Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞水平與浸潤性乳腺癌患者臨床病理參數(shù)、免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性研究

【摘要】目的 探討Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Breg）水平與浸潤性乳腺癌（IBCA）患者臨床病理參數(shù)、免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性，為臨床治療提供參考。方法 選取2019年5月至2022年12月江蘇盛澤醫(yī)院收治的231例IBCA患者為IBCA組，另選取同期收治的116例乳腺纖維腺瘤、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤、導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變患者為非IBCA組，進行回顧性分析。收集IBCA組患者臨床資料，比較兩組患者Foxp3+ Treg、CD19+ Breg、免疫功能指標(biāo)水平，分析IBCA組患者Foxp3+ Treg、CD19+ Breg水平在不同病理參數(shù)乳腺癌中的表達情況，分析IBCA組患者Foxp3+ Treg、CD19+ Breg水平與臨床病理參數(shù)、免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果 231例IBCA患者中，雌激素受體（ER）陽性181例，孕激素受體（PR）陽性130例，Ki67蛋白陽性率≥15% 104例，Luminal A型97例，Luminal B型88例，HER2陽性15例，三陰乳腺癌（TNBC）31例。兩組患者細(xì)胞毒性T（Tc）細(xì)胞、B細(xì)胞水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。IBCA組患者Foxp3+ Treg、CD19+ Breg、自然殺傷（NK）細(xì)胞水平均高于非IBCA組；輔助性T（Th）細(xì)胞水平、T細(xì)胞水平、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值均低于非IBCA組（均P<0.05）。IBCA組患者Foxp3+ Treg在Ki-67蛋白陽性乳腺癌、Luminal B型乳腺癌、人表皮生長因子受體2（HER2）陽性乳腺癌、TNBC中均差異表達（均P<0.05）；CD19+ Breg在Luminal B型乳腺癌、HER2陽性乳腺癌、TNBC中均差異表達（均P<0.05）。IBCA組患者Foxp3+ Treg水平與Ki67蛋白陽性率、Luminal B型、HER2陽性、TNBC、NK細(xì)胞水平均呈正相關(guān)，與Th細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值均呈負(fù)相關(guān)；CD19+ Breg水平與Luminal B型、HER2陽性、TNBC、NK細(xì)胞水平均呈正相關(guān)，與Th細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值均呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 IBCA患者外周血中Foxp3+ Treg、CD19+ Breg水平的升高與IBCA分子亞型相關(guān)，且存在免疫功能障礙，表現(xiàn)為NK細(xì)胞水平上升，Th細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值下降。在IBCA患者的綜合治療中，合理調(diào)節(jié)免疫功能，有助于延緩疾病進展，改善預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】 Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞；浸潤性乳腺癌；臨床病理參數(shù)；免疫功能指標(biāo)

【中圖分類號】R737.9 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-2665.2024.18.0095.05

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.18.029

浸潤性乳腺癌（invasive breast cancer， IBCA）是一種癌細(xì)胞超出原位癌范圍并侵入基底膜下方的惡性腫瘤，且癌細(xì)胞具有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移傾向，可通過深層血管或淋巴管向遠(yuǎn)端淋巴結(jié)或器官轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者生命安全[1]。目前，臨床主要采用化療治療IBCA患者，但隨著療程進展，患者后期易產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果[2-3]。 IBCA分子亞型包括Luminal A、 Luminal B、 HER2陽性及三陰性型，不僅影響腫瘤的生物學(xué)行為，還對疾病的進展、治療反應(yīng)和預(yù)后有重要影響[4]。因此，尋找更全面的IBCA分子亞型相關(guān)指標(biāo)對幫助制訂個體化治療方案、提高患者總體預(yù)后至關(guān)重要。有研究指出，免疫抑制性腫瘤微環(huán)境以異常的血管生成、慢性炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)重塑失調(diào)為特征，可促進乳腺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，且與多種免疫細(xì)胞共存且相互作用，維持腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4]。其中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Breg）在乳腺癌患者的腫瘤組織樣本中均呈不同程度的表達，與IBCA的發(fā)展密切相關(guān)[5]。基于此，本研究探討Foxp3+Treg和CD19+Breg水平與IBCA患者臨床病理參數(shù)、免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性，為臨床治療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年5月至2022年12月江蘇盛澤醫(yī)院收治的231例IBCA患者為IBCA組，另選取同期收治的EfHNl5HxG1q7eSd40uhrPA==116例乳腺纖維腺瘤、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤、導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變患者為非IBCA組，進行回顧性分析。 IBCA組患者年齡33～75歲，平均年齡（53.7±12.5）歲；未絕經(jīng)

158例，絕經(jīng)73例。非IBCA組患者年齡35～69歲，平均年齡（51.2±15.8）歲；未絕經(jīng)70例，絕經(jīng)46例。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），組間具有可比性。本研究經(jīng)江蘇盛澤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴IBCA組患者符合IBCA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，且經(jīng)穿刺活檢確診；⑵無其他惡性腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴乳腺癌原位癌者；⑵合并其他臟器嚴(yán)重疾病者；⑶合并免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2 研究方法 ⑴采集所有患者空腹靜脈血2 ml，置于EDTA抗凝管中，加入6色TBNK試劑，使用流式細(xì)胞儀（BD biosciences，型號： FACSCanto）檢測T細(xì)胞、輔助性T（Th）細(xì)胞、細(xì)胞毒性T（Tc）細(xì)胞、 B細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞水平（Th細(xì)胞也稱為CD4+T淋巴細(xì)胞、 Tc細(xì)胞也稱為CD8+T淋巴細(xì)胞），計算CD4+/CD8+比值。⑵采集所有患者空腹靜脈血5 ml，按1∶1取磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋血后加入到5 mL淋巴細(xì)胞分離液中，以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速（10 cm半徑）離心30 min，取白膜層細(xì)胞，用2 mL PBS洗滌3次后，重懸細(xì)胞并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個/mL。取100 μL分離后的外周血淋巴細(xì)胞放置于檢測管中，先加入5 μL Human TruStain FcX?，于4 ℃環(huán)境孵育15 min；分別加入5 μL FITC anti-human CD4+和APC anti-human CD25+進行表面染色，于4 ℃環(huán)境孵育30 min；加入True-Nuclear? Transcription Factor Buffer Set進行固定，于室溫下避光孵育60 min；加入1×Perm Buffer進行破膜，重復(fù)

3次；加入100 μL 1×Perm Buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL PE anti-human Foxp3進行核內(nèi)染色，于4 ℃環(huán)境孵育30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測Foxp3+Treg水平。上述試劑均購自BD biosciences公司，所有操作均按照說明書進行。⑶采集所有患者空腹靜脈血5 ml，取100 μL分離后的外周血淋巴細(xì)胞至3個流式細(xì)胞管，于各管分別加入5 μL APC-conjugated anti-CD24、 FITC-conjugated anti-CD38、 PE-cy7-conjugated anti-CD19抗體，混勻后，于室溫下孵育30 min。用同型匹配的對照抗體進行對照染色。采用PBS洗滌細(xì)胞2次后，使用流式細(xì)胞儀進行檢測CD19+Breg水平。上述試劑均購自BD biosciences公司，所有操作均按照說明書進行。

1.3 觀察指標(biāo) ⑴收集兩組患者臨床資料，包括腫瘤最大直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期、 TNM分期[7]、病理參數(shù)[雌激素受體（ER）陽性、孕激素受體（PR）陽性、 Ki67蛋白陽性率≥15%、 Luminal A型、 Luminal B型、人表皮生長因子受體2（HER2）陽性、三陰乳腺癌（triple-negative breast cancer， TNBC）]相關(guān)資料。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)變化和組織結(jié)構(gòu)，參照中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2019年版）[8]進行組織病理學(xué)診斷，并采用免疫組織化學(xué)法檢測IBCA患者腫瘤組織中ER、 PR、 HER2、 Ki67蛋白表達情況。⑵比較兩組患者Foxp3+Treg、 CD19+Breg、免疫功能指標(biāo)水平。⑶分析IBCA組患者Foxp3+Treg、 CD19+Breg水平在不同病理參數(shù)乳腺癌中的表達情況。⑷分析IBCA組患者Foxp3+Treg、 CD19+Breg水平與臨床病理參數(shù)、免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計量資料以（x）表示，組間比較采用Student-t檢驗，非正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗；計數(shù)資料以[例（%）]表示，組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗；相關(guān)性采用Spearman分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IBCA組患者臨床資料 231例IBCA患者中， ER 陽性181例， PR陽性130例， Ki67蛋白陽性率≥15%104例， Luminal A型97例， Luminal B型88例， HER2陽性15例， TNBC 31例，見表1。

2.2 兩組患者Foxp3+Treg、 CD19+Breg、免疫功能指標(biāo)水平比較 兩組患者Tc、 B細(xì)胞水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）； IBCA組患者Foxp3+Treg、 CD19+Breg、 NK細(xì)胞水平均高于非IBCA組； Th細(xì)胞水平、T細(xì)胞水平、 CD4+/CD8+比值均低于非IBCA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），見表2。

2.3 IBCA組患者Foxp3+Treg和CD19+Breg水平在不同病理參數(shù)乳腺癌中的表達情況 IBCA組患者Foxp3+Treg在Ki67蛋白陽性乳腺癌、 Luminal B型乳腺癌、 HER2陽性、 TNBC中差異表達（均P<0.05）； CD19+Breg在Luminal B型乳腺癌、 HER2陽性乳腺癌、 TNBC中差異表達（均P<0.05），見表3。

2.4 IBCA組患者Foxp3+Treg、 CD19+Breg水平與臨床病理參數(shù)、免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性分析 IBCA組患者Foxp3+Treg水平與Ki67蛋白陽性率（r值=0.311）、 Luminal B（r值=0.212）、 HER2陽性（r值=0.300）、 TNBC（r值=0.412）、 NK細(xì)胞水平（r值=0.416）均呈正相關(guān)（均P<0.05），與Th細(xì)胞水平、 CD4+/CD8+比值呈負(fù)相關(guān)； CD19+Breg水平與Luminal B（r值=0.312）、 HER2陽性（r值=0.338）、 TNBC（r值=0.402）、 NK細(xì)胞水平（r值=0.209）均呈正相關(guān)（均P<0.05），與Th細(xì)胞水平、 CD4+/CD8+比值呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

近年來，乳腺癌與人體自身免疫功能的關(guān)系逐漸受到廣泛關(guān)注，早期研究主要集中于腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的毒性作用[9]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤通過Treg等機制獲得免疫耐受性，進而增強腫瘤細(xì)胞的增殖[10]。 Foxp3+Treg主要在胸腺中分化產(chǎn)生，在體內(nèi)的免疫抑制活動中扮演重要角色，且其數(shù)量和功能與多種免疫相關(guān)疾病的病理過程密切相關(guān)。 CD19+Breg具有調(diào)節(jié)功能，在防止自身免疫反應(yīng)和維持免疫穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。在不同類型的乳腺癌患者中，F(xiàn)oxp3+Treg的豐度存在顯著差異[11]。此外，Breg與Treg相似，均與自身免疫、移植免疫和腫瘤免疫密切相關(guān)[6，12-15]。olkhanud等[16]研究表明，腫瘤可通過上調(diào)Breg比例來誘導(dǎo)Treg，從而促進乳腺癌轉(zhuǎn)移至肺部。因此，Breg可能成為乳腺癌診斷和治療靶點。然而，Breg在IBCA患者中的臨床意義尚需進一步探討。

淋巴細(xì)胞是一類具有特異性免疫功能的白細(xì)胞，主要包括參與細(xì)胞免疫的T細(xì)胞、參與體液免疫的B細(xì)胞、直接殺傷靶細(xì)胞的NK細(xì)胞。T細(xì)胞按功能可分為Th細(xì)胞和Tc細(xì)胞。機體正常免疫功能的維持依賴于TBNK細(xì)胞亞群的動態(tài)平衡。NK細(xì)胞是重要的先天免疫細(xì)胞，在機體的免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫中發(fā)揮重要作用，能非特異性地裂解被腫瘤和病毒入侵的靶細(xì)胞。NK細(xì)胞可通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性殺死靶細(xì)胞，也可通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能。本研究結(jié)果顯示，IBCA組患者Foxp3+Treg、CD19+Breg、NK細(xì)胞水平均高于非IBCA組；Th細(xì)胞水平、T細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值均低于非IBCA組；兩組患者Tc、B細(xì)胞水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，與J?rgensen[17]研究結(jié)果一致。這提示免疫功能障礙參與IBCa的發(fā)病和進展，表現(xiàn)為外周血中TBNK亞群的異常分布。隨著病情的加重，NK細(xì)胞逐漸被激活，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗感染的作用。相關(guān)研究指出，Tc細(xì)胞的變化與IBCa的進展有關(guān)，但本研究未得到類似結(jié)果。這種差異的原因可能是T淋巴細(xì)胞根據(jù)CD4+或CD8+的表達分為Th和Tc細(xì)胞，且存在尚未發(fā)現(xiàn)的亞群影響Tc細(xì)胞的比例。

本研究結(jié)果顯示，IBCA組患者Foxp3+Treg在Ki67蛋白陽性率、Luminal B、HER2陽性、TNBC中差異表達；CD19+Breg在Luminal B、HER2陽性、TNBC中差異表達。這表明IBCA患者中，F(xiàn)oxp3+ Treg和CD19+ Breg在不同分子亞型和腫瘤增殖標(biāo)志物中具有差異性表達，可能是通過抑制效應(yīng)性 T 細(xì)胞的功能，調(diào)節(jié)腫瘤免疫逃逸和促進腫瘤生長，影響不同亞型乳腺癌的進展。

本研究結(jié)果顯示，IBCA組患者Foxp3+Treg水平與Ki67蛋白陽性率、Luminal B、HER2陽性、TNBC、NK細(xì)胞水平呈正相關(guān)，與Th細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值呈負(fù)相關(guān)。這表明IBCA患者外周血中Foxp3+Treg和CD19+Breg比例升高與IBCA分子亞型相關(guān)，且存在免疫功能障礙，表現(xiàn)為NK細(xì)胞水平上升，Th細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值下降。這表明Foxp3+Treg和CD19+Breg的增加可能是腫瘤細(xì)胞通過抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，尤其是在NK細(xì)胞和Th細(xì)胞功能的抑制方面，增強其存活和進展能力的機制。這些發(fā)現(xiàn)進一步強調(diào)了其在乳腺癌免疫環(huán)境中的復(fù)雜動態(tài)平衡。

綜上所述，IBCA患者外周血中Foxp3+Treg和CD19+Breg比例的升高與IBCA分子亞型相關(guān)，且存在免疫功能障礙，表現(xiàn)為NK細(xì)胞水平上升，Th細(xì)胞水平、CD4+/CD8+比值下降。在IBCA患者的綜合治療中，合理調(diào)節(jié)免疫功能，有助于延緩疾病進展，改善預(yù)后。

參考文獻

Tesch M E， Partridge A H. Treatment of breast cancer in young adults[J]. Am Soc Clin Oncol Educ Book， 2022， 42： 1-12.

Corti C， Giugliano F， Nicolò E， et al. HER2-low breast cancer： a new subtype[J] .Curr Treat Options Oncol， 2023， 24（5）： 468-478.

Geng W， Cao M， Dong K， et al. SHOC2 mediates the drug-resistance of triple-negative breast cancer cells to everolimus[J]. Cancer Biol Ther， 2023， 24（1）： 2206362.

LI J， WU J， HAN J. Analysis of tumor microenvironment heterogeneity among breast cancer subtypes to identify subtype-specific signatures[J]. Genes （Basel）， 2022， 14（1）： 44.

Hashemi V， Maleki LA， Esmaily M， et al. Regulatory T cells in breast cancer as a potent anti-cancer therapeutic target[J]. Int Immunopharmacol， 2020， 78： 106087.

中國抗癌協(xié)會乳腺癌專業(yè)委員會.中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2017年版）[J].中國癌癥雜志， 2017， 27（9）： 695-759.

薛衛(wèi)成.介紹乳腺癌TNM分期系統(tǒng)（第7版）[J]. 診斷病理學(xué)雜志， 2010， 17（4）： 241-244.

中國抗癌協(xié)會乳腺癌專業(yè)委員會.中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2019年版）[J].中國癌癥雜志， 2019， 29（8）： 609-679.

Savas P， Salgado R， Denkert C， et al. Clinical relevance of host immunity in breast cancer： from TILs to the clinic[J]. Nat Rev Clin Oncol， 2016， 13（4）： 228-241.

Farhood B， Najafi M， Mortezaee K. CD8+ cytotoxic T lymphocytes in cancer immunotherapy： A review[J]. J Cell Physiol， 2019， 234（6）： 8509-8521.

Shash L S， M Kamal K A， Abd Raboh N M. Exploring the role CD163-labeled TAMs and FOXP3-labeled Tregs in different types of breast cancer： Reflections and putative benefits[J]. Indian J Pathol Microbiol， 2021， 64（1）： 28-37.

Casta?eda J， Hidalgo Y， Sauma D， et al. The multifaceted roles of B cells in the thymus： From immune tolerance to autoimmunity[J]. Front Immunol， 2021， 12： 766698.

Sarvaria A， Madrigal J A， Saudemont A. B cell regulation in cancer and anti-tumor immunity[J]. Cell Mol Immunol， 2017， 14（8）： 662-674.

Li C， Jiang P， Wei S， et al. Regulatory T cells in tumor microenvironment： new mechanisms， potential therapeutic strategies and future prospects[J]. Mol Cancer， 2020， 19（1）： 116.

Zhou X， Su Y X， Lao X M， et al. CD19（+）IL-10（+） regulatory B cells affect survival of tongue squamous cell carcinoma patients and induce resting CD4（+） T cells to CD4（+）Foxp3（+） regulatory T cells[J]. Oral Oncol， 2016， 53： 27-35.

Olkhanud P B， Damdinsuren B， Bodogai M， et al. Tumor-evoked regulatory B cells promote breast cancer metastasis by converting resting CD4+ T cells to T-regulatory cells[J]. Cancer Res， 2011， 71（10）： 3505-3515.

J?rgensen N， Hviid T V F， Nielsen L B， et al. Tumour-infiltrating CD4+， CD8+ and FOXP3-positive immune cells as predictive markers of mortality in BRCA1- and BRCA2-associated breast cancer[J]. Br J Cancer， 2021， 125（10）： 1388-1398.