3種中草藥浸提液對梨黑斑病菌的拮抗篩選

摘 要：本文采用菌絲生長速率法，以三七、鐵皮石斛、小球藻3種中草藥為試材，研究中草藥單劑和復合劑配方對梨黑斑病病原菌菌絲生長的拮抗效果，以期篩選出抑菌效果最佳的浸提液單劑和復合劑。結果表明：單劑中小球藻在濃度為100 mg/mL時抑菌效果最好，與其他處理有顯著差異，其抑菌率為68%，且隨著濃度的降低，抑菌效果越差；其次為三七、鐵皮石斛。復合劑中鐵皮石斛、三七、小球藻（體積比1∶2 ∶3）濃度為100 mg/mL時，對梨黑斑病菌的抑制作用最好，抑菌率為69%，且小球藻比例越高，抑菌效果就越明顯，其次分別為三七、鐵皮石斛。由此可知復合劑中起決定作用的中草藥從高到低為：小球藻＞三七＞鐵皮石斛；而3種中草藥配比相同時抑菌效果最弱，可能是因其抑菌效果相互抵消造成的。由此可知小球藻是防治梨黑斑病病菌潛在的植物資源，具有很大的研發前景。

關鍵詞：梨黑斑病；浸提液；中草藥；拮抗

中圖分類號：S436.612.1+4 文獻標識碼：A DOI編碼：10.19440/j.cnki.1006-9402.2024.03.009

全世界約80多個國家有梨（Pyrus）規模化生產，梨品種約2 000個，而我國就有1 200多個。梨是我國第三大果樹，其種植面積、產量及出口量均居世界前例[1-2]。梨產業在我國農業中占有重要地位并具有一定的生產規模，是很多地方的農業支柱產業。而梨黑斑病的發生，對梨產量和質量造成了嚴重的影響。

梨黑斑病是梨產業中最常見及最具破壞性的病害之一，由鏈格孢菌Alternaria alternate（Fr.）Keissl引起，該病長期以來普遍發生，已成為制約我國梨果生產的關鍵因素[3-6]。目前生產上主要依靠化學防治，雖然防治效力最高，時間最短，使用方法簡便，但由于長期使用，存在抗藥性、農藥殘留和環境污染等問題[7-8]。因此，尋找安全高效的防治方法對提高果品產量與質量具有重要意義。其中，生物防治手段具有安全、低毒、高效等特點，是當前病害防治研究的方向和熱點。有研究發現酵母菌和枯草芽孢桿菌對梨黑斑病菌有一定的抑制效果[9-11]，高小寬研究三七、五味子和白果提取物對梨黑斑病菌均有不同程度的抑制作用[12]。但當前可利用的梨樹黑斑病菌拮抗菌資源還很有限，仍需進一步挖掘和研究。

本文以3種中草藥提取物為試材，以梨黑斑病菌為研究對象，分析3種中草藥對梨黑斑病菌的抑菌活性，為進一步研制和開發新型天然殺菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 小球藻粉（Chlorella vulgaris）由東臺市賜百年生物工程有限公司提供，三七粉（Panax pseudo-ginseng）和鐵皮石斛粉（Dendrobium officinale Kimura et Migo）由安徽東方帝維生物制品股份有限公司提供。梨黑斑病菌（Botryosphaeria€燿othidea）由衡水學院微生物實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 浸提液的制備 將中草藥粉碎過篩，取50 g于錐形瓶中，加入200 mL70%乙醇攪拌均勻，然后封口。放入搖床震蕩1 min，靜置 24 h后放入超聲波清洗器（50 khz）提取10 min，立即攪拌抽濾，濾液在旋轉蒸發儀上進行旋轉蒸發（70 ℃，100 r/min），待溶液減少至約20 mL時停止旋轉蒸發，用70%乙醇定容至50 mL作為母液，編號后，放入4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 各浸提液對梨黑斑病菌絲生長的抑制作用 采用菌絲生長速率法，配制不同濃度的中草藥浸提液。取浸提液于100 mL已融化并冷卻至50 ℃的PDA培養基中，充分搖勻，并迅速倒入直徑為9 cm培養皿中，使提取物最終濃度為0.01、0.1、1 、10 、100 mg/mL。從恒溫生化培養箱中取出活化的梨黑斑病菌，用6 mm打孔器在菌餅外圍打取菌餅，挑取菌餅菌絲面朝下接種到浸提液單劑處理的PDA平板中央，以PDA培養基作為空白對照，重復3次。置于25 ℃恒溫箱中培養。待5 d后，采用十字交叉法測定菌落直徑并計算菌絲生長抑制率。

1.2.3 浸提液復合劑對梨黑斑病菌絲生長的抑制作用 將3種中草藥浸提液按照不同體積配比配制成12 mL的浸提液復合劑（見表1），取浸提液于100 mL已融化并冷卻至50 ℃的PDA培養基中。充分搖勻，并迅速倒入直徑為9 cm的培養皿中，使提取物復合劑最終濃度為0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 mg/mL，操作方法同上。

1.3 數據處理 用Excel軟件對數據進行處理，用SPSS22.0軟件進行方差分析，差異顯著性水平為5%（P<0.05）。

抑菌率/%=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑€？00%

2 結果與分析

2.1 各浸提液對梨黑斑病菌菌絲生長的抑制作用

由表2可知，隨著中草藥浸提液濃度的升高，梨黑斑病菌直徑越小，抑菌效果越好，即100 mg/mL＞10 mg/mL＞1 mg/mL＞0.1 mg/mL＞0.01 mg/mL；其中小球藻單劑濃度為100 mg/mL時抑制效果最好，其抑菌率為68%，且與其它處理呈顯著性差異；其次分別為三七、鐵皮石斛，抑菌率分別為39%、29%，且與其他處理呈顯著性差異，可知中草藥單劑抑菌效果為小球藻＞三七＞鐵皮石斛（見圖1）。三七、小球藻、鐵皮石斛單劑濃度為1 mg/mL、0.1 mg/mL、0.01 mg/mL時抑菌效果為負數，梨黑斑病菌落直徑大于對照CK的直徑，說明中草藥單劑在低濃度時不僅沒有抑菌效果，反而有促進梨黑斑病菌生長的效果，可見3種中藥浸提液單劑對梨黑斑病菌生長的效果為低濃度促進，高濃度抑制，且濃度越高抑菌效果越好。

2.2 浸提液復合劑對梨黑斑病菌菌絲生長抑制作用

由表3可知，中草藥復合劑濃度為100 mg/mL時抑菌效果最好，且與其他濃度的中草藥復合劑有顯著性差異，且隨著復合劑濃度的升高，抑菌效果越好。在復合劑配方不同時，3種中草藥相同配比時抑菌效果最弱，可能是因其抑菌效果相互抵消造成的；而在復合劑中，小球藻的濃度越高，抑菌效果就越明顯（如表2），可知復合劑中起決定作用的中草藥，從高到低為：小球藻＞三七＞鐵皮石斛。試驗中存在抑菌率為負數的情況，菌落直徑大于對照CK的直徑，說明中草藥復合劑在低濃度時不僅沒有抑菌效果，反而促進菌落生長。

3 結論

采用菌絲生長速率法測定3種中草藥浸提液單劑和復合劑對梨黑斑病菌抑制效果。分析可知單劑中100 mg/mL的小球藻，對梨黑斑病有較好的抑菌效果，抑菌率為68%，且與其它處理差異顯著；復合劑100 mg/mL時抑制效果最好，且與其它處理差異顯著，其中復合劑HSX（1∶2∶3）100 mg/mL時抑菌效果最好，抑菌率為69%，對梨黑斑病菌有明顯的拮抗作用。

不管是單劑還是復合劑，小球藻或小球藻配比多，其抑菌效果均比同水平其它處理好，可見小球藻是潛在防治梨黑斑病的資源，為進一步篩選防治梨黑斑病病菌的生物防治奠定了基礎。本項目組擬嘗試引進植物激素與浸提液互作，以期提高浸提液的抑菌率，這需要后續試驗驗證；且室內與室外試驗環境不同，實際效果還要通過后期的田間試驗來確定。

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