糧食中玉米赤霉烯酮含量測定的前處理方法優化

摘要：優化GB 5009.209—2016高效液相色譜法前處理過程，建立新的糧食中玉米赤霉烯酮含量的高效液相色譜測定方法。樣品經乙腈-水（V乙腈：V水=4∶1）調速振蕩器提取，免疫親和柱富集凈化，甲醇洗脫后，直接用水稀釋定量至2.00 mL，采用 C18反相色譜柱 （150 mm×4.6 mm，5.0 μm），在10～500 ng/mL的質量濃度范圍內線性關系良好，其相關系數R2為0.999，檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為3.8 μg/kg、12.8 μg/kg，3個濃度水平加標回收率為94.3%～106.3%，精密度為0.8%～6.1%，連續4天的基質加標回收率為96.7%～104.8%，日間精密度為0.8%～4.3%，高效液相色譜可以很好地對糧食中玉米赤霉烯酮進行快速準確定量分析。經驗證該方法與國標方法檢測結果無顯著性差異。與國標相比，尤其是本方法通過去除氮吹、省去流動相復溶步驟可實現快速、簡便、批量檢測，提高了工作效率。

關鍵詞：糧食；玉米赤霉烯酮；高效液相色譜；免疫親和柱；前處理

中圖分類號：TS212.7 文獻標志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20240224

Optimization of pre-treatment method for determining the content of zearalenone in food

Tang Linghui， Yang Zhengfei

（ Yongzhou Food Quality and Safety Supervision， Inspection and Testing Center， Yongzhou， Hunan 425000 ）

Abstract： Optimization of the pretreatment process of high-performance liquid chromatography in GB 5009.209—2016， and the establishment of a new high-performance liquid chromatography method for the determination of Zearalenone in grain. The samples were extracted by（Vacetonitrile：Vwater=4∶1 ）speed-regulating oscillator， enriched and purified by an immunoaffinity column， and eluted with methanol. The eluate was then diluted and quantified to 2.00 mL with water directly， analyzed using a C18 reversed-phase chromatographic column （150 mm×4.6 mm， 5.0μm）. The linear relationship was good within the mass concentration range of 10-500 ng/mL， with a correlation coefficient （R2） of 0.999. The detection limit （LOD） was 3.8 μg/kg， and the quantitative limit （LOQ） was 12.8 μg/kg， the recoveries were 94.3%～106.3%， the precision was 0.8%～6.1% ， the recoveries were 96.7%～104.8%， the daytime precision was 0.8%～4.3%. The high-performance liquid chromatography can be used for rapid and accurate quantitative analysis of Zearalenone in grains. Compared with the national standard method， there was no significant difference. Especially， the method can realize rapid， simple， and batch detection by removing nitrogen blowing and removing the steps of mobile phase re-dissolving， thus improving the working efficiency.

Key words： grains； zearalenone； high-performance liquid chromatography； immunoaffinity； pretreatments

玉米赤霉烯酮主要由鐮刀菌屬株產生，其成分為粉紅鐮刀菌、禾谷鐮刀菌等產生的2，4-二羥基苯甲酸內酯類化合物[1]。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、麥類、高粱等農作物，具有很強的雌性激素作用，可引起嚴重的生殖道癥及不孕癥，還具有免疫毒性和遺傳毒性，有潛在的致癌風險，是倉儲糧食中常見的一種真菌毒素污染物[2-3]。

目前，測定糧食中玉米赤霉烯酮含量的主要方法為液相色譜法、高效液相色譜液質聯用法等[4-9]。本研究結合自身多年從事真菌毒素的檢測與研究，提出對國家標準GB 5009.209-2016《食品安全國家標準 食品中玉米赤霉烯酮的測定》[10]中第一法液相色譜法的前處理過程進行優化改進的建議，通過增加對試樣采樣量和制備的要求、降低料液比和提取液乙腈濃度、采用調速振蕩浸提設備、去除氮吹、省去流動相復溶等方面進行優化，探索出一條既與國標方法檢測結果無顯著性差異，又能快速簡便、靈敏度高、操作安全、可實現批量檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；HY-4A型調速振蕩器：常州澳華儀器有限公司；玉米赤霉烯酮免疫親和柱：（柱容量為2 000 ng），北京華安麥科生物技術有限公司；甲醇中玉米赤霉烯酮溶液標準物質：20.52±0.25 μg/mL，國家糧食和物資儲備局科學研究院；玉米粉中玉米赤霉烯酮分析質控樣品：92±19 μg/kg，北京美正檢測技術有限公司；甲醇（色譜純）：德國默克公司；乙腈（色譜純）：德國默克公司。

1.2 試樣制備

采樣量需大于1 kg，玉米、小麥等谷物及其制品直接粉碎，過篩，并過2 mm實驗篩，混合均勻，放置備用。

1.3 優化的試樣提取

稱取20±0.01g試樣置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL提取液（V乙腈：V水=4∶1）混勻，調速振蕩器（200～300 r/min）劇烈振蕩20 min，靜止后，過濾并收集濾液。

采用移液管準確移取10.0 mL濾液置于100 mL錐形瓶中，加入40.0 mL去離子水稀釋，再用微纖維濾紙過濾并收集濾液，作為免疫親和柱凈化上樣液備用。

1.4 優化的親和柱凈化

取出免疫親和柱，放置室溫平衡后，免疫親和柱上端與一次性注射器（25 mL）固定，下端去掉塞子后，待保護液流盡前，準確移取25.0 mL上樣液，保持重力作用自然流下；待液體排干后，用10 mL去離子水洗滌2次；用洗耳球排盡免疫親和柱內液體，準確移取1.00 mL甲醇（色譜純）洗脫玉米赤霉烯酮，并用去離子水稀釋定量至2.00 mL，混勻后用0.22 μm微孔濾器過濾，置于樣品瓶待測。

1.5 優化的玉米赤霉烯酮標準溶液配制

取質量濃度為20.52±0.25 μg/mL玉米赤霉烯酮標準溶液，加入甲醇—水溶液（V甲醇∶V水= 2∶1）稀釋，將其依次配制成質量濃度為10、20、30、60、100、200、500 ng/mL的玉米赤霉烯酮標準工作液。

1.6 色譜條件

色譜柱分析柱：C18 柱，5.0 μm，150 mm×4.6 mm；流動相：水—甲醇—乙腈溶液（V水∶V甲醇∶V乙腈= 23∶4∶23）；進樣量：100 μL；熒光檢測波長：激發波長274 nm，發射波長440 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃。

2 結果與討論

2.1 前處理方法的優化

與GB 5009.209-2016《食品安全國家標準 食品中玉米赤霉烯酮的測定》檢測方法相比，本方法增加了對試樣采樣量和制備的要求，需大于1kg，且全粉碎后使其至少通過粒徑小于2 mm孔徑實驗篩。因為通過多年的糧油檢測工作證實，真菌毒素準確分析中的決定性因素、最大的誤差來源是樣品的扦樣與制備，這也與相關文獻報告一致[11]。其次，本方法檢測樣品由40 g降低為20 g，且提取液中乙腈體積分數由90%優化為80%，降低了料液比和提取液乙腈濃度，不僅可以增加提取效果，而且可以減小較大比例的乙腈對親和柱上抗體的破壞。再者，將浸提設備均質器更換為調速振蕩器，調速振蕩器價格便宜且便于操作，延長提取時間至20 min，保證玉米赤霉烯酮的充分提取。最后，在國標中采用流動相水—甲醇—乙腈溶液（V水∶V甲醇∶V乙腈=23∶4∶23）稀釋配制玉米赤霉烯酮標準工作液，并且為了使前處理后的樣品溶劑濃度與標準工作液保持一致，洗脫下的樣液經55℃以下氮吹，再用流動相復溶，而本優化的方法是采用甲醇—水溶液（V甲醇∶V水=2∶1）稀釋配制玉米赤霉烯酮標準工作液，在加入甲醇洗脫后，采用水直接稀釋定量至2.00 mL，去除氮吹步驟，既減小了損失的可能性，又節省了時間，提高了工作效率。其2種方式下稀釋配制的各濃度梯度保留時間和峰面積見下表1，并以60 ng/mL質量濃度2種方式下的色譜圖為例，見圖1。結果發現采用甲醇—水溶液（V甲醇∶V水=2∶1）直接定容，其色譜峰面積稍大，從而檢測靈敏性更高。可見，去除氮吹、省去流動相復溶步驟完全滿足對糧食中玉米赤霉烯酮含量的測定。

2.2 線性關系、檢出限和定量限

采用確定的液相色譜條件，對配制所得的玉米赤霉烯酮標準工作液（10～500 ng/mL）依次進行分析。在10～500 ng/mL的濃度范圍內呈現良好線性關系，其線性方程為If = 0.018 4×c+0.005 5，相關系數R2為0.999。通過液相色譜軟件計算，以基線噪聲3倍峰面積確定方法的檢出限，以基線噪聲10倍峰面積確定方法的定量限，得玉米赤霉烯酮的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為3.8 μg/kg、12.8 μg/kg，本方法檢出限和定量限均低于國家標準，能完全滿足糧食中玉米赤霉烯酮的測定需求。

2.3 方法的回收率與精密度

選取不含玉米赤霉烯酮的空白玉米樣品稱取20.00g，分別添加玉米赤霉烯酮標準溶液致使試樣含有20、60、180 μg/kg（添加量當量）等3個濃度水平，混勻，放置60 min以上，使其達到平衡，再采用本文中優化的前處理方法進行回收率與精密度測定，每個添加水平作3次平行，其結果見表2。從回收率與精密度數據可以看出，本方法測定玉米赤霉烯酮的回收率全部在94.3%～106.3%，3個濃度水平分別添加3次重復測定的精密度為0.8%～6.1%，基本滿足糧食中玉米赤霉烯酮定量檢測對回收率與精密度的要求。

2.4 日間精密度

選取不含玉米赤霉烯酮的空白玉米樣品稱取20.00g，添加玉米赤霉烯酮標準溶液致使試樣含60 μg/kg（添加量當量），作3平行，再采用本文中優化的前處理方法進行連續4天日間精密度測定，其結果見表3。結果顯示連續4天的加標回收率范圍為96.7%～104.8%，其日間精密度為0.8%～4.3%。可見，本方法對糧食中玉米赤霉烯酮的測定具有良好的重現性。

2.5 實際樣品測試及方法比對

分別對6份玉米樣（樣品編號為：1～6號）、3份小麥樣（樣品編號為：7～9號）、3份玉米粉樣（樣品編號為：10～12號），其中第12號為玉米粉中玉米赤霉烯酮分析質控樣：（92±19） μg/kg和1份面條樣（樣品編號為：13號）應用本實驗改進的前處理方法和國標法進行比對檢測，計算2種前處理方法測定結果的精密度，并采用t檢驗，評價其測定結果是否一致，結果見表4。2種前處理方法測定結果的精密度均滿足國標要求（精密度<15%）；經t檢驗分析，2種前處理方法測定結果無顯著性差異（P>0.05），因此，本方法可用于大批量糧食中玉米赤霉烯酮含量的檢測。

3 結 論

本研究通過增加試樣采樣量和制備的要求、降低料液比和提取液乙腈濃度、采用調速振蕩器浸提設備、去除氮吹、省去流動相復溶等玉米赤霉烯酮測定前處理方法的優化，測得的玉米赤霉烯酮含量與國標方法無顯著性差異；采用本方法測定玉米赤霉烯酮含量，其保留時間穩定且峰形良好，可以很好地對糧食中玉米赤霉烯酮進行快速定量分析，在10～500 ng/mL范圍內呈現線性關系良好，其相關系數為0.999，檢出限和定量限分別為3.8 μg/kg、 12.8 μg/kg，3個濃度水平加標回收率為94.3%～106.3%，精密度為0.8%～6.1%，連續4天的基質加標回收率為96.7%～104.8%，日間精密度為0.8%～4.3%。尤其是本方法通過去除氮吹、省去流動相復溶步驟可實現快速簡便檢測，提高了工作效率，降低實驗人員與玉米赤霉烯酮、有機試劑等有害物質長時間接觸的風險，并為基層實驗室大批量快速準確測定糧食中玉米赤霉烯酮提供了方法[12]。

參 考 文 獻

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