微波輔助離子液體提取黃檗生物堿的工藝研究

摘 要：采用微波輔助離子液體提取方法從黃檗樹皮中提取3種生物堿（藥根堿、巴馬汀和小檗堿）。首先基于單因素試驗考察離子液體的種類和料液比對提取效率的影響，進一步考察離子液體濃度、提取時間和溫度3種因素對提取效率的影響，最終應用Box-Behnken響應面方法優化，得到最佳提取工藝，并與傳統提取方法進行比較。研究結果表明，1-丁基-3-甲基咪唑嗅鹽（［Bmim］［Br］）溶液對生物堿的提取效率最高，最佳提取條件為離子液體濃度為0.31 mol/L，溫度為94 ℃，時間為15 min，在該條件下藥根堿得率為0.047%±0.003%，巴馬汀得率為0.421%±0.011%，小檗堿得率為1.150%±0.028%。與傳統水加熱回流法相比，提取效率分別高出9.3%、12.8%和23.6%。該研究表明，利用微波輔助離子液體提取技術可以高效地從黃檗樹皮中提取生物堿，為提取黃檗中活性成分提供堅實的理論基礎和實證支持。

關鍵詞：離子液體； 微波； 黃檗； 生物堿； 響應面

中圖分類號：S713 文獻標識碼：A DOI：10.7525/j.issn.1006-8023.2024.05.017

Study on the Process of Microwave-Assisted Ionic Liquid Extraction of Alkaloids from Phellodendron amurense Rupr.

Abstract： This study employed a microwave-assisted ionic liquid extraction method to extract three alkaloids （berberine， palmatine， and berbamine） from the bark of Phellodendron amurense Rupr.. Initially， the impact of the type of ionic liquid and liquid-to-solid ratio on extraction efficiency was investigated through single-factor experiments. Subsequently， the effects of ionic liquid concentration， extraction time， and temperature on extraction efficiency were further explored. The Box-Behnken response surface methodology was then applied to optimize and obtained the optimal extraction process， which was subsequently compared with traditional extraction methods. The research findings indicated that ［Bmim］［Br］ solution exhibited the highest extraction efficiency for the alkaloids. The optimal extraction conditions included an ionic liquid concentration of 0.31 mol/L， a temperature of 94°C， and an extraction time of 15 minutes. Under these conditions， the yields of berberine， palmatine， and berbamine were 0.047%±0.fPzfuvg8MhOcc1v3qLNe3lBh8bwosEFpn1r8x6Az34Y=003%， 0.421%± 0.011%， and 1.150%±0.028%， respectively. Compared to the traditional water heating reflux method， the extraction efficiencies were 9.3%， 12.8%， and 23.6% higher， respectively. This study demonstrates that the use of microwave-assisted ionic liquid extraction technology can efficiently extract alkaloids from the bark of Phellodendron amurense Rupr.， providing a theoretical basis and empirical support for the extraction of active components from Phellodendron amurense Rupr..

Keywords： ionic liquid； microwave； Phellodendron amurense Rupr.； alkaloids； response surface

0 引言

黃檗（Phellodendron amurense Rupr.）屬于蕓香科植物，主要分布于中國東北地區［1］。黃檗樹皮的主要生物活性成分是異喹啉生物堿等，其藥理作用包括抗炎、抗衰老、抗損傷、利尿、免疫調節、抗腫瘤、抗菌和神經保護等，被用于治療糖尿病和痢疾等各種疾病［2-6］。提取是從植物內得到活性物質的第一步［7］，傳統的提取方法包括熱回流提取、索氏提取和滲濾等［8-10］。然而，這些方法通常需要較長的提取時間或較高的提取溫度，并且提取效率常常不能達到預期。新穎的提取技術逐步被應用于從植物中提取活性成分，如超聲輔助提取和微波輔助提取技術等。新技術的優點是環保、提取效率高、能耗低、溶劑消耗少及操作簡便等。微波輔助提取技術可以通過微波輻射迅速增加固體基質的內部壓力并誘導植物細胞破裂，加速細胞內容物向提取溶劑中的釋放，從而增加提取率［11-13］。

離子液體（Ionic Liquids，ILs）是僅由有機陽離子和無機或有機陰離子組成的鹽，在室溫下為液體，具有低蒸氣壓、低揮發性和高熱穩定性的特性，因此被視為綠色溶劑［14-15］。此外，ILs可以根據植物中目標活性成分的親疏水性調節其分子結構，增加活性成分在提取溶液中的溶解性［16-17］。在本研究中，將微波技術與離子液體相結合，用于從黃檗樹皮中提取3種主要活性成分，包括小檗堿（BER）、藥根堿（JAT）和巴馬汀（PAL）。同時運用Box-Behnken響應面設計方法優化工藝參數并確定最佳提取條件。進一步將新提取技術與傳統提取方法進行比較，為黃檗資源的深度加工利用提供相應的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Hypersil ODS2色譜柱（C18，250 mm×4.6 mm， 5 μm）（大連依利特分析儀器有限公司）；微波催化合成/萃取儀（908010，美國CEM公司）。

1.2 材料

黃檗樹皮購買于黑龍江省哈爾濱市三棵樹藥材市場；十二烷基苯磺酸鈉及藥根堿、巴馬汀和小檗堿對照品（純度>98%）購買于阿拉丁生物科技有限公司；乙腈和甲醇（色譜級）購買于美國天地有限公司；離子液體購買于上海成捷化學有限公司。

1.3 高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定黃檗中3種生物堿方法

1）本試驗使用HPLC對目標生物堿進行檢測分析［16］，檢測條件為：流動相為乙腈和水溶液（體積比為1∶1），水溶液1 L內含有1.7 g十二烷基磺酸鈉和3.4 g磷酸二氫鉀；進樣量為5 μL；流速為1.0 mL/min；檢測波長為345 nm。

2）標準曲線配置方法。稱取4.68 mg藥根堿對照品、6.20 mg巴馬汀對照品和8.39 mg小檗堿對照品，分別裝入25 mL容量瓶中，用純水溶解并定容，采用對半稀釋法進行稀釋，用0.45 μm微孔濾膜過濾后按照上述色譜條件對各個質量濃度對照品溶液的峰面積進行測定，并利用軟件分別繪制3種生物堿標準曲線圖，計算回歸方程。縱坐標為峰面積分值，橫坐標為對照品溶液質量濃度。

1.4 提取液中生物堿的含量計算方法

生物堿的得率為Y，計算公式為

式中：Y為生物堿的提取率，%；C為生物堿的質量濃度，mg/mL；mp為黃檗藥材的質量，g；1 000為生物堿的質量由mg轉化為g；30為提取液體積30 mL。

1.5 單因素考察試驗方法

將黃檗樹皮用粉碎機粉碎，過0.25mm篩網，烘箱烘干至恒重，作為試驗原料。采用Standard Control微波模式，考查離子液體種類、料液比、離子液體濃度、微波提取時間和提取溫度對生物堿得率的影響。

1.5.1 離子液體種類

研究所用的4種離子液體的結構式如圖1所示。稱取4組0.20 g黃檗樹皮粉末，分別用1-丁基- 3-甲基咪唑溴鹽（［Bmim］［Br］）、1-己基-3-甲基咪唑鹽（［Hmim］［Br］）、1-辛基-3-甲基咪唑鹽（［Omim］［Br］）、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（［Omim］［BF4］）離子液體水溶液作為溶劑（30 mL，0.30 mol/L），使用微波提取并控制溫度為60 ℃，提取5 min，隨 后使用HPLC方法對提取液中生物堿含量進行檢測。

1.5.2 料液比

根據離子液體種類考察試驗得到的結果，選用0.3 mol/L的［Bmim］［Br］水溶液為溶劑，進行料液比考察試驗。根據料液比0.1/30、0.2/30、0.3/30、0.4/30、0.5/30 g/mL的試驗安排，分別稱量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g黃檗樹皮粉末，加入到30 mL離子液體水溶液中。使用微波進行提取，控制溫度為60 ℃，提取時間為5 min，隨后使用HPLC對提取液中生物堿含量進行檢測。

1.5.3 ［Bmim］［Br］濃度

根據離子液體種類篩選得到的試驗結果，稱取5組0.20 g黃檗樹皮粉末，配置濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的［Bmim］［Br］離子液體水溶液，體積為30 mL，使用微波進行提取，控制溫度為60 ℃，提取5 min，隨后使用HPLC方法對提取液中生物堿含量進行檢測。

1.5.4 提取時間

稱取6組0.20 g黃檗樹皮粉末，以30 mL、0.3 mol/L的［Bmim］［Br］水溶液為溶劑，在60 ℃下，分別使用微波提取3、6、9、12、15、18 min，隨后使用HPLC對提取液中生物堿含量進行檢測。

1.5.5 提取溫度

稱取6組0.2 g黃檗樹皮粉末，以30 mL、0.3 mol/L的［Bmim］［Br］水溶液為溶劑，分別在30、40、50、60、70、80、90 ℃下使用微波提取15 min，隨后使用HPLC對提取液中生物堿含量進行檢測。

1.5.6 響應面試驗分析

根據單因素試驗結果，選取［Bmim］［Br］水溶液濃度、溫度、提取時間3個自變量，設計三因素三水平響應面優化試驗，以3種生物堿得率為考察指標（響應值）。效應面法設計（Box-Behnken Design，BBD）響應面設計的模型符合二次多項式方程

式中：Y為預測的生物堿得率；β0、βi、βii、βij分別表示常數項、線性系數項、二次系數項、交互系數項；Xi和Xj表示自變量。按照BBD的統計學要求，對各項系數進行回歸分析。

1.6 對比試驗考察方法

1）加熱回流法。稱取2組0.2 g黃檗樹皮粉末，分別以30 mL、0.3 mol/L［Bmim］［Br］和30 mL水為溶劑，油浴加熱90 ℃，回流10 h。

2）微波輔助提取法。稱取2組0.06 g黃檗樹皮粉末，分別以30 mL的水和0.31 mol/L［Bmim］［Br］水溶液為溶劑，使用微波加熱，在溫度為90 ℃下提取15 min。

2 結果與分析

2.1 HPLC標準曲線

按照HPLC檢測條件，縱坐標A為峰面積，X為對照品溶液質量濃度（mg/mL），計算回歸方程。3種生物堿的線性方程及決定系數分別為JAT的峰面積：AJAT=6 971.4X+0.772，R2=0.999；PAL的峰面積：APAL=8 326.1X+8.967，R2=0.999 9；BER的峰面積：ABER=7 122X-4.732 7，R2=0.999 8。說明3種生物堿在適當的質量濃度范圍內和峰面積具有良好的線性關系。

2.2 離子液體種類篩選結果

試驗結果如圖2所示，圖2中縱坐標表示生物堿的得率，可知相同濃度下［Bmim］［Br］水溶液對3種生物堿的得率均優于其他3種類型離子液體，［Bmim］［Br］的提取效果優于［Hmim］［Br］和［Omim］［Br］的原因是陽離子的差異，［Bmim］［Br］的碳鏈短、極性大，而黃檗中的生物堿在極性大的溶劑中溶解性較好。［Omim］［BF4］由于極性較小，導致在水中的溶解度較小［18］，對黃檗中的生物堿提取效果較差。因此，選擇［Bmin］［Br］水溶液作為溶劑進行下一步提取工藝研究。

2.3 料液比對生物堿提取效率的影響

在提取工藝中，藥材用量和提取液的投放比例是重要的考察因素，往往是提取液體積越大提取效率越好，但是從回收和經濟角度考慮應將溶劑量控制在一定范圍內。本研究試驗結果如圖3所示，生物堿的提取效率隨著加入的黃檗藥材質量增加而減小（溶劑恒定為30 mL）。雖然在藥材質量為0.1 g時，得率最高，但0.1/30 g/mL與0.2/30 g/mL得率差異不大，因此，研究選擇料液比為0.2/30 g/mL作為后續試驗條件。

2.4 ［Bmim］［Br］水溶液濃度對生物堿提取效率的影響

進一步考察離子液體濃度對提取效率的影響，隨著離子液體濃度增大，3種生物堿提取率均增加，這是由于當離子液體濃度較低時，隨著離子液體濃度增加，離子液體改變水溶液極性，使得生物堿溶解性增大占了主導地位，從而提取效率增加。之后隨著離子液體黏度繼續增加阻礙溶劑的滲透和擴散，從而降低生物堿的提取效率［19］。由圖4可知，當離子液體濃度為0.3 mol/L時，生物堿的得率最高。

2.5 提取時間對生物堿提取效率的影響

隨著提取時間增加，生物堿的提取效率升高，如圖5所示。生物堿的得率在15 min內緩慢增加，在15 min時生物堿的得率最高，但在18 min條件下略有下降。得率下降的原因可能是提取時間過長導致生物堿降解［20］。因此，選擇15 min為后續優化的中心點。

2.6 提取溫度對生物堿提取效率的影響

溫度對天然產物提取效率的影響多為隨著溫度升高，溶劑滲透能力、擴散能力以及溶解性均增大。本試驗結果如圖5所示。隨著溫度升高，生物堿的得率升高，在90 ℃條件下生物堿的得率最高。當溫度高于90 ℃時，3種生物堿的得率均有降低的趨勢，這可能是過高的溫度使提取出來的生物堿部分被分解或轉化［21］。因此，選擇90 ℃為后續優化的中心點。

2.7 響應面法優化的試驗結果

2.7.1 BBD模型的建立及其顯著性試驗

在單因素試驗結果的基礎上，使用軟件Design-Expert 13.0，采用BBD方法建立三因素三水平的模型。對響應面進行分析，研究各因素與響應值之間以及各因素之間的相互關系，進一步優化3個獨立變量（X1［Bmim］［Br］水溶液濃度、X2溫度、X3時間）。表1展示了Box-Behnken Design的17組試驗方案和對應的生物堿的得率結果。

表2試驗數據通過Design-Expert 13.0軟件回歸擬合處理，得到3個響應值對YJAT、YPAL和YBER的二次多項式回歸模型為

表2為回歸方程模型中3種生物堿提取率的方差分析表，由表2中模型的質量因素（F）（分別為71.61、49.03和76.05，P<0.000 1）可知，該模型顯著性非常明顯。失擬項不顯著，表明方程在試驗所選范圍內，擬合性較好；根據表3的結果可知，3種生物堿的決定系數分別為R2=0.989 3、0.984 4、0.989 9，說明該模型能很好地解釋試驗中響應值的變化；變異系數為1.55%，1.03%，1.32%，說明試驗結果的可靠性和回歸模型的準確性。調和系數分別為R2adj=0.975 4、0.964 3、0.976 9，與決定系數R2很接近，說明響應預測值和實際值高度相關。根據上述對模型的分析，說明該模型能對黃檗中3種生物堿的提取率進行很好的預測。表中X1和X2項的P均小于0.01，說明X1項和X2項對黃檗中3種生物堿的提取率線性效果非常明顯；生物堿PAL和BER二次項X12、X22和X32的P<0.01，JAT的二次項X12和X22的P<0.01，說明此方法對生物堿提取率的影響非常顯著。

2.7.2 響應面分析及優化

根據回歸方程，響應面軟件生成3D響應面圖，如圖7所示。確定1個變量，觀察2個連續變量對生物堿得率的影響的3D圖。由圖7可以直觀地反映出各因素對得率的作用。當提取條件在合適范圍內，生物堿的得率不斷提高，當［Bmim］［Br］水溶液濃度在0.30～0.35 mol/L、提取溫度在90～95 ℃、提取時間在15～15.5 min，3種生物堿的得率達到最高。

2.7.3 驗證試驗

通過對3種生物堿的提取條件進行優化，使用Design Expert 13.0對試驗數據進行分析，BBD模型給出提取生物堿的最佳條件，最佳提取條件是提取液濃度為0.31 mol/L，溫度為94.10 ℃，時間為15.34 min，估測的最佳JAT得率為0.049%，PAL的得率為0.424%，BER的得率為1.170%。稍加修改獲得的最佳條件，統一生物堿提取條件，最終使用濃度是0.31 mol/L，溫度是94 ℃，時間是15 min，重復進行3次試驗來保證試驗的準確性并通過實際得到的生物堿得率驗證模型優化得出的提取條件是否可靠。3次試驗的平均值分別為JAT得率0.047% ± 0.003%，PAL得率0.421% ± 0.011%，BER得率1.150% ± 0.028%，這些結果與BBD模型估測的理論值保持一致，這說明該模型對生物堿提取方法的優化是可靠的。

2.8 與其他提取方法的比較結果

將微波輔助離子液體提取方法與傳統水溶劑加熱回流法進行對比。試驗結果見表4。以加熱回流為提取方法，［Bmim］［Br］的提取效果優于水溶液，這是由于離子液體可以改變溶劑的極性，從而增加對提取物溶解能力，提高提取率。以離子液體為溶劑，分別采用加熱回流和微波輔助提取技術， 2種方法的提取率接近，然而微波提取技術所需的時間約為15 min，更為高效。在微波輔助離子液體的最佳提取條件下，與傳統水加熱回流法相比，提取效率分別高出9.3%、12.8%和23.6%。

3 結論

本研究對黃檗的微波輔助離子液體提取工藝進行系統性研究，對比分析具有不同性質的4種離子液體提取黃檗中生物堿的提取效率，結果表明，具有短碳鏈和高極性的離子液體［Bmim］［Br］提取效率最高。在單因素試驗基礎上，使用效應面法設計對提取工藝參數進行優化。優化后的最優工藝條件為離子液體濃度為0.31 mol/L，溫度為94 ℃，時間為15 min，在該條件下藥根堿提取率0.047%± 0.003%，巴馬汀提取率 0.421%±0.011%，小檗堿提取率1.150%±0.028%。與傳統水加熱回流法相比，提取效率分別高出9.3%、12.8%和23.6%。本研究結果表明，使用微波輔助離子液體提取技術從黃檗中提取生物堿，具有提取時間較短、節省溶劑以及噪聲小等優點。本研究為黃檗中生物堿的提取提供堅實的理論基礎和數據支撐。

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