基于轉錄組分析枇杷響應干旱脅迫的分子機制

摘要：為了探索枇杷對于干旱脅迫響應和耐受性的分子機制，鑒定可用于培育抗旱枇杷新品種的關鍵基因，為枇杷抗旱機制提供理論依據，以白玉枇杷為試驗材料，通過轉錄組測序（RNA-Seq）篩選響應干旱脅迫的差異表達基因。以正常供水為對照，進行短期干旱脅迫處理，RNA-Seq篩選差異表達基因（DEG），并對差異表達基因進行GO和KEGG功能富集分析。結果表明，RNA-Seq共鑒定出3 270個DEG，其中上調1 810個，下調1 460個。GO富集分析表明，一些脅迫響應基因在干旱處理后顯著上調。KEGG富集分析表明，植物MAPK信號通路、植物激素信號轉導、類胡蘿卜素生物合成等相關DEG在響應脅迫中發揮關鍵作用。對DEG深入分析發現，干旱脅迫后，抗氧化酶基因、脫落酸（ABA）生物合成基因NCED、ABA信號通路基因顯著上調。此外，通過分析轉錄因子，發現枇杷主要通過調控bHLH、bZIP、AP2/ERF、GRAS、HD-Zip、MYB、MYB_related、NAC、WRKY這9個家族轉錄因子的表達來響應干旱。

關鍵詞：枇杷；干旱脅迫；轉錄組分析；差異基因表達

中圖分類號：S667.301  文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）17-0027-07

收稿日期：2023-09-26

基金項目：江蘇省高等學校基礎科學（自然科學）研究面上項目（編號：22KJD210003）；江蘇省珍稀樹種白沙枇杷種質資源保護與培育長期科研基地項目（編號：LYKJ［2020］28）；江蘇省現代農業（特色果樹）產業技術體系建設專項（編號：JATS［2021］395）；蘇州農業職業技術學院博士提升計劃科研啟動基金（編號：BS［2022］01）。

作者簡介：趙 雙（1990—），女，山東聊城人，博士，講師，主要從事果樹生理生態和分子育種研究。E-mail：zhsh812972738@126.com。

通信作者：郄紅麗，碩士，高級農藝師，研究方向為常綠果樹種質資源收集與評價。E-mail：75864268@qq.com。

枇杷（Eriobotrya japonica）原產于我國，是典型的亞熱帶常綠果樹。枇杷果實于夏初成熟，味酸甜，皮薄多汁，營養豐富，深受人們喜愛；白肉枇杷是枇杷中的極品，已被江蘇省列為重點發展的應時鮮果之一［1-2］。枇杷根系分布淺，須根稀少，對水分要求較高；我國枇杷果園大多建在灌溉條件差的山坡上，特別容易受干旱脅迫影響［3-5］。季節性干旱嚴重影響枇杷樹體的生長發育及其果實的產量與品質［6-7］。江蘇省蘇州市是我國枇杷傳統種植四大產區之一。近年來高溫、干旱等極端天氣時有發生，嚴重影響蘇州市枇杷產業的發展。目前有關枇杷耐旱性的研究仍相對較少，亟待進行探索枇杷對干旱脅迫響應和耐受性的分子機制、鑒定可用于培育抗旱枇杷新品種關鍵基因等相關研究。

RNA-Seq技術是識別新轉錄本和分析基因表達譜的有力方法。近年來，研究人員利用RNA-Seq技術對枇杷特定生物學性狀的轉錄組進行分析，并成功鑒定出大量候選基因或轉錄本［8-12］。本研究對白玉枇杷品種進行干旱脅迫處理，利用 RNA-Seq 技術進行轉錄組分析以探索枇杷響應干旱脅迫的分子機制，以期為探索參與枇杷抗旱響應的基因表達模式和信號通路提供新思路，也為枇杷的抗旱基因工程育種提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理方法

本研究于2023年3—6月在江蘇省常綠果樹工程研究中心進行。選擇長勢一致、健康且種植于營養質量相同基質的2年生白玉枇杷植株，在蘇州農業職業技術學院東山校區（120°40′E，31°08′N）溫室中進行干旱處理。將白玉枇杷植株澆透水后計為 0 d，并收集枇杷葉片樣品；而后停止供水，使其遭受干旱脅迫，并于干旱處理9 d時收集枇杷葉片樣品。干旱處理0 d設為對照組，干旱處理9 d設為處理組。所有樣品立即使用液氮速凍，在 -80 ℃ 超低溫冰箱中保存，以便用于后續 RNA-Seq 和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析。

1.2 白玉枇杷葉片總 RNA 提取和cDNA合成

根據制造商的試劑盒說明書，使用植物 RNA 分離試劑盒提取白玉枇杷葉片的總RNA［Wolact，威邦生命科學（香港）有限公司］。根據制造商的試劑盒說明書，使用PrimeScript第一鏈cDNA合成試劑盒（TaKaRa公司，日本）反轉錄合成單鏈cDNA。

1.3 白玉枇杷葉片轉錄組測序

白玉枇杷葉片的RNA樣品質檢、cDNA文庫構建等RNA-Seq與分析工作委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。根據Zhou等的方法［13］進行轉錄組分析。

1.4 轉錄組結果驗證

隨機選取轉錄組結果中給出的差異表達基因，使用在線軟件Primer3（https：//primer3.ut.ee/）設計qRT-PCR引物（表1），以白玉枇杷干旱與對照處理的cDNA為模板，使用Bio-Rad CFX Opus 96（Bio-Rad）熒光定量PCR儀進行表達分析，熒光定量PCR的程序按照熒光實時定量染料的說明書進行設定。選用枇杷EjActin為內參基因［14］。通過2ΔΔCT方法計算基因的相對表達量［15］。使用熔解曲線確定擴增片段的特異性。

1.5 試驗數據處理

使用SPSS Statistics 17.0軟件中的單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）進行統計分析。進行雙變量分析以測試2個因素之間的相互作用，不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。試驗數據表示為平均值±標準差，并使用Office Excel作柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 白玉枇杷葉片響應干旱脅迫的轉錄組分析

為探索干旱條件下枇杷品種響應干旱的分子遺傳機制，對干旱脅迫9 d（處理組）和對照樣品進行RNA-Seq分析。分析結果（表2）顯示，6個枇杷干旱與對照樣品共獲得了277.3 Mbp clean reads，經過原始數據過濾，測序錯誤率檢查和GC含量分布檢查后，每個樣品平均獲得46.2 Mbp clean reads，與枇杷基因組的匹配率約為91％。

基于基因的FPKM值（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads），通過皮爾森相關系數計算干旱處理組與對照組各3個生物學重復之間的相關性。由圖1可知，對照組和干旱處理組的3個生物學重復之間的相關性均高于0.9，重復性好，可用于進一步分析。

由圖2可見，在干旱處理9 d后，共檢測到 3 270 個差異表達基因（差異表達倍數>2，P<0.05），其中上調基因為1 810個，下調基因為1 460個。

2.2 轉錄組測序結果的驗證

為了進一步驗證轉錄組結果的準確性，從轉錄組數據中選取16個差異表達基因（表3）進行 qRT-PCR 驗證。由圖3可見， 16個基因的表達變化趨勢與轉錄組的結果一致。且轉錄組和qRT-PCR結果呈顯著正相關（r2=0.976），表明轉錄組的測序結果是可靠的。

2.3 轉錄組差異表達基因的GO富集分析

為了進一步了解白玉枇杷對干旱脅迫反應的潛在機制，對干旱脅迫下白玉枇杷葉片的差異表達基因進行GO富集分析。GO分析結果表明，一些與脅迫途徑相關的基因在干旱處理后顯著上調，包括對缺水的響應、氣孔運動的調節、對氧化應激的響應、對活性氧的響應；另外，部分與轉錄調控、蛋白質磷酸化、信號轉導等相關的基因在干旱處理后上調（圖 4-a）。而大量與生長素激活信號通路、生長素介導的信號通路調控、生長素極性運輸的生物通路相關的基因在干旱條件下下調；此外，光合作用、生長調節、氨基酸轉運、對水楊酸的反應等生物途徑相關基因在干旱處理后下調（圖4-b）。

多種非生物脅迫能夠導致活性氧水平的增加，而活性氧累積可以引起氧化脅迫，進而對植物細胞和細胞器造成損害。由表4轉錄組分析結果可知，干旱條件下，2個過氧化物酶（POD）、1個抗壞血酸過氧化物酶（APX）、2個谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）顯著上調，這些酶參與植物體內活性氧的清除。

2.4 轉錄組差異表達基因的KEGG富集分析

為了確定白玉枇杷干旱響應的代謝途徑，對差異表達基因進行KEGG富集分析，并評估了20條富集最明顯的途徑。由圖5可見，富集程度最高的途徑包括植物MAPK信號通路、植物激素信號轉導、光合作用-天線蛋白、類胡蘿卜素生物合成、淀粉和蔗糖代謝。

2.5 干旱脅迫下枇杷葉片植物激素信號轉導途徑相關的差異表達基因分析

通過KEGG富集分析發現，植物激素信號轉導在響應干旱脅迫中至關重要。轉錄組分析結果（表5）顯示，干旱處理后，脫落酸（abscisic acid，ABA）信號通路中的多個ABRE結合因子（abscisic acid responsive elements-binding factor，ABF）、蔗糖非酵解型蛋白激酶2（SnRK2）、3個ABA生物合成基因 9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）的表達水平顯著上調；生長素信號通路中，多個生長素/吲哚-3-乙酸（Aux/IAA）家族成員呈上調趨勢。

2.6 干旱下枇杷葉片中發現的差異表達轉錄因子

轉錄因子通過調控一系列下游目標基因，在非生物脅迫響應等多個生物過程中發揮重要作用。為挖掘枇杷葉片中響應干旱脅迫的轉錄因子，本研究篩選出轉錄組數據中有差異表達的所有轉錄因子。RNA-Seq結果共鑒定出255個轉錄因子，其中bHLH、bZIP、AP2/ERF、GRAS、HD-Zip、MYB、MYB_related、NAC、WRKY這9個轉錄因子家族的成員在差異表達轉錄因子中數量較多（圖6）。差異表達轉錄因子中，大多數bHLH、GRAS家族成員在干旱處理后轉錄水平下調，而差異表達轉錄因子中bZIP、AP2/ERF、NAC、HD-Zip家族的多數成員在干旱處理后轉錄水平上調。

3 討論與結論

干旱脅迫會導致植物細胞中活性氧過量累積，過量的ROS會引起氧化應激反應，破壞膜和其他重要的大分子，例如光合色素、蛋白質、DNA、脂質，進而造成氧化損傷［16-18］。研究表明，干旱脅迫下，植物通過觸發酶抗氧化防御系統，清除活性氧，減輕急性細胞損傷，保持膜的完整性［19-20］。本研究表明，干旱處理后，與對氧化應激的響應、對活性氧的響應途徑相關的基因顯著上調，且編碼抗氧化酶基因POD、APX、GPX顯著上調。這些數據表明，干旱脅迫下，枇杷通過調控抗氧化酶基因的表達，清除活性氧，降低氧化損傷，提高其耐旱性。

植物激素ABA是干旱脅迫響應的關鍵調節劑。干旱脅迫下，植物組織和葉片中的ABA含量增加，改變了許多離子通道的活性，觸發氣孔關閉［21-22］。研究表明，過表達AtNCED3提高了轉基因擬南芥的內源ABA水平，過表達AtNCED3轉基因植株的葉片蒸騰速率低于野生型，其耐旱性增強［23］。本研究中，干旱脅迫后，與氣孔運動調節途徑相關的基因顯著上調，且ABA生物合成關鍵的限速酶NCED顯著上調。ABA主要通過信號通路來實現干旱脅迫響應的生物學功能。研究表明，ABA信號途徑中SnRK2通過磷酸化激活下游轉錄因子ABF等，進而調控下游基因的表達，在植物逆境脅迫響應中起著正調控作用［24-25］。本研究干旱處理后，3個ABF和SnRK2顯著上調。以上數據表明，干旱脅迫下，枇杷通過ABA合成基因的表達促進氣孔關閉，減少水分散失，以及調控ABA信號通路基因的表達，響應干旱脅迫。

轉錄因子通過與干旱應答基因的啟動子互作，來調控干旱應答相關基因的轉錄，對干旱脅迫響應發揮重要調節作用［8，26］。本研究從轉錄組中鑒定出255個轉錄因子。干旱脅迫下，一系列正調控抗旱的轉錄因子表達上調，包括HD-Zip家族的EVM0023669、EVM0026197。EVM0026197是蘋果中MdHB-7的同源基因，蘋果中MdHB-7通過促進干旱引起的內源性ABA積累，促進氣孔關閉，清除活

性氧，進而提高轉基因植株的耐旱性［18］。EVM0023669是MdHB7-like的同源基因，在蘋果中過表達MdHB7-like可增強蘋果的耐旱性，而MdHB7-like的干擾植株則對干旱更敏感［27］。NAC家族中EVM0001934是擬南芥中NAC072/RD26的同源基因，在擬南芥中NAC072/RD26的過表達可提高轉基因植株對干旱脅迫耐受性［28］，NAC072RD26基因的同源煙草基因NtabNAC087通過影響葉片的生理結構，增加抗氧化物酶活性和滲透調節物質含量，進而提高轉基因植物對干旱脅迫的耐受性［20］。

綜上所述，RNA-Seq鑒定的差異表達基因在一定程度上解釋了枇杷響應干旱脅迫的分子機制，期待可為今后枇杷干旱育種提供基因資源和理論基礎。

參考文獻：

［1］蔣際謀，陳秀萍，鄧朝軍，等. 我國枇杷產業優劣勢分析與發展對策［J］. 中國園藝文摘，2018，34（4）：46-48，68.

［2］王化坤，陸愛華，高志紅，等. 江蘇枇杷產業發展現狀及展望［J］. 中國果樹，2018（2）：94-98.

［3］羅華建，劉星輝.干旱對枇杷生長的影響［J］. 中國南方果樹，2004，33（3）：26-27.

［4］王劍毛，郭亞端，劉進平，等. 干旱脅迫對“早鐘6號” 枇杷幼苗生長及生理特性的影響［J］. 中國南方果樹，2018，47（6）：34-38，44.

［5］Ballester C，Buesa I，Soler E，et al. Postharvest regulated deficit irrigation in early-and intermediate-maturing loquat trees［J］. Agricultural Water Management，2018，205：1-8.

［6］Gugliuzza G，Talluto G，Martinelli F，et al. Water deficit affects the growth and leaf metabolite composition of young loquat plants［J］. Plants，2020，9（2）：274.

［7］Zhang Y，Yao Q，Li J，et al. Contributions of an arbuscular mycorrhizal fungus to growth and physiology of loquat （Eriobotrya japonica） plants subjected to drought stress［J］. Mycological Progress，2015，14（10）：84.

［8］王 丹，龔榮高. 干旱脅迫下枇杷葉片的轉錄組分析［J］. 華北農學報，2017，32（1）：60-67.

［9］Lou X M，Wang H K，Ni X P，et al. Integrating proteomic and transcriptomic analyses of loquat （Eriobotrya japonica Lindl.） in response to cold stress［J］. Gene，2018，677：57-65.

［10］Wang D，Chen Q Y，Chen W W，et al. Physiological and transcription analyses reveal the regulatory mechanism of melatonin in inducing drought resistance in loquat （Eriobotrya japonica Lindl.） seedlings［J］. Environmental and Experimental Botany，2021，181：104291.

［11］Zhang J Y，An H S，Zhang X Y，et al. Transcriptomic analysis reveals potential gene regulatory networks under cold stress of loquat （Eriobotrya japonica Lindl.）［J］. Frontiers in Plant Science，2022，13：944269.

［12］常曉曉，彭 程，陳慧瓊，等. 枇杷果實采前皺縮的轉錄組分析［J］. 果樹學報，2023，40（7）：1342-1353.

［13］Zhou K，Hu L Y，Li Y，et al. MdUGT88F1-mediated phloridzin biosynthesis regulates apple development and Valsa canker resistance［J］. Plant Physiology，2019，180（4）：2290-2305.

［14］李曉穎，徐紅霞，陳俊偉. 枇杷WRKY轉錄因子鑒定與表達分析［J］. 園藝學報，2019，46（5）：939-954.

［15］Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method［J］. Methods，2001，25（4）：402-408.

［16］Sairam R K，Srivastava G C，Agarwal S，et al. Differences in antioxidant activity in response to salinity stress in tolerant and susceptible wheat genotypes［J］. Biologia Plantarum，2005，49（1）：85-91.

［17］Hasanuzzaman M，Bhuyan M H M B，Anee T I，et al. Regulation of ascorbate-glutathione pathway in mitigating oxidative damage in plants under abiotic stress［J］. Antioxidants，2019，8（9）：384.

［18］Zhao S，Gao H B，Jia X M，et al. The HD-Zip I transcription factor MdHB-7 regulates drought tolerance in transgenic apple （Malus domestica）［J］. Environmental and Experimental Botany，2020，180：104246.

［19］Gupta A，Rico-Medina A，Cao-Delgado A I.The physiology of plant responses to drought［J］. Science，2020，368（6488）：266-269.

［20］王世澤，劉 杰，楊志曉，等. 過表達和敲除NtabNAC087基因對煙草響應干旱脅迫的影響［J］. 核農學報，2023，37（7）：1307-1314.

［21］Lee S C，Lim C W，Lan W Z，et al. ABA signaling in guard cells entails a dynamic protein-protein interaction relay from the PYL-RCAR family receptors to ion channels［J］. Molecular Plant，2013，6（2）：528-538.

［22］Jiang Q，Yang J，Wang Q，et al. Overexpression of MdEPF2 improves water use efficiency and reduces oxidative stress in tomato［J］. Environmental and Experimental Botany，2019，162：321-332.

［23］Iuchi S，Kobayashi M，Taji T，et al. Regulation of drought tolerance by gene manipulation of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，a key enzyme in abscisic acid biosynthesis in Arabidopsis［J］. The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2001，27（4）：325-333.

［24］陳 虎，管 榮，劉長英，等. 脫落酸信號調控植物干旱脅迫響應的研究進展［J］. 成都大學學報（自然科學版），2023，42（1）：23-27，39.

［25］郭樹娟，孫 月，鄭昊元，等. 小麥ABF/AREB/ABI5基因家族全基因組鑒定與表達分析［J］. 農業生物技術學報，2023，31（4）：667-681.

［26］張 軍，賴 銘，陳 佳，等. 轉錄組學在植物響應干旱迫中的研究進展［J］. 現代農業科技，2023，12：14-22.

［27］Zhao S，Gao H B，Jia X M，et al. MdHB7-like confers drought tolerance and improves water-use efficiency through modulating stomatal density in apple （Malus domestica）［J］. Scientia Horticulturae，2022，294：110758.

［28］Tran L S P，Nakashima K，Sakuma Y，et al. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-Inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter［J］. The Plant Cell，2004，16（9）：2481-2498.