一種檢測牛奶中喹諾酮類藥物的高效液相色譜-串聯質譜方法

摘 要：本文基于高效液相色譜-串聯質譜建立了一種高精密度檢測牛奶中喹諾酮類藥物的方法，并對所建立的方法進行了方法學的考察與驗證。本研究參考已有的標準，對標準的前處理步驟進行優化，最后采用高效液相色譜-串聯質譜進行分析。20種喹諾酮類藥物的標準曲線相關系數為0.995 59～0.999 91，方法檢出限為0.051 4～0.928 μg/kg，回收率為73.6％～110.0％，相對標準偏差為1.33％～7.69％。該方法前處理簡便、高效，所得結果檢出限低，回收率較好，精準度高，重復性好，可以為檢驗牛奶中喹諾酮類藥物提供有力的方法支撐。

關鍵詞：喹諾酮類藥物；高效液相色譜-串聯質譜；高精密度；高回收率

中圖分類號：TS252.7 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2024）05-0081-08

喹諾酮類藥物是一種具有抗菌譜廣、抗菌力強、價格低廉等特點的人工合成抗菌藥，其作用機制是抑制DNA回旋酶發揮作用，導致mRNA與蛋白質合成失控從而達到殺死細菌的目的[1]。常見的喹諾酮類藥物有諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星等，常用于預防和治療畜禽細菌性疾病[2]。但這也不可避免地導致藥物在動物體內殘留，繼而經口攝入進入人體，對人類健康產生不良影響[3]。喹諾酮類藥物可對人體造成多系統的不良反應，包括胃腸道不適、中樞神經系統不良反應、肌腱炎及反應性關節炎、影響軟骨發育以及肝臟損傷等[1，4]。

牛奶是日常生活中十分常見的飲品，含有豐富的蛋白質、脂肪等，具有很高的營養價值。牛奶在生產、運輸、包裝到銷售的過程中均存在被污染的可能，從而對人體健康產生不良影響。其中抗菌藥濫用導致的藥物殘留是不容忽視的問題，而牛奶中喹諾酮類藥物的殘留現象較為普遍，已成為一個嚴重的食品安全問題[5]。因此，建立準確測定牛奶中喹諾酮類藥物殘留的方法至關重要，對保障牛奶等乳產品的食品質量安全和降低健康風險具有重要意義。目前，牛奶中喹諾酮類藥物的檢測方法主要有免疫學方法、高效液相色譜法、超高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）等[6-8]。其中高效液相色譜-串聯質譜法對復雜樣本的分離能力和定性效果好，可同時檢測多種藥物殘留，具有選擇性和靈敏度高的特點，應用廣泛[9]。

現存大多數研究檢測的喹諾酮類藥物種類較少，不夠全面；現行國家標準GB 29692—2013《牛奶中喹諾酮類藥物殘留量的測定 高效液相色譜法》也只規定了11種喹諾酮類藥物的測定方法[10]。因此，有必要開發一個包括更多種類藥物的測定方法。本研究以牛奶為樣本，在國家標準的基礎上進行優化，建立簡便、快速、可重復性高的前處理方法，采用高效液相色譜-串聯質譜法對樣本中的依諾沙星、環丙沙星、達氟沙星、麻保沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西諾沙星、奧比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星、諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星以及氧氟沙星這20種喹諾酮類藥物進行準確的定性定量檢測，以期為喹諾酮類藥物的檢測提供有力的方法及技術參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Aglient 1290超高效液相色譜儀，美國AB Sciex Triple Quad? 5500質譜儀，OAN-EVAP 24型全自動氮吹儀，日本TAITEC Mix-VR多管漩渦混合儀，梅特勒AG285型天平，IKAKS501型旋渦混合器，德國Sigma 3K15冷凍離心機，Millipor超純水儀，新芝SB-1200DT型超聲波清洗機。

1.2 材料與試劑

乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；甲酸（色譜純）；0.2％甲酸甲醇溶液（V甲醇∶V甲酸=100∶0.2）；甲醇水溶液（V甲醇∶V水=1∶1）。

QuEChERS緩沖鹽試劑袋；Waters PRIME HLB（6cc 200 mg）固相萃取柱；快速定量濾紙。

1.3 樣本制備

量取適量牛奶，裝入潔凈容器作為試樣，密封并標記，放置于－18 ℃冰箱中備用。

1.4 標準溶液的配制

準確稱取20種喹諾酮類藥物（依諾沙星、環丙沙星、達氟沙星、麻保沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西諾沙星、奧比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星、諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星）標準品，用甲醇分別配成1 000 μg/mL的標準儲備液，－20 ℃冰箱中保存，有效期 12個月；分別移取適量1 000 μg/mL的標準儲備液于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成100 μg/mL混合標準溶液，－20 ℃冰箱中保存，有效期6個月；再移取100 μg/mL混合標準溶液稀釋為10 μg/mL的混合標準工作液。

1.5 樣本前處理

準確稱取試樣5.00 g于50 mL離心管中，加入0.2％甲酸甲醇溶液10 mL，渦旋混勻后振蕩5 min，超聲提取5 min，5 000 r/min 離心5 min，收集上清液；向上清液中加入QuEChERS緩沖鹽試劑袋，充分渦旋混合1 min后，5 000 r/min離心10 min，取上清液過快速定量濾紙，所得濾液收集備用。

移取上述濾液4.0 mL，過PRIME HLB固相萃取柱洗脫，準確移取2.5 mL洗脫液至15 mL離心管內，在40 ℃水浴下氮氣吹干，再用甲醇水溶液（體積比1∶1）定容至1.00 mL，渦旋后過0.22 μm濾膜，待HPLC-MS/MS分析。

1.6 HPLC-MS/MS條件

1.6.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相A相為0.1％甲酸水溶液；流動相B相為甲醇；柱溫為40 ℃；進樣量5.0 μL。梯度洗脫程序見表1。

1.6.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監測；電噴霧電壓為5 500 V；離子源溫度為600 ℃；氣簾氣壓力為28 psi；碰撞氣壓力為10 psi；霧化氣壓力為55 psi；輔助加熱氣壓力為60 psi。

定性離子對、定量離子對、采集時間、去簇電壓及碰撞能量見表2。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

按方法條件設置儀器參數，16種喹諾酮類藥物（依諾沙星、環丙沙星、達氟沙星、麻保沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西諾沙星、奧比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星）配制濃度為1.00、2.00、20.00、100.00、200.00、300.00 ng/mL的混合標準工作溶液，其余4種喹諾酮類藥物（諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星）配制濃度為1.00、2.00、4.00、20.00、40.00、60.00 ng/mL的混合標準工作溶液，待儀器參數穩定后，對系列標準樣本溶液進行測定，繪制標準曲線，相關系數r的范圍為0.995 59～0.999 91。具體見表3。

2.2 方法檢出限確定

以空白牛奶樣本為基質，做7個平行添加試驗，陽性添加20種喹諾酮類藥物的濃度均為0.500 0 μg/kg，按照1.4方法進行前處理，進行上機測定，測得方法檢出限范圍為0.051 4 ～0.928 0 μg/kg，具體見表3。計算公式如下：

檢出限（μg/kg）=K·Sb·C/X

式中：K取3；Sb為平行測試樣含量的標準偏差；C為加標濃度，μg/kg；X為平行試樣含量的平均值。

2.3 回收率及精密度確定

以空白牛奶樣本為基質，向牛奶樣本中添加16種喹諾酮類藥物（依諾沙星、環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西諾沙星、奧比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星）項目混標0.5、10.0、100.0 μg/kg濃度水平，其余4種喹諾酮類藥物（諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星）項目混標0.5、2.0、20.0 μg/kg濃度水平進行加標回收試驗。按照方法進行前處理，上機測試，結果如表4及表5所示。

根據表4與表5中相對標準偏差和回收率結果可發現，該方法的相對標準偏差較低，且回收率表現較好，回收率為73.6％～110.0％，相對標準偏差為1.33％～7.69％。該方法的檢出限較低，同時重復性較好，并且能保持較為優異的回收率，可用于20種喹諾酮類藥物的準確定性、定量檢測。

3 結論

本研究在現存標準的基礎上，對牛奶中喹諾酮類藥物的前處理過程進行了優化：純化步驟采用QuEChERS緩沖鹽試劑袋對樣本進行初純化，同時緩沖鹽能夠更好地平衡提取體系的pH和防止樣本乳化；使用PRIME HLB小柱進行進一步純化，可以進一步降低基質干擾。在高效液相色譜-串聯質譜的分析中也得到了較為滿意的回收率、穩定性和精密度結果。因此，本研究建立了一種基于高效液相色譜-串聯質譜檢測牛奶中喹諾酮類藥物的簡便測定方法，為相關行業檢測工作提供了檢測方法及技術參考。

參考文獻

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作者簡介：韓銀濤（1982－ ），男，學士，高級獸醫師，主要從事動物疫病預防控制相關工作；E-mail：18738294@qq.com

共同第一作者：龐李艷（1991－ ），女，學士，獸醫師；E-mail：348776239@qq.com

*通信作者：次仁玉珍（1994－ ），女，學士，助理獸醫師；E-mail： 2449552533@qq.com

吳凱（1991－ ），男，學士，助理獸醫師；E-mail： 465358852@qq.com