基于電子鼻技術的櫻花花香測定方法的建立

關鍵詞：櫻花；電子鼻；花香；正交試驗；種質鑒定

中圖分類號：S685.99 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）03—0281—08

植物花香是園林植物的重要性狀之一，也是植物吸引昆蟲授粉的重要表現信號，更是評價觀賞植物和鮮花的重要質量指標[1-2]。通常，人們對植物香型的研究主要通過頂空固相微萃取、氣相色譜- 質譜聯(lián)用技術和感官評價法。這些方法已經被運用于矮牽牛Petunia hybrida[3]、柚Citrusmaxima（Burm.）Merr[4] 和野茉莉Styrax japonicus[5]等芳香植物的鑒定和分析。但是大多數揮發(fā)性物質在花朵中含量極低，不能被人們的嗅覺所感知，因此感官評價法具有主觀性極強的缺點。氣相色譜- 質譜聯(lián)用技術對花成分的定性和定量分析精度高，但也存在儀器維護費用高、運行成本高、樣品預處理分析時間長等局限性[6]。

電子鼻是一種嗅覺模擬測試工具，通常由一系列非特異性、交叉反應的化學傳感器組成，能對氣味進行客觀的感知、分析和判斷。電子鼻技術具有不需要有機溶劑、測量時間短、靈敏度高、易于維護和檢測費用低等優(yōu)點[7]。張正武等[8] 利用電子鼻對隴南34 個花椒Zanthoxylum bungeanum品種進行了區(qū)分。潘雁紅等[9] 通過研究發(fā)現8 種竹筍Bambuseae species 能夠通過電子鼻被準確地區(qū)分開來。此外，電子鼻技術在花香[10-11]、茶葉[12]、果實品質[13-14]、肉制品[15] 等方面均有應用。

櫻花是櫻屬Cerasus Mill. 植物的總稱，屬于薔薇科Rosaceae 李亞科Prunoideae。櫻花作為聞名世界的觀賞植物，種類豐富、分布廣泛、花期集中、觀賞價值高。目前國內學者對櫻花的研究報道主要集中在育種[16-17]、脅迫[18]、抗氧化能力[19]及其致病性研究[20]，而對于花香的研究暫無報道。

因此，本研究以山櫻花Cerasus serrulate 為試材，采用正交設計，分析不同頂空平衡時間、樣品量、花期和采樣時間對電子鼻測定櫻花花香的影響，篩選最佳測定參數。基于最佳參數，開展基于電子鼻技術的不同櫻花的種質鑒定分析。以期建立基于電子鼻技術的櫻花花香氣味快速測定方法應用于櫻花種質鑒定，也為其他香源植物的香型分析提供共性技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于江蘇省南京市南京林業(yè)大學（31°52′11.10″N，118°46′5.53″E），屬北亞熱帶濕潤氣候，四季分明，雨量充沛，土壤肥沃。年均降水日數為117 d，年均降水量1 106 mm，相對濕度76%，無霜期237 d。

1.2 植物材料

試驗材料為3 種具有不同表型性狀的櫻花，均采自南京林業(yè)大學校園內多年生栽培群體。其中東京櫻花Cerasus9963260f3673d25c3c8b426d4ba9105e yedoensis 為傘形總狀花序，有花3 ～ 4 朵，先葉開放，花瓣數5，花色為粉紅色；山櫻花為傘房總狀花序，有花2 ～ 3 朵，花葉同放，花瓣數5，花色為白色；日本晚櫻Cerasusserrulata var.lannesiana 為傘形花序，有花3 ～ 5 朵，花葉同放，花瓣數20 ～ 45，花色為紫紅色。于2023 年3 ～ 4 月選擇晴天進行采樣。選擇生長健壯、無機械損害和病蟲害、樹形大小基本一致的植株。采摘著色均勻的花朵立即放置聚乙烯密封袋內混勻花樣后帶至實驗室內，在室溫條件下進行檢測。

1.3 試驗儀器

PEN3 型便攜式電子鼻（德國AIRSENSE 公司），該電子鼻含有10個金屬氧化物傳感器，不同的傳感器對不同的化學成分有不同的響應值。各傳感器的類型及性能如表1所示。

1.4 試驗方法

1.4.1 電子鼻分析條件

電子鼻檢測采用頂空抽樣的方法[8]。電子鼻測定參數設置為內部流量180 mL/min， 進樣流量180 mL/min，樣品間隔1 s，清洗時間60 s，自動調零時間5 s，樣品準備時間5 s，測量時間70 s。

1.4.3 基于電子鼻技術的櫻花種質鑒定

以東京櫻花、山櫻花和日本晚櫻為研究對象，基于電子鼻檢測櫻花花香的最佳測定參數，利用電子鼻技術對不同櫻花花香的揮發(fā)性成分進行鑒定分析。

1.5 數據分析

在使用電子鼻檢測櫻花樣品時，取響應曲線平穩(wěn)階段（65 ～ 67 s）的平均值作為樣品分析的時間點。使用PEN3 自帶的Winmuster 數據處理軟件、SPSS26 軟件和Origin2021 軟件進行方差分析、主成分分析（PCA）、載荷分析（Loadings）及線性判別分析（LDA），利用Excel 軟件進行其他分析，采用Origin2021 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 基于電子鼻技術的櫻花花香測定條件篩選

2.1.1 不同處理櫻花花香的電子鼻雷達圖分析

圖1 是基于電子鼻技術對山櫻花16 個處理的櫻花香氣組成成分響應值構建的雷達圖。從圖1 可以看出，10 個傳感器對櫻花香氣組分的響應存在顯著差異（P＜0.01），響應值‘G/G0 值’分布于0.9 ～ 29 之間。W1C、W5S、W1S、W1W、W2W和W3S 傳感器對櫻花香氣組分響應值較大，響應值從高到低依次為W1W、W2W、W5S、W1S、W3S、W1C，其余傳感器對櫻花香氣組分響應值較小（G/G值≈ 1）。因此，優(yōu)選出W1C、W5S、W1S、W1W、W2W 和W3S 傳感器進行數據提取與分析。

2.1.2 不同因素對電子鼻響應特性的影響

不同因素對電子鼻各傳感器（W1C、W5S、W1S、W1W、W2W 和W3S 傳感器）的影響見表3。從表3 可知，不同因素對電子鼻測定櫻花花香的影響差異顯著，對電子鼻傳感器的響應影響從大到小依次是不同花期、樣品量、采樣時間，在不同頂空平衡時間因素下電子鼻各傳感器響應值極差均最小。從各因素的不同水平看，在不同頂空平衡時間因素中，水平1、4 高于水平2、3；樣品量中水平4 的電子鼻各傳感器響應值顯著高于其他水平，水平1、2、3 差異不顯著；在不同花期因素下，除了W1S 傳感器之外，其余傳感器在水平3 時的響應值高于其他水平，且與其他水平差異極顯著；采樣時間中各水平差異不顯著。說明電子鼻對盛開時期的櫻花花朵且樣品量為4 g 時響應較大。

2.1.3 不同處理櫻花花香主成分分析

圖2 是基于山櫻花香氣的電子鼻數據（W1C、W5S、W1S、W1W、W2W 和W3S 傳感器響應值G/G）構建的主成分分析圖（PCA）。第一主成分PC1 的貢獻率為71.7%，第二主成分PC2 的貢獻率為20.8%，總貢獻率達到92.5%，說明第一、第二主成分能很好地反映供試樣品的整體信息。從圖2 可以看出，3、6、8 和14 號處理組合與其他處理組合的樣本點沒有重疊，由此可以區(qū)分出3、6、8 和14 號處理。結合圖1 可知8 號處理各傳感器的響應值顯著高于其他處理，且與其他處理差異極顯著。因此，8 號處理，即ABCD 處理組合（在12：00 采集盛開時期的櫻花花朵4 g，在頂空平衡30 min 后進行電子鼻測定）的表現最優(yōu)，為電子鼻快速測定櫻花香氣的最優(yōu)組合。

2.2 基于電子鼻技術的櫻花種質區(qū)分

2.2.1 基于主成分分析和線性判別分析法的櫻花種質區(qū)分

采用PCA 和LDA 法對3 種櫻花進行分析（圖3），從圖3 可以看出，不同種櫻花的樣本點沒有重疊，每種櫻花樣本點均有特定的分布區(qū)域。PCA結果顯示第一主成分PC1 的貢獻率為99.33%，第二主成分PC2 的貢獻率為0.49%，這兩個主要成分解釋了總方差的99.82%（圖3A），不同種質區(qū)分度達到0.677 ～ 0.974。從LDA 分析結果可以看出（圖3B），判別式LD1 和判別式LD2 的貢獻率分別為75.30% 和23.95%，總貢獻率達到99.25%，稍低于PCA 的總貢獻率（99.82%），但不同種質區(qū)分度為1 高于PCA 分析的區(qū)分度，并且從LDA 分析圖中發(fā)現，每種櫻花樣本點相比于PCA 樣本點更為集中。

2.2.2 載荷分析

為了進一步確認電子鼻傳感器對櫻花花香揮發(fā)性成分響應值的貢獻大小，利用載荷分析（Loadings） 分析傳感器在當前條件下的相對重要性。從圖4 可以看出，第一主成分PC1 的貢獻率為82.4%，第二主成分PC2 的貢獻率為11.0%，總貢獻率為93.4%。傳感器W1W、W2W、W5S、W1S、W2S 和W3S 對第一主成分起正向貢獻作用，W6S 對第二主成分起主要正向貢獻作用。W1C、W3C、W5C 傳感器在第一主成分和第二主成分上均起負向貢獻作用。W1S 和W3S 主要是對烷烴類的物質有較強的敏感度，W5S、W1W 和W2W 主要是對氮氧化合物及硫化物有主要的貢獻力度（表1）。這表明烷烴類、氮氧化合物及硫化物類可能是區(qū)分櫻花種與品種香型的主要成分。

3 結論與討論

本研究基于電子鼻技術，以山櫻花為試材，采用雷達圖對電子鼻傳感器響應值進行評價，發(fā)現W1C、W5S、W1S、W1W、W2W 和W3S 傳感器對櫻花香氣組分響應值較大，其他傳感器響應值較小，G/G 值≈ 1，并依此對傳感器陣列進行了優(yōu)化。通過正交試驗極差分析和方差分析發(fā)現，不同因素對電子鼻測定櫻花花香的影響是差異顯著的，各因素對電子鼻傳感器響應影響大小依次為：花期＞樣品量＞采樣時間＞頂空平衡時間；從各因素的不同水平來看，頂空平衡時間和樣品量在水平4 時顯著高于其他水平（頂空平衡時間=60 min；樣品量=4 g），在花期中除W1S 傳感器外均在水平3 時響應值顯著高于其他水平（花期=盛花期），采樣時間中各水平差異不顯著；根據高響應值確定電子鼻測定櫻花花香的最佳組合為A2B4C3D2，即在12：00 采集盛開時期的花朵4 g，在頂空平衡30 min 后進行電子鼻測定。

基于最佳測定參數，利用山櫻花、東京櫻花和日本晚櫻等三種櫻花種質進行效果驗證。基于電子鼻技術對不同櫻花揮發(fā)性成分進行檢測，大多數傳感器對高濃度的揮發(fā)性成分的反應值有明顯的線性對應關系。通過PCA 分析和LDA 分析發(fā)現基于最佳測定參數利用電子鼻技術進行櫻花種質區(qū)分是可行的，3 種櫻花區(qū)分均顯著，且LDA 的區(qū)分度為1 高于PCA 分析的區(qū)分度（0.677 ～ 0.974）。LDA 分析的總貢獻率為99.25% 稍低于PCA 分析的總貢獻率99.82%，但從LDA 分析圖中發(fā)現，每種櫻花樣本點相比于PCA 樣本點更為集中，并且樣本點間并無重疊部分，說明LDA 分析法更適用于櫻花種質的區(qū)分，與曾輝[21] 使用電子鼻區(qū)分不同品種蘋果的結果一致。通過Loadings 分析發(fā)現，傳感器W1W、W2W、W5S、W1S、W2S 和W3S對第一主成分起正向貢獻作用，W6S 對第二主成分起主要正向貢獻作用，表明烷烴類、氮氧化合物及硫化物類可能是區(qū)分櫻花種質香型的主要成分。范俊俊[22] 采用電子鼻技術對108 份海棠種質開展海棠香型成分研究，分析發(fā)現烷烴類與氮氧化合物及硫化物類可能是區(qū)分海棠種與品種兩群體的香氣的主要作用成分，與本研究結果一致。

隨著櫻花新品種選育工作的不斷深入，櫻花新品種的數量不斷增加，櫻花的表型性狀存在豐富變異[23]。傳統(tǒng)的根據形態(tài)特征來進行櫻花種質鑒定難度越來越大。花香被譽為花卉的“靈魂”，是花卉“形、色、香”三要素之一，是評價花卉品質的重要依據，并有可能在花卉植物的抗逆性中起著關鍵作用[24]。花香揮發(fā)性成分主要由烷烴類、烯類、醇類、酮類、醛類、醚類、酯類及芳香族化合物等組成[25]。每一種花香揮發(fā)物都具有其獨特的氣味，它們以不同的結合方式、濃度以及比例使每一種櫻花具有獨特的香味，因此花香也被認為是種質區(qū)分的重要依據[26]。但香氣成分鑒定的技術還不夠成熟，目前氣相色譜- 質譜聯(lián)用技術在花香測定上比較廣泛[27]。氣相色譜- 質譜聯(lián)用技術對花成分的定性和定量分析精度高，但也存在儀器維護費用高、運行成本高、樣品預處理分析時間長等局限性，而電子鼻正好克服了這個缺點。電子鼻是一種嗅覺模擬測試工具，可以對氣味進行客觀地感知、分析和判斷。電子鼻技術具有不需要有機溶劑、測量時間短、靈敏度高、易于維護和檢測費用低等優(yōu)點[7]。該技術已經被應用于區(qū)分不同的花椒品種[8] 和竹筍品種[9]，鑒定果實品質[14]，鑒別綠茶成分[12] 和花香成分[10] 以及區(qū)分具有不同氣味強度的海棠類群[22]。這表明，該技術在花香分類和鑒定領域是可行的。

由于試驗種質收集數量有限，本研究僅選用了3 種櫻花作為研究對象，樣本量較少，在后續(xù)的研究中將其作為重點改進部分，擴大櫻花品種檢測數量，構建基于電子鼻技術的櫻花花香“指紋圖譜”，以期為櫻花種質鑒定提供參考，也為其他香源植物的香型分析提供共性技術參考。