我國未批準的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系雙重數(shù)字PCR精準定量檢測方法建立

摘要：隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在農(nóng)產(chǎn)品國際貿(mào)易中的比重不斷增加，因混雜少量目的國未批準品系而引發(fā)的低水平混雜事件日益凸顯。為了應(yīng)對低含量轉(zhuǎn)基因成分的精準定量檢測需求，針對我國未批準、國際上已經(jīng)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系，建立了雙重數(shù)字PCR定量檢測方法。對5套不同油菜內(nèi)源基因與MS11品系檢測引物探針組合進行篩選，選出相互抑制效應(yīng)低、反應(yīng)效率高、內(nèi)源基因單拷貝、數(shù)字PCR陽性微滴單元與陰性微滴單元區(qū)分明顯的引物探針組合。后對PCR反應(yīng)退火溫度、引物探針濃度等進行優(yōu)化。在篩選出適宜的引物探針組合，以及優(yōu)化后的反應(yīng)條件基礎(chǔ)上，對反應(yīng)體系的特異性、可重復(fù)性和定量精密度、靈敏度、定量準確性等進行測試。篩選和優(yōu)化結(jié)果表明，油菜內(nèi)源基因PEP與MS11品系引物探針組合在退火溫度為58 ℃，引物探針比為1.5 ∶1.0時，反應(yīng)效率最高。方法特異于轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系檢測，在其他轉(zhuǎn)基因作物品系和非轉(zhuǎn)基因作物中無顯著擴增。從10拷貝/μL到 8 000拷貝/μL 3個數(shù)量級的DNA模板各重復(fù)間測定絕對拷貝數(shù)和百分比含量的相對標(biāo)準偏差均在可接受范圍內(nèi)，可重復(fù)性和定量精確度高。方法的檢測下限低至2拷貝/μL，定量下限為10拷貝/μL基因組DNA。對10%、2.0%、0.5%和0.1% 4個MS11品系成分含量樣品定量結(jié)果表明，測定值與設(shè)定值間的偏差（bias）均在±25%之間，定量準確性高。結(jié)論表明，建立的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系雙重數(shù)字PCR精準定量方法適用于對低含量MS11品系成分的精、準定量，可以滿足口岸對低水平混雜問題的應(yīng)對需求。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因油菜；MS11品系；數(shù)字PCR；定量；低水平混雜

中圖分類號：TS207 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）16-0045-08

油菜是一種重要的經(jīng)濟作物，也是我國第一大油料作物，其在油脂、蔬菜、花粉、蜂蜜、飼料生產(chǎn)等方面均具有利用價值，還兼具觀賞價值，因此在國際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中占有重要地位［1］。油脂類產(chǎn)品的穩(wěn)定、有效供給是保障我國食品安全的重要組成部分［2］。但由于國內(nèi)油脂類產(chǎn)品需求旺盛，國內(nèi)生產(chǎn)遠遠滿足不了市場需要，因此我國油菜籽、菜籽油、菜籽粕進口量長期保持在高位，是全球第二大油菜籽進口國，主要來自加拿大、俄羅斯、澳大利亞、烏克蘭等國，其中2016—2020年從加拿大進口油菜籽占比超過90%，而加拿大、澳大利亞的轉(zhuǎn)基因油菜覆蓋率已超過90%［1-3］。

根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織的數(shù)據(jù)，截至2019年底，全球轉(zhuǎn)基因油菜種植面積達1 010萬hm2，占油菜總種植面積的27%，主要分布在加拿大、美國、澳大利亞和智利［4］。全球共有15個國家/地區(qū)批準了45個轉(zhuǎn)基因油菜品系（包括復(fù)合品系）作為食物、飼料、加工和種植用途。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部自2002年起相繼批準了10個轉(zhuǎn)基因油菜品系進口用作加工原料。MS11品系是拜耳作物科學(xué)公司研發(fā)的賦予草銨膦除草劑耐受性和授粉控制系統(tǒng)（雄性不育和恢復(fù)系）的轉(zhuǎn)基因油菜品系，自2017年起相繼在美國、加拿大、澳大利亞批準種植，并在7個國家批準食用和飼用，但我國尚未批準MS11品系的進口，是口岸重點監(jiān)控的品系之一［5］。

在轉(zhuǎn)基因作物的監(jiān)管上，全球已有數(shù)十個國家/地區(qū)實施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標(biāo)識管理制度，并設(shè)定標(biāo)識閾值，因此建立有效的轉(zhuǎn)基因作物定量檢測方法至關(guān)重要。同時，隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在國際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中的比重不斷增加，因低水平混雜（LLP）問題導(dǎo)致的貿(mào)易中斷風(fēng)險不斷提升［6］。國際食品法典委員會（CAC）、經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）以及美國、歐盟等國家和地區(qū)均認為LLP是在進出口農(nóng)產(chǎn)品中混雜了在其他國家/地區(qū)通過安全評價的轉(zhuǎn)基因成分，卻無意、少量地存在于尚未批準的國家/地區(qū)的貨物中［7-10］。由于各國/地區(qū)針對LLP設(shè)定的閾值一般在0.1%～1.0%之間，對食用和種用作物采取零容忍政策，因此建立和完善我國未批準轉(zhuǎn)基因作物品系的精準定量檢測方法，制定相關(guān)技術(shù)標(biāo)準，從而實現(xiàn)低轉(zhuǎn)基因成分含量的準確、有效定量，對應(yīng)對國際貿(mào)易中的LLP現(xiàn)象，保障轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度的順利實施具有重要意義。為此，本研究基于可不依賴于標(biāo)準物質(zhì)和標(biāo)準曲線而進行絕對定量的微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，建立我國未批準進境的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系雙重精準定量檢測方法，制定技術(shù)標(biāo)準，以期為保障國際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易順暢提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)基因油菜（Brassica napus）MS11、GT73、MS1、RF2、RF3、Topas19/2、T45和Oxy235品系，轉(zhuǎn)基因大豆（Glycine max L.）MON89788品系標(biāo)準物質(zhì)購自美國油脂化學(xué)家協(xié)會（American Oil Chemists Society，AOCS）。轉(zhuǎn)基因玉米（Zea mays L.）GA21品系，轉(zhuǎn)基因棉花（Gossypium hirsutum L.）GHB119品系標(biāo)準物質(zhì)購自歐盟聯(lián)合研究中心標(biāo)準物質(zhì)與測量研究所（The JRCs Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM）。轉(zhuǎn)基因苜蓿（Medicago sativa）J163品系來自國家標(biāo)準樣品庫（編號：GSB 11—3645—2019）。轉(zhuǎn)基因水稻（Oryza sativa）TT51品系、非轉(zhuǎn)基因大豆以及非轉(zhuǎn)基因油菜樣品由筆者所在實驗室儲備。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取和純化 除部分基因組DNA標(biāo)準物質(zhì)外，其他標(biāo)準物質(zhì)或樣品干粉采用DNeasy mericon Food Kit（REF：69514，德國Qiagen GmbH公司）進行核酸提取和純化。采用Nanovue Plus微量分光光度計（美國通用電氣公司）對提取的各樣品DNA溶液進行濃度測定，并記錄D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm，以判定提取的基因組DNA質(zhì)量。DNA稀釋至100 ng/μL保存。

1.2.2 不同百分含量樣品制備 為了對建立的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系雙重數(shù)字PCR定量檢測方法的定量準確度和精確度進行測試，采用同等濃度MS11品系DNA與非轉(zhuǎn)基因油菜基因組DNA進行混合的方式，制備含有0.1%、0.5%、2.0%和10.0% MS11品系含量的樣品。在配制前，對轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系DNA與非轉(zhuǎn)基因油菜基因組DNA進行了DNA濃度的多次測定，取平均值進行計算。后按照比例進行DNA混合。10% MS11成分含量的樣品是取20 μL 50% MS11品系標(biāo)準物質(zhì)DNA，與 80 μL 非轉(zhuǎn)基因油菜DNA溶液進行充分混勻；2%含量的樣品則取20 μL 10%含量的樣品DNA與 80 μL 非轉(zhuǎn)基因油菜DNA混合均勻；0.5%含量的樣品是將25 μL 2%含量的樣品DNA加入75 μL非轉(zhuǎn)基因油菜DNA溶液中配制而成；0.1%含量的樣品是通過20 μL 0.5%含量的DNA與80 μL非轉(zhuǎn)基因油菜DNA混合而來。

1.2.3 引物和探針篩選 考慮到2對引物、探針的匹配度、相互干擾、擴增效率、熒光信號和本底信號強弱等方面均對雙重數(shù)字PCR反應(yīng)的擴增效果影響較大，因此對引物、探針進行系統(tǒng)化的篩選和優(yōu)化。進行篩選的引物、探針序列見表1，油菜內(nèi)源基因共5個，包括CruA、CCF、FatA、HMG和PEP，內(nèi)源基因采用HEX熒光通道，MS11品系特異性序列采用FAM熒光通道。引物及探針由寶生物工程（大連）有限公司合成并純化，并稀釋至10 μmol/L備用。采用實時熒光PCR進行雙重擴增引物探針的初步篩選，對于相互抑制較低的組合再采用數(shù)字PCR進行引物探針的篩選。實時熒光PCR擴增采用賽默飛世爾科技公司AB ViiA7型熒光定量PCR儀完成。反應(yīng)體系為：2×Real-time PCR Mastermix（美國賽默飛世爾科技公司）12.5 μL，內(nèi)源基因和MS11品系上下游引物終濃度為400 nmol/L，探針終濃度為200 nmol/L，DNA模板2 μL，無DNA酶和RNA酶的水補足至總體積25 μL。反應(yīng)條件為 50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

1.2.4 反應(yīng)體系篩選及優(yōu)化 為了提升數(shù)字PCR反應(yīng)陽性微滴單元與陰性微滴單元的區(qū)分度，降低介于二者之間的中等信號強度微滴單元，對數(shù)字PCR退火和延伸溫度、引物與探針濃度進行優(yōu)化和測試。采用同等濃度的引物、探針以及數(shù)字PCR擴增體系，設(shè)置溫度梯度52～62 ℃，8個孔溫度分別為52.0、52.7、53.9、55.8、58.1、60.0、61.2、 62.0 ℃，共8個PCR擴增反應(yīng)， 進行雙重數(shù)字PCR擴增退火和延伸溫度的篩選。設(shè)置4個內(nèi)源基因與MS11品系特異性序列引物、探針濃度比，包括 MS11 ∶內(nèi)源=1 ∶0.75，MS11 ∶內(nèi)源=1 ∶1，MS11 ∶內(nèi)源=1 ∶1.2，MS11 ∶內(nèi)源=1 ∶1.5組合，每個濃度比擴增反應(yīng)重復(fù)2次，對雙重數(shù)字PCR擴增的引物、探針濃度進行篩選。

1.2.5 微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 反應(yīng)總體積為20 μL，其中2× ddPCR Supermix for Probes（no dUTP）10 μL（美國伯樂公司）；MS11品系上下游引物終濃度為500 nmol/L，探針濃度為 250 nmol/L，內(nèi)源基因引物、探針終濃度根據(jù)篩選比例進行計算；DNA模板2 μL；剩余體積用無DNA酶和RNA酶的水補足。

將所有試劑以及DNA模板充分混勻后使用微滴發(fā)生器將20 μL混合液分散到約 20 000個微滴中，實現(xiàn)反應(yīng)間的物理隔離。反應(yīng)條件設(shè)定為95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，退火溫度1 min，40 個循環(huán)；98 ℃ 10 min。反應(yīng)后在QX200型微滴分析儀（美國伯樂公司）上進行熒光信號收集、讀取，采用儀器自帶的分析軟件進行結(jié)果計算和分析，獲得每個反應(yīng)孔微滴生成數(shù)、陽性微滴數(shù)，換算得到樣品的絕對拷貝數(shù)濃度。

1.2.6 方法特異性測試 以15種常見的轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因植物材料，包括轉(zhuǎn)基因油菜MS11、GT73、MS1、RF2、RF3、Topas19/2、T45、Oxy235品系，轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系，轉(zhuǎn)基因苜蓿J163品系，轉(zhuǎn)基因棉花GHB119品系，轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系，轉(zhuǎn)基因水稻TT51品系，非轉(zhuǎn)基因大豆以及非轉(zhuǎn)基因油菜為模板，采用雙重實時熒光PCR方法擴增，測試方法的特異性。

1.2.7 可重復(fù)性測試和定量精密度測定 對建立的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系雙重數(shù)字PCR方法的可重復(fù)性、定量精密度進行測試。將含量為50%左右的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系的標(biāo)準物質(zhì)DNA溶液（100 ng/μL），用0.1×TE緩沖液（含Tris-HCl，EDTAoNa，pH值為8.0）稀釋至10、2、1、0.5、0.1、0.05、0.025 ng/μL 7個濃度。根據(jù)1 ng核酸約相當(dāng)于829拷貝油菜單倍體基因組DNA進行換算，上述DNA濃度分別對應(yīng)8 294、1 659、829、414、82、41、20拷貝/μL油菜基因組DNA。采用上述7個濃度DNA進行雙重數(shù)字PCR擴增，每個濃度重復(fù)4次，然后分別計算各重復(fù)間的標(biāo)準偏差（standard deviation，SD）和相對標(biāo)準偏差（relative standard deviation，RSD），同時計算各濃度測定的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系百分含量。

1.2.8 靈敏度測試 將轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系DNA稀釋至10、2拷貝/μL，對建立的雙重數(shù)字PCR方法的檢測下限（limit of detection，LOD）和定量下限（limit of quantification，LOQ）進行測定。LOD和LOQ是在95%置信水平下，能夠分別準確檢測、準確定量的最低濃度水平［11］。每個核酸濃度設(shè)置2組平行試驗，每組平行試驗重復(fù)8次。計算各重復(fù)間的標(biāo)準偏差SD和相對標(biāo)準偏差（%，RSD）。

1.2.9 定量準確性測定 采用分別含有0.1%、0.5%、2.0%和10% 轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系含量的樣品測試雙重數(shù)字PCR方法的定量準確性。每個樣品平行重復(fù)擴增4次。根據(jù)數(shù)字PCR絕對定量獲得的PEP基因和MS11品系特異性序列拷貝數(shù)，按照GB/T 19495.5—2018《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）檢測方法》中的公式分別計算轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系百分含量［12］。進行統(tǒng)計分析，得出各重復(fù)間的SD、RSD，以及測定值與設(shè)定值間的偏差（bias），分析方法的定量準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)體系篩選和優(yōu)化

為了降低加樣誤差對數(shù)字PCR定量檢測結(jié)果的影響，提高定量準確性，本研究采用雙重數(shù)字PCR方法，使油菜內(nèi)源基因與MS11品系特異性序列在同一反應(yīng)體系中檢測［13］。雙重數(shù)字PCR需要對反應(yīng)體系進行系統(tǒng)的優(yōu)化，以保證2對引物、探針間相互抑制效應(yīng)最低化，保證定量結(jié)果的可靠性。本研究對引物探針組合及其濃度比、反應(yīng)退火溫度進行了篩選和優(yōu)化。采用5個油菜內(nèi)源基因分別與MS11品系特異性序列組合進行擴增，篩選因素包括擴增效率、雙重互相抑制情況和匹配度，以及該內(nèi)源基因在油菜單倍體基因組中的拷貝數(shù)等。

雙重實時熒光PCR擴增結(jié)果見圖1。5組擴增圖相比，MS11品系的擴增曲線差別不大，但內(nèi)源基因擴增曲線差別較大。FatA基因的擴增曲線明顯滯后于MS11，相差4個CT值左右，說明雙重擴增有相互抑制（圖1-D），其他4個內(nèi)源基因的擴增曲線與MS11基本重合。進一步對4個內(nèi)源基因進行雙重數(shù)字PCR擴增。結(jié)果顯示，擴增的總微滴數(shù)在 12 336～14 975之間，可以進一步進行分析。CruA、PEP、HMG和CCF 4個內(nèi)源基因測定拷貝數(shù)分別為11 880、6 260、6 000、12 490，測定的MS11品系拷貝數(shù)分別為2 690、2 930、2 860、2 870。因MS11品系標(biāo)準物質(zhì)的百分含量約為50%左右，而MS11品系特異性序列拷貝數(shù)與CruA、CCF基因拷貝數(shù)比為0.20～0.25之間，表明CruA、CCF基因在油菜單倍體基因組中為多拷貝基因。從熒光值來看，PEP基因陰性微滴單元熒光值在2 000附近，陽性微滴單元熒光值在6 000～7 000附近；HMG基因陰性微滴單元熒光值在1 000和2 000各有1簇，陽性微滴單元熒光值在5 000～6 000附近。MS11品系特異性序列在與PEP進行組合時熒光值最高，表明受抑制最低。因此，PEP與MS11組合反應(yīng)效率更高，陽性微滴與陰性微滴單元差值最大，更加容易進行區(qū)分，絕對定量值更加準確。因此，采用PEP與MS11組合進一步進行數(shù)字PCR定量檢測方法的反應(yīng)條件優(yōu)化。

對ddPCR反應(yīng)溫度進行優(yōu)化，結(jié)果見圖2。在58 ℃退火和延伸溫度條件下，PEP基因和MS11品系特異性序列的陽性微滴更加集中、熒光值更高，陽性微滴與陰性微滴區(qū)分更加明顯，擴增效率更好。比較PEP基因與MS11品系引物探針4種濃度比組合的擴增結(jié)果，當(dāng)引物探針濃度比為 MS11 ∶PEP=1 ∶1.5時，2個目標(biāo)的反應(yīng)效率、陰陽性微滴區(qū)分度等最優(yōu)。因此，MS11品系引物探針MS11-F/R/P與油菜內(nèi)源基因PEP引物探針Q-PEP-1F/2R/P1匹配，且引物探針濃度比MS11 ∶PEP在 1 ∶1.5，退火溫度在58 ℃時進行雙重數(shù)字PCR擴增效率最高，微滴“下雨”現(xiàn)象不明顯。

2.2 方法特異性測試

采用15種轉(zhuǎn)基因油菜、大豆 、玉米、棉花、苜蓿、水稻等常見轉(zhuǎn)基因作物品系，以及非轉(zhuǎn)基因大豆、油菜樣品為模板，進行雙重實時熒光PCR擴增。結(jié)果（圖3）表明，以轉(zhuǎn)基因油菜 MS11、GT73、MS1、RF2、RF3、Topas19/2、T45和Oxy235品系陽性品，非轉(zhuǎn)基因油菜DNA為模板，可以擴增出油菜內(nèi)源PEP基因；以其他轉(zhuǎn)基因陽性品和非轉(zhuǎn)基因大豆DNA為模板，無顯著擴增。僅當(dāng)采用轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系標(biāo)準物質(zhì)DNA為模板時，MS11-F/R/P引物探針可以得到擴增，而采用其他轉(zhuǎn)基因油菜品系和其他轉(zhuǎn)基因作物為模板時均無擴增。表明雙重數(shù)字PCR擴增體系特異于轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系檢測。

2.3 可重復(fù)性和定量精密度測試

數(shù)字PCR反應(yīng)的可重復(fù)性和定量精密度是衡量檢測體系穩(wěn)健性的指標(biāo)［14］。采用10、2、1、0.5、0.1、0.05、0.025 ng/μL 7個濃度轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系標(biāo)準物質(zhì)DNA（含量為50%左右）進行測試，結(jié)果顯示，隨著模板濃度的降低，RSD有逐漸增大的趨勢。7個濃度模板對MS11品系特異性序列測定的SD介于1.04～138.19之間，RSD介于1.60%～16.83%之間； 對PEP基因測定的RSD介于2.51%～15.81%之間（表2），均在可接受范圍內(nèi)［15-16］。

雙重數(shù)字PCR定量方法精密度采用上述數(shù)字PCR擴增結(jié)果進行統(tǒng)計分析和評估。當(dāng)采用7個濃度DNA樣品進行定量檢測時，測定的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系成分百分含量分別為44.59%、44.62%、45.18%、45.13%、47.95%、43.38%和47.34%，SD在1.64%～6.72%之間，RSD在2.82%～14.11%之間（表3）。當(dāng)采用最低的20拷貝/μL基因組DNA（MS11成分約10拷貝/μL）樣品進行擴增時，各重復(fù)間百分比含量相對標(biāo)準偏差仍小于25%，在可接受范圍內(nèi)。

因此，經(jīng)對10拷貝/μL到8 000拷貝/μL 3個數(shù)量級差異的DNA模板測定結(jié)果表明，基于PEP基因和MS11品系特異性序列建立的雙重數(shù)字PCR定量檢測方法可重復(fù)性和定量精密度好，即使模板濃度低至10拷貝，仍能準確定量，方法穩(wěn)定、可靠。

2.4 靈敏度測試

以2、10拷貝/μL油菜MS11品系DNA為模板，測試建立的雙重數(shù)字PCR方法的LOD和LOQ。2個濃度DNA樣品測定的MS11品系平均值分別為[JP3]9.21、1.91拷貝/μL，SD分別為1.63、0.74拷貝/μL，RSD分別為17.70%和38.75%（表4）；內(nèi)源基因PEP測定平均值分別為17.38、4.93拷貝/μL，RSD分別為15.85%和27.98%。2個目標(biāo)2拷貝濃度的RSD超過了可接受范圍，因此雙重數(shù)字PCR方法的檢測下限（LOD）為2拷貝/μL基因組DNA， 定量下限（LOQ）為10拷貝/μL基因組DNA。

2.5 準確度測試

定量準確度是對測量結(jié)果與被測量的真值之間的一致程度進行評估。配制轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系含量分別為 10 %、2 %、0.5 %和0.1% 4個百分比的樣品進行定量測定。結(jié)果表明，4個百分比含量樣品的定量結(jié)果分別為10.07%、2.04%、0.47%和0.10%，各百分含量樣品4次重復(fù)間的SD≤0.38%，RSD≤13.95%。各百分比含量樣品的4次重復(fù)測定值與設(shè)定值之間的偏差見圖4，可以看出隨著MS11品系成分含量的降低，bias值有增大趨勢，但所有bias值均小于±25%，在可接受范圍內(nèi)。表明建立的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系雙重數(shù)字PCR方法定量準確度高，可對低至0.1%含量轉(zhuǎn)基因油菜MS11成分的樣品進行精準定量。

3 結(jié)論和討論

在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物從無到有，到快速發(fā)展的20多年間，全球轉(zhuǎn)基因作物種植范圍、面積越來越廣，種植品系越來越豐富，由轉(zhuǎn)基因作物加工而來的農(nóng)產(chǎn)品對國際貿(mào)易的影響也逐漸深入。由于各國/地區(qū)對轉(zhuǎn)基因作物及品系的審批范圍、審批進度差別很大，轉(zhuǎn)基因成分低水平混雜等現(xiàn)象帶來的準入問題日益突出，給農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易帶來顯著影響。為此，急需在口岸建立和完善我國未批準轉(zhuǎn)基因作物品系精準定量檢測技術(shù)體系、檢測技術(shù)標(biāo)準，以實現(xiàn)低含量轉(zhuǎn)基因成分的有效、精確定量，降低轉(zhuǎn)基因成分低水平混雜等貿(mào)易不利因素的影響力。

目前，國內(nèi)外應(yīng)用較多的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測技術(shù)標(biāo)準多為基于實時熒光PCR建立標(biāo)準曲線的相對定量方法。與實時熒光PCR方法相比，基于絕對定量的數(shù)字PCR方法對反應(yīng)抑制劑敏感度更低，PCR擴增效率對結(jié)果的影響更小，穩(wěn)健性更強［17-18］。同時，雙重數(shù)字PCR擴增反應(yīng)中，由于2個目標(biāo)均在同一反應(yīng)單元中完成，由加樣、體系總量差異等帶來的誤差更低，因此結(jié)果更加穩(wěn)定、準確。但是，在方法建立中，仍需對2個檢測目標(biāo)的相互抑制情況、引物探針的匹配性、引物探針濃度、反應(yīng)退火和延伸溫度等進行優(yōu)化，從而使結(jié)果更加精準。目前，已有報道在轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻等作物幾個常見品系檢測中建立了雙重數(shù)字PCR定量檢測方法［19-24］。

本研究在對雙重數(shù)字PCR反應(yīng)體系進行系統(tǒng)地篩選、優(yōu)化的基礎(chǔ)上，建立了基于油菜內(nèi)源PEP基因和轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系特異性序列的雙重數(shù)字PCR精準定量方法。對方法的特異性、可重復(fù)性、檢測靈敏度、定量準確性、精確度等指標(biāo)進行了測定和評估。結(jié)果表明，方法特異于轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系檢測，不同濃度模板各平行重復(fù)間的偏差均在可接受范圍內(nèi)，方法LOD低至2拷貝/μL，LOQ為10拷貝/μL MS11品系DNA，可對0.1%及以上含量的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系成分進行準確定量，可以滿足口岸對轉(zhuǎn)基因成分LLP問題的應(yīng)對需求。

參考文獻：

［1］何 微，李 俊，王曉梅，等. 全球油菜產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與我國油菜產(chǎn)業(yè)問題、對策［J］. 中國油脂，2022，47（2）：1-7.

［2］王漢中，殷 艷. 我國油料產(chǎn)業(yè)形勢分析與發(fā)展對策建議［J］. 中國油料作物學(xué)報，2014，36（3）：414-421.

［3］張 冉，曹娟娟，濮 超，等. 中國油菜籽和菜籽油的生產(chǎn)、進出口及供需分析［J］. 中國油脂，2022，47（6）：8-14，52.

［4］國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織. 2019年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢［J］. 中國生物工程雜志，2021，41（1）：114-119.

［5］ISAAA. 國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織網(wǎng)站［EB/OL］.［2023-07-01］. https：//www.isaaa.org/.

［6］黃耀輝，焦 悅，付仲文. 國際轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品低水平混雜政策對我國的啟示［J］. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2021，23（9）：1-11.

［7］WHO. Codex Alimentarius Commission. Annex 3：food safety assessment in situations of low-level presence of recombinant- DNA plant material in food：CAC/GL 45-2003［R］. Geneva，2008.

［8］Oecd. Low-level presence of transgenic plants in seed and grain commodities：Environmental risk/safety assessment and availability and use of information［EB/OL］. （2016-04-05）［2023-07-01］. https：//www.oecd-ilibrary.org/environment/safety-assessment-of-transgenic-organisms-in-the-environment-volume-6/low-level-presence-of-transgenic-plants-in-seed-and-grain-commodities_9789264253421-4-en.

［9］ISAAA Inc. APHIS policy on low-level presence of GE material［EB/OL］. （2007-04-04）［2023-08-10］. https：//www.isaaa.org/kc/cropbiotechupdate/article/default.asp？ID=1366.

［10］European Union. Questions and answers on the low level presence [JP3]（LLP） of GMOs in feed import［EB/OL］. （2011-06-24）［2023-07-01］. https：//ec.europa.eu/commission/presscorner/api/files/document/print/en/memo_11_451/MEMO_11_451_EN.pdf.

［11］斯能武，李 俊，武玉花，等. 數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因定量檢測中的研究進展［J］. 中國油料作物學(xué)報，2021，43（1）：40-50.

［12］國家市場監(jiān)督管理總局. 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 實時熒光定性聚合酶鏈式反應(yīng)：GB/T 19495.4—2018［S］. 北京：中國標(biāo)準出版社，2018.

［13］Zhu P Y，F(xiàn)u W，Wang C G，et al. Development and application of absolute quantitative detection by duplex chamber-based digital PCR of genetically modified maize events without pretreatment steps［J］. Analytica Chimica Acta，2016，916：60-66.

［14］Stila. Precision performance of crystal digital PCR vs. quantitative PCR ［EB/OL］. ［2023-07-01］. https：//www.stillatechnologies.com/digital-pcr/naica-system-analysis/precision-performance-of-crystal-digital-pcr-vs-quantitative-pcr/.

［15］Marco M，Cristian S，Chrystele C D，et al. Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing European network of GMO laboratories （ENGL）［EB/OL］. （2008-10-13）［2023-07-01］. https：//publications.jrc.ec.europa.eu/repository/bitstream/JRC49650/jrc49650%20-%20final%20version%20-%20%20min%20perf%20req.pdf.

［16］Vynck M，Vandesompele J，Thas O. Quality control of digital PCR assays and platforms［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2017，409（25）：5919-5931.

［17］Xu X L，Peng C，Wang X F，et al. Comparison of droplet digital PCR with quantitative real-time PCR for determination of zygosity in transgenic maize［J］. Transgenic Research，2016，25（6）：855-864.

［18］Zhao Y，Xia Q Y，Yin Y P，et al. Comparison of droplet digital PCR and quantitative PCR assays for quantitative detection of Xanthomonas citri subsp. citri［J］. PLoS One，2016，11（7）：e0159004. [HJ1.7mm]

［19］肖 芳，李 俊，王顥潛，等. 轉(zhuǎn)基因玉米NK603轉(zhuǎn)化體/zSSIIb內(nèi)標(biāo)基因二重微滴數(shù)字PCR方法的建立及應(yīng)用［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，54（22）：4728-4739.

［20］肖 芳，張秀杰，李 俊，等. 轉(zhuǎn)基因玉米MON87427/zSSIIb二重微滴數(shù)字PCR方法建立及應(yīng)用［J］. 中國油料作物學(xué)報，2021，43（1）：90-98.

［21］Kppel R，Bucher T，Br D，et al. Validation of 13 duplex droplet digital PCR systems for quantitative GMO analysis of most prevalent GMO traits［J］. European Food Research and Technology，2018，244（2）：313-321.

［22］繆青梅，汪小福，陳笑蕓，等. 基于雙重微滴數(shù)字PCR精準定量轉(zhuǎn)基因水稻G6H1的方法研究［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2019，27（1）：159-169.

［23］梁美丹，宋安華，張明明，等. 基于雙重微滴數(shù)字PCR對轉(zhuǎn)基因玉米Bt11品系定量檢測［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2020，28（3）：543-552.

［24］劉 曉，朱鵬宇，景小艷，等. 雙重數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因大豆檢測中的應(yīng)用［J］. 生物技術(shù)進展，2020，10（1）：60-66.

基金項目：上海市 “科技創(chuàng)新行動計劃”技術(shù)標(biāo)準項目（編號：21DZ2203000）；海關(guān)總署科研項目（編號：2021HK155）。

作者簡介：錢昌元（1987—），男，江蘇南通人，博士，從事分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因分子檢測技術(shù)研究。E-mail：qiancynj@126.com。

通信作者：李 想，博士，研究員，從事分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因分子檢測技術(shù)研究。E-mail：idealne@163.com。