黃瓜FtsZs基因家族鑒定及分析

關鍵詞：黃瓜；FtsZs基因；生物信息學分析；非生物脅迫反應；生物脅迫反應

黃瓜（CucumissativusL.）是世界性的十大蔬菜作物之一，而我國是黃瓜的主產國。2022年，我國黃瓜種植面積為131.15萬hm2，總產量為7730.73萬噸，分別占全球的60.32%和81.62%，均居世界第一位。

FtsZ（FilamentingtemperaturesensitiveZ）蛋白作為一種可溶性的胞質蛋白，是微管蛋白的結構同系物。FtsZ在離體條件下經誘導可通過多聚化作用組裝成線形排列的有序結構，而這些由FtsZ蛋白組成的結構則與tubulin形成的原纖絲非常類似［1］，暗示了其功能的相似性。FtsZ蛋白多定位于質體或葉綠體，并作為質體分裂復合體的基本組成部分，組裝成FtsZ環并招募至少二十多種蛋白質介導胞質分裂［2］。FtsZ可直接或間接地調控葉綠體分裂環中蛋白質的組裝和定位，并驅動葉綠體的分裂。有研究表明，擬南芥FtsZ1、FtsZ2-1和FtsZ2-2定位于葉綠體的基質和類囊體上，可以通過影響葉綠體分裂，使葉綠體變大［3-5］。水稻（Oryzasativa）OsFtsZ1和OsFtsZ2-1過表達和敲低都會抑制淀粉體分裂，產生多形性淀粉顆粒［6］。與野生型相比，馬鈴薯ftsz1敲除突變體塊莖中淀粉顆粒增大或淀粉粒黏度增加［7］。在小立碗蘚中，利用基因編輯技術獲得了ftsz2-1突變體，研究發現，ftsz2-1突變體的葉綠體分裂受到顯著影響，甚至在其少數細胞中能觀察到單個不分裂的絲狀葉綠體［8］。在煙草中敲低FtsZ基因會干擾葉綠體的正常分裂過程，引起葉綠體發育的異常，并導致葉綠體數目的減少和體積的增加［9］。

目前黃瓜FtsZs家族的研究還未見報道，其功能尚不清楚。為了解析黃瓜FtsZs基因的功能，本文對黃瓜FtsZs家族成員進行了鑒定，分析了其基因結構及在染色體上的分布，研究了黃瓜FtsZs與擬南芥、番茄、甜瓜FtsZs的親緣關系，確定了其組織表達特性及對生物和非生物脅迫的響應情況，研究結果可為探明黃瓜FtsZs作用機制提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 FtsZs家族基因的鑒定

分別從葫蘆科基因組網站（http：//CucurbitGenomicsDatabase（CuGenDB）、擬南芥基因組網站（https：//www.arabidopsis.org）和番茄基因組網站（https：//solgenomics.net）下載黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄gff、cds、pep、fasta文件，獲得黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄所有注釋基因信息。隨后從Pfam數據庫（http：//www.example.com）下載FtsZ保守域（PF12327）的HMM配置文件，在所下載注釋基因信息中篩選黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄的FtsZs基因（默認參數和截止值為0.01）。使用Pfam工具（http：//www.example.com）和SMART（http：//www.example.com）對篩選獲得的黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄FtsZ保守域進行鑒定，并根據其與擬南芥FtsZs的親緣關系進行命名；使用ExPasy（htps：/web.ExPasy.org/computepI/）計算FtsZs的相對分子量（Mw）、氨基酸數量（AA）和等電點（pI）；使用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.situ.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預測FtsZs的亞細胞定位情況。

1.2 黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄FtsZs進化關系分析

利用MEGA7軟件中的ClustalX對所有FtsZs蛋白序列進行對比，隨后采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod，NJ）構建系統進化樹，并用Bootstrap法（重復次數設定為1000）評估系統進化樹，最終使用MEGA7呈現進化樹。

1.3 黃瓜FtsZs基因及蛋白結構的分析

從黃瓜基因組網站（http：//CucurbitGenomicsDatabase（CuGenDB））獲得FtsZs的內含子和外顯子信息，并利用TBtools生成基因結構；使用MEME（htps：//www.omicsclass.com/article/432）在線網站分析黃瓜FtsZs的保守motif（設置基序數為10，基序的最小長度為6個氨基酸，基序的最大長度為10個氨基酸），并用TBtools可視化［10］；從黃瓜基因組網站（http：//CucurbitGenomicsDatabase（CuGenDB））獲得FtsZs的蛋白序列，從SMART網站獲得Tubulindomain和FtsZ-Cdomain兩個保守結構域的蛋白序列，利用DNAMAN生成FtsZs蛋白序列并分析蛋白序列的差異。

1.4 黃瓜FtsZs組織表達特性分析

基于已有的RNA-seq數據（SRA046916）［11］，分析了黃瓜FtsZs在根、莖、葉、雌花、雄花、子房、未受精子房、已受精子房和卷須等九個組織的表達情況。并基于FPKM值使用TBtools軟件（v2.086）可視化。

1.5 實時熒光定量PCR分析黃瓜FtsZs表達特性

將華北型黃瓜“9930”種于山東農業大學園藝實驗站9號溫室，并按照常規栽培方法進行管理。在結果期取根、莖、葉、雌花、雄花、卷須和果實等組織，采用TRIzol（湖南艾科瑞生物工程有限公司）提取RNA，并用EvoM-MLV反轉錄預混型試劑盒Ver.2（t湖南艾科瑞生物工程有限公司）逆轉錄成cDNA。使用PrimerPremier5.0設計引物，并以黃瓜肌動蛋白基因作為內參（引物序列見附表S1）。采用SYBRGreenProTaqHS預混型qPCR試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）在CFXOpus96實時PCR檢測系統（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）進行實時熒光定量PCR檢測。采用2-ΔΔCt方法計算所選基因的相對表達水平［12］。對每個基因進行3次生物學和3次技術重復。

1.6 黃瓜FtsZs響應非生物和生物脅迫分析

從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載了鹽脅迫（GSE116265）［13］、高溫脅迫（GSE151055）［14］、冷處理（GSE210703）［15］和白粉病菌侵染（GSE81234）［16］的轉錄組數據，以分析黃瓜FtsZs的響應情況，并用TBtools可視化。

2 結果與分析

2.1 黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄FtsZs的鑒定

本文在黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄中分別鑒定到了3個、3個、3個和4個FtsZs基因，并按親緣關系對其進行命名（見表1）。通過比對基因結構發現，基因間的長度相差很大，介于2050和17560bp之間，其中最短的基因為AtFtsZ1（2050bp），最長的基因為SlFtsZ2-1（17560bp）；它們的外顯子數目介于6和8之間，黃瓜FtsZs基因的外顯子多為7個，擬南芥FtsZs基因的外顯子多為6個，番茄FtsZs基因的外顯子多為7個。蛋白結構分析發現，氨基酸長度介于419和491AA之間；大部分基因偏酸性（AtFtsZ1，AtFtsZ2-1，AtFtsZ2-2，CsFtsZ1，CsFtsZ2-1，CsFtsZ2-2，SlFtsZ1-1，SlFtsZ2-1，SlFtsZ2-2，CmFtsZ1，CmFtsZ2-1，CmFtsZ2-2），只有1個基因偏堿性（SlFtsZ1-2）。黃瓜FtsZs基因長度與其他物種的差異較大，暗示FtsZs在不同物種中可能發揮不同的功能。

亞細胞定位預測結果顯示，所有的FtsZ1s基因都在葉綠體和細胞質中有定位信號（AtFtsZ1，CsFtsZ1，SlFtsZ1-1，SlFtsZ1-2，CmFtsZ1），黃瓜和甜瓜的FtsZ2s基因都有細胞質定位信號（CsFtsZ2-1，CsFtsZ2-2，CmFtsZ2-1，CmFtsZ2-2），而擬南芥和番茄的FtsZ2s基因都有葉綠體定位信號（AtFtsZ2-2，SlFtsZ2-1，SlFtsZ2-2）。

2.2 黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄FtsZs進化關系分析

根據親緣關系的遠近，我們可以將FtsZs基因分為2個組。第一組包括1個黃瓜FtsZ基因（CsFtsZ1），1個甜瓜FtsZ基因（CmFtsZ1），1個擬南芥FtsZ基因（AtFtsZ1）和2個番茄FtsZs基因（SlFtsZ1-1，SlFtsZ1-2），其中黃瓜FtsZ基因和甜瓜FtsZ基因的親緣關系最近，其次是擬南芥和番茄。第二個組包括2個黃瓜FtsZs基因（CsFtsZ2-1，CsFtsZ2-2），2個番茄FtsZs基因（SlFtsZ2-1，SlFtsZ2-2），2個擬南芥FtsZs基因（AtFtsZ2-1，AtFtsZ2-2），2個甜FtsZs基因瓜（CmFtsZ2-1，CmFtsZ2-2），其中黃瓜FtsZs基因和甜瓜FtsZs基因的親緣關系最近，其次是擬南芥FtsZs基因和番茄FtsZs基因（圖1）。

2.3 黃瓜FtsZs基因結構分析

研究發現，CsFtsZ1有6個外顯子，氨基酸長度為421AA；CsFtsZ2-1有7個外顯子，氨基酸長度為488AA；CsFtsZ2-2有7個外顯子，氨基酸長度為479AA。CsFtsZ1與CsFtsZ2-1、CsFtsZ2-2在外顯子數目和氨基酸長度上存在差異，CsFtsZ2-1與CsFtsZ2-2在基因結構上差異不大。

保守motif基序分析發現，黃瓜3個FtsZs基因均含有M1、M2、M3、M4、M5、M7、M9、M10這8個基序，而M6和M8這2個基序只存在CsFtsZ2-1和CsFtsZ2-2中。

保守結構域分析發現，黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄的FtsZs都含有Tubulindomain和FtsZ-Cdomain結構域，暗示了基因進化上的保守性。

2.4 黃瓜FtsZs基因的組織表達模式

RNA-seq數據顯示（圖3），3個黃瓜FtsZs基因在葉、莖、子房和雌花中表達量較高，推測其參與了葉、莖、子房和雌花的生長發育。其中，CsFtsZ2-1和CsFtsZ2-2在雌花和未受精子房中的表達量差異較大，暗示其在雌花和子房生長發育中發揮不同的功能。

熒光定量PCR結果顯示，黃瓜CsFtsZ2-1基因在華北型黃瓜“9930”葉片、雄花和雌花中的表達量較高。

2.5 黃瓜FtsZs基因在生物脅迫和非生物脅迫下的表達譜

利用鹽脅迫、高溫處理、冷脅迫和白粉病菌侵染RNA-seq數據，分析了黃瓜FtsZs基因在脅迫下的響應情況。首先，我們分析了黃瓜FtsZs基因在鹽脅迫下的表達情況，結果顯示，NaCl處理后，黃瓜CsFtsZ2-1基因下調，表明該基因可響應鹽脅迫；硅（Si）被認為是植物的第四大基本元素，可增強抗逆性并促進植物的生長發育。在僅用Si處理的條件下和外源鹽加硅（NaSi）處理下，黃瓜FtsZs的表達量差異不大（圖4）。

黃瓜FtsZs基因對高溫處理響應結果表明（圖5），高溫處理3h和高溫處理6h后，黃瓜中的3個FtsZs基因表達水平沒有明顯變化，這表明黃瓜中的3個FtsZs基因不響應高溫脅迫。

黃瓜FtsZs基因對冷脅迫響應結果表明（圖6），冷處理3h和12h后，黃瓜中3個FtsZs基因表達均上調，而冷處理24h后只有CsFtsZ2-1基因上調，這表明黃瓜中的3個FtsZs基因均可響應冷脅迫。

分析了黃瓜FtsZs基因對白粉病的響應情況，結果顯示，在白粉病敏感株系D8中，接種白粉病后，CsFtsZ1和CsFtsZ2-1的表達量顯著提高，表明兩者可響應白粉病病原菌侵染；在白粉病抗性株系SSL508-28中，接種白粉菌前后，黃瓜FtsZs的表達量差異不大（圖7）。

3 討論

迄今為止，在大多數的原核生物中均發現了FtsZ基因，并對其功能進行了深入的研究。相較于原核生物，真核生物中FtsZs基因的報道較少。本文在黃瓜、甜瓜、擬南芥和番茄中分別鑒定到了3～4個FtsZs基因，暗示了FtsZs基因數目在不同物種間具有高度的保守性。擬南芥3個FtsZs基因中最長的為3269bp，最短的為2050bp；黃瓜3個FtsZs基因中最長的為6264bp，最短的為4493bp；甜瓜3個FtsZs基因中最長的為13038bp，最短的為4410bp；番茄4個FtsZs基因中最長的為17560bp，最短的為6365bp，暗示著在不同物種之間FtsZs基因的結構存在差異性（表1）。本文鑒定到的13個FtsZs基因都含有Tubulindomain和FtsZ-Cdomain兩個保守的結構域，但是不同物種之間保守結構域的基序是有差異的，即使是同屬于葫蘆科的黃瓜和甜瓜，它們保守結構域的基序也不完全相同（圖2），這就暗示了該基因在進化上既有保守性又存在差異性，進一步說明不同物種之間FtsZs基因功能可能不盡相同。

有研究發現，木薯中的MeFtsZ2-1和MeFtsZ2-2定位于葉綠體內［17］。將MeFtsZ2-1和MeFtsZ2-2在擬南芥中異源表達，可影響擬南芥葉肉細胞中的葉綠體分裂進而使葉綠體數量減少［17］；在擬南芥中抑制AtFtsZ1-1或AtFtsZ2-1的表達也會通過影響葉綠體分裂使成熟葉細胞中葉綠體的數量減少［18］。我們利用在線網站預測了黃瓜中3個FtsZs基因的亞細胞定位情況，發現它們在葉綠體或細胞質中有定位信號，推測它們在黃瓜的葉綠體中起作用（表1）。

已有的研究表明，在木薯中過表達MeFtsZ2-1基因會使木薯植株早開花，頂端分支明顯增多，葉片變小且數量增多［17］。我們利用RNS-seq數據和熒光定量PCR技術分析發現，黃瓜中3個FtsZs基因在葉中都有較高表達，推測其在黃瓜葉中發揮重要功能（圖3）。我們利用熒光定量PCR技術研究發現，CsFtsZ2-1在雄花和雌花中表達量也較高，推測CsFtsZ2-1也會影響花的發育（圖3），但其具體作用機制還需要做深入的研究。

前人研究表明，在300mMNaCl脅迫下，木薯FtsZ2-1的轉錄水平先降低后升高，在NaCl脅迫4h時達到最低水平，在NaCl脅迫48h時達到最高水平［19］。本文結果顯示，黃瓜FtsZ2-1基因在75mM鹽處理下表達下調。除此之外，我們還發現黃瓜CsFtsZ1、CsFtsZ2-1和CsFtsZ2-1基因可響應冷脅迫，CsFtsZ1和CsFtsZ2-1可響應白粉病菌侵染，暗示著黃瓜FtsZs基因在鹽脅迫、冷脅迫和白粉病抗性中發揮作用。

4 結論

本文在黃瓜中鑒定到3個FtsZs基因，基因結構分析發現黃瓜FtsZs基因長度為1266～1467bp，外顯子數目為6～7個，氨基酸長度為421～488AA；保守結構域分析發現它們都含有Tubulindomain和FtsZ-Cdomain兩個保守的結構域。組織表達特異性分析發現，FtsZs在黃瓜葉、莖、子房和雌花組織中表達量較高；CsFtsZ2-1基因可響應鹽脅迫，CsFtsZ1、CsFtsZ2-1和CsFtsZ2-2可響應冷脅迫，CsFtsZ1和CsFtsZ2-1可響應白粉病病原菌侵染。