為后續不同產地和不同種類高粱中蜀黍氰苷含量的差異性研究提供科學依據，也為探究白酒中可能產生的氫氰酸或氨基甲酸乙酯等有毒物質與不同種類高粱之間的關系提供一定的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜀黍氰苷標準溶液（100 mg/L）：天津阿爾塔科技有限公司；甲醇（LC-MS級）：德國默克公司；甲酸（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗用水（Milli-Q純水儀制備的超純水）：美國密理博公司。

不同產地的高粱樣品：均為2022年度新收獲用于釀酒原料的高粱。

1.2 儀器與設備

LCMS-8050型高效液相色譜-質譜聯用儀：日本島津公司；XA105DU型十萬分之一電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；Multifuge X1R型高速冷凍離心機：美國賽默飛世爾科技公司；3100型錘式旋風實驗磨：瑞典波通儀器公司；TZL-5013型多管旋渦混合儀：蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司；DTA-27型超聲波清洗機：湖北鼎泰生化科技設備制造有限公司）；IKA MS3型渦旋混合儀：德國IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1mm×50 mm）；流動相：0.1% 甲酸水溶液（A）和甲醇溶液（B），梯度洗脫見表1。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL。

1.3.2 質譜條件

離子源：ESI源；掃描方式：正離子掃描；掃描模式：MRM（多反應監測）模式；噴霧電壓：4.0 kV；離子源溫度：400 ℃；霧化氣流量：3.0 L/min；蜀黍氰苷質譜信息見表2。

1.3.3 標準溶液配制

準確吸取一定量的標準物質，用甲醇配置成質量濃度10 mg/L的標準儲備液，-20 ℃條件下保存。實驗時以初始流動相對標準儲備液進行稀釋，配制成質量濃度為5、10、20、50、100、200 ng/mL的標準系列。

1.3.4 樣品制備

參考文獻[6，11]的方法對高粱樣品進行制備。取一定量高粱樣品用研磨機進行粉碎，將粉碎后的樣品混勻。準確稱取混勻的高粱試樣1.5 g（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中，加入20 mL 95%甲醇溶液，超聲20 min后渦旋震蕩10 min，8 000 r/min離心10 min，吸取0.2 mL上清液加入0.6 mL水進行稀釋（可根據高粱試樣中蜀黍氰苷的實際含量調整合適的稀釋倍數），經0.22 μm濾膜過濾后進樣，HPLC-MS/MS分析。

2 結果與討論

2.1 方法條件優化

2.1.1 樣品前處理方法

吳榮等[17]在綜述中指出，高粱樣品采用機械粉碎法比液氮研磨法效果更好。因此，本實驗樣品處理方法采用機械粉碎法。高粱樣品提取溶劑選擇20 mL 95%甲醇水溶液，超聲20 min后輔以10 min的劇烈震蕩即可充分提取樣品中的蜀黍氰苷，純水稀釋4倍后上樣分析。

2.1.2 色譜條件的優化

樣品提取溶劑選擇了95%甲醇溶液，為減少色譜分析過程中可能出現的溶劑效應，本實驗流動相采用水—甲醇體系。水相中加入適量酸能促進化合物電離，提高其響應值和靈敏度。因此選擇0.1% 甲酸水溶液為A相，甲醇為B相。實驗選擇了Waters UPLC BEH C18色譜柱，1.7 μm的粒徑和超高壓的耐受能帶來更好的靈敏度和分離度。流動相的梯度洗脫程序見表1，采用此條件對蜀黍氰苷進行分析，總分析時間為5.0 min，目標物的保留時間為1.88 min，檢測時間大大縮短。

2.1.3 質譜條件的優化

采用液質聯用儀對目標物進行分別進行一級全掃描和二級質譜掃描。蜀黍氰苷相對分子質量為311.3，在ESI正離子模式下掃描到響應較高的兩個母離子為329.1[M+NH4]+和334.1[M+Na]+，見圖1；ESI正離子模式下的312.1[M+H]+和負離子模式下的310.1[M-H]-響應很弱，因此選擇329.1和334.1在正離子模式下進行子離子掃描。在相同條件下，334.1作為母離子不容易裂解且碎片較多較雜，不適合定量；329.1作為母離子在不同的碰撞能量下可得到123.3、132.1、163.1、180.1等碎片離子。最終選擇132.1和180.1作為特征子離子進行定量和定性，其中以響應值最大的子離子為定量離子，優化后的質譜參數見表2。對蜀黍氰苷標準溶液進行分析，得到其MRM模式下的色譜圖，見圖2。

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性方程、檢出限及定量限

按照“1.3.3”配制標準溶液，采用上述分析條件進行測定，以目標物的峰面積（Y）對蜀黍氰苷質量濃度（X）建立標準曲線。得到其線性回歸方程為Y=92.406 0X+49.798 3，相關系數R2=0.999 152 6。結果表明：蜀黍氰苷在5.0～200.0 ng/mL范圍內呈現良好的線性關系。以信噪比S/N≥3確定儀器的檢出限（LOD），S/N≥10確定儀器的定量限（LOQ），得出LOD=1.0 ng/mL，LOQ=3.0 ng/mL。

2.2.2 精密度和準確度

配制質量濃度為50.0 ng/mL的蜀黍氰苷標準溶液，連續進樣6次，以隨行標曲計算其質量濃度，得出這6次結果的平均值為48.50 ng/mL，RSD值為2.29%，準確度為97.0%。結果表明，儀器的精密度良好，準確度高。

2.2.3 加標回收率

本實驗采用標準加入法進行回收率的考察。取1份高粱樣品，按照1.3.4進行樣品處理，測得其蜀黍氰苷含量，然后以此樣品作為本底進行加標。將不同量的標準儲備液加入本底樣品中，按1.3.4處理，上機分析后計算加標回收率。選取3個水平，每個水平做4個平行樣品，結果見表3。從表3可知，高粱中蜀黍氰苷3個水平的加標回收率為94.3%～101.5%，方法的回收率良好。

2.3 不同高粱中蜀黍氰苷含量測定及分析

2.3.1 不同地區高粱中蜀黍氰苷的含量

選取6個高粱主產省份的新收獲樣品，每個省份合理選取多份釀酒用高粱，按照1.3.4進行樣品處理，計算出每個省高粱中的蜀黍氰苷含量，結果見表4。結果表明，來自于不同產地的釀酒高粱中均檢出了一定濃度的蜀黍氰苷，含量范圍在0.54～9.66 mg/kg，差異較為明顯。6個省份中，吉林省收獲的釀酒高粱蜀黍氰苷含量變幅最大為1.60～9.66 mg/kg，黑龍江省收獲的釀酒高粱蜀黍氰苷含量變幅最小為1.53～3.34 mg/kg。6個省份釀酒高粱中，陜西省高粱中蜀黍氰苷平均含量最低，為1.45 mg/kg；吉林省高粱中蜀黍氰苷平均含量最高，為3.50 mg/kg。

本實驗對不同產區MR3v/w4fsku0ETc6lpDjNA==高粱中蜀黍氰苷含量進行了對比，其中西南地區選擇了四川省、貴州省和重慶市3地收獲的15份高粱樣品，華北地區選擇了山西省和內蒙古自治區的23份高粱樣品，東北地區選擇了黑龍江省、吉林省和遼寧省3地收獲的65份高粱樣品，檢測結果見圖3。從圖3可以看出，西南地區高粱中蜀黍氰苷平均含量最低（1.84 mg/kg），華北地區高粱中蜀黍氰苷平均含量最高（3.97 mg/kg）。不同產區的地理位置、氣候條件、種植方式等因素都可能會對高粱中蜀黍氰苷含量產生影響，目前并沒有明確的結論指出不同因素的影響大小，還有待繼續進行研究。

2.3.2 不同品種高粱中蜀黍氰苷的含量

實驗選取釀酒常用的紅纓子和晉雜22這兩個品種高粱，測定其蜀黍氰苷含量，每個品種各測12份，結果見圖4。由圖4可知，紅纓子和晉雜22中蜀黍氰苷含量均不高，其中晉雜22中的蜀黍氰苷含量較紅纓子略低，分別為1.50 mg/kg和1.34 mg/kg。紅纓子和晉雜22均為優質釀酒用高粱品種[18]，其中紅纓子主要產區為貴州省，常作為醬香型白酒的釀造原料；晉雜22主要產區為山西省，常作為清香型白酒的釀造原料。目前，我國優質釀酒高粱還有很多品種，本研究僅選取了紅纓子和晉雜22作為檢測樣本，對不同產地的同一品種進行了初步的對比，后續還將會增加釀酒高粱的品種作為研究樣本，并對同一產地不同品種、同一品種不同產地的優質高粱品種進行更深入系統的研究，以期探明高粱中蜀黍氰苷的含量差異，為白酒釀造原料的選擇提供參考。

2.3.3 其他因素對高粱中蜀黍氰苷含量的影響

近幾年來，關于高粱中蜀黍氰苷的研究較為火熱，但主要集中在產地和品種這兩大影響因素上面，然而高粱收獲后可能不會立即開始釀酒，還需要進行適當的儲藏保管，本研究后續將從高粱的儲藏條件出發，對不同儲藏方式、儲藏技術等環節下高粱蜀黍氰苷的含量進行測定，探究儲藏條件的不同是否會影響高粱中蜀黍氰苷的含量變化。

3 結 論

本文基于高效液相色譜-串聯質譜法（HPLCMS/MS），建立了一種靈敏度高、快速準確檢測高粱樣品中蜀黍氰苷含量的方法，并選取了2022年不同地區、不同品種的釀酒高粱作為研究樣本，對其蜀黍氰苷含量進行了檢測和對比。研究表明，不同省份、不同產區的釀酒高粱中蜀黍氰苷含量具有明顯差異，以貴州省為代表的西南地區收獲的高粱蜀黍氰苷含量普遍低于東北和華北地區。優質釀酒高粱品種紅纓子和晉雜22均檢測出了較低含量的蜀黍氰苷，說明以這兩種高粱作為釀酒原料可能會產生更低濃度的氫氰酸或氨基甲酸乙酯等有毒物質，從而降低白酒的潛在安全風險。對于除產地、品種之外的因素對釀酒高粱中蜀黍氰苷含量的影響還有待進一步研究。

參 考 文 獻

[1] 范國華，郭瑞峰.高粱深加工產品的應用現狀研究[J].糧食科技與經濟，2020，45（3）：145-148.

[2] 李順國，劉猛，劉斐，等.中國高粱產業和種業發展現狀與未來展望[J].中國農業科學，2021，54（3）：471-482.

[3] 鄒劍秋，朱凱，張志鵬，等.國內外高粱深加工研究現狀與發展前景[J].雜糧作物，2002，22（5）：296-298.

[4] 常強，吳再節，孫偉，等.不同單寧含量在濃香白酒生產中的應用研究[J].釀酒科技，2022（5）：47-51+55.

[5] MILLER R E， TUCK K L. The rare cyanogen proteacin， and dhurrin， from foliage of Polyscias australiana， a tropical Araliaceae[J]. Phytochemistry，2013，93（5）：210-215.

[6] 張順榮.白酒中氨基甲酸乙酯形成的氰化物途徑研究[D].無錫：江南大學，2016：17.

[7] 趙勝男.亞麻餅粕營養掛面及沖調粉的研制[D].天津：天津科技大學，2017：14.

[8] HASKINS F A， GORZ H J， HILL R M. Colorimetric determination of cyanide in enzyme-hydrolyzed extracts of dried sorghum leaves[KBhBAZgZ/6Y0FOIl0Pwqm30SkHmV1DFZAIcAH+p63Xo=J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1988，36（4）：775-778.

[9] 周小潔，車向榮，于霏.亞麻籽及其餅粕的營養學和毒理學研究進展[J].飼料工業，2005（19）：46-50.

[10] 劉錦宜，王文林，陳海生，等.澳洲堅果各部位蜀黍苷含量的測定[J].食品工業科技，2018，39（23）：282-285+292.

[11] 周韓玲，安明哲，李楊華，等.高效液相色譜-串聯質譜法測定高粱中蜀黍苷的含量[J].釀酒科技，2020（5）：78-82+86.

[12] CASTADA H Z， LIU J Y， BARRINGER S A， et al. Cyanogenesis in macadamia and direct analysis of hydrogen cyanide in Macadamia flowers， leaves， husks and nuts using selected ion flow tube–mass spectrometry[J]. Foods，2020， 9（2）：174.

[13] 時偉，鄭紅梅，柴麗娟，等.酒用高粱的營養成分及其釀造性能研究進展[J].食品與發酵工業，2022，48（21）：307-317.

[14] 葉力，鄧莉川，劉沛通，等.釀酒高粱及新型釀酒原料研究進展[J].農產品加工，2023（2）：80-83.

[15] 張小娜，余安玲，董若蘭，等.高粱品種對白酒發酵的影響[J].食品與發酵工業，2023，49（9）：96-102.

[16] 周韓玲，安明哲，趙東，等.高粱中蜀黍氰苷與濃香型白酒中氰化物及氨基甲酸乙酯關系的研究[J].中國釀造，2022，41（10）：25-29.

[17] 吳榮，牛江帥，巖溫香，等.高粱蜀黍苷的研究進展[J].中國糧油學報，2021，36（12）：172-178.

[18] 王勁松，董二偉，武愛蓮，等.不同香型白酒釀造高粱養分需求規律[J].山西農業科學，2016，44（7）：977-980+983.