低溫下冷適應性茵劑與超高溫茵劑聯用的堆肥效果評價

摘要：為了破解低溫條件下玉米秸稈堆肥處理時升溫難及堆肥成品腐熟度低的難題，本試驗在10℃條件下從常年堆積玉米秸稈場所下的土壤與玉米秸稈混合樣品中，篩選出3株菌株制成冷適應性菌劑，與已有的超高溫菌劑（≥50℃）聯合用于低溫條件下玉米秸稈的堆肥，探究兩類菌劑在堆肥過程中的作用，最終確立一種低溫條件下冷適應性菌劑與超高溫菌劑聯合應用進行堆肥的方法。結果表明：未添加菌劑（CK）、單接種冷適應性菌劑（T1）、單接種超高溫菌劑（T2）3組堆肥升溫效果不佳，最高僅能達到50℃左右；而在第0天加入冷適應性菌劑，分別在堆肥開始第0天（T3）、第2天（T4）、第4天（T5）加入超高溫菌劑的3組，不僅在堆肥初期升溫迅速，且能使堆體溫度在第5、6、7天時分別達到79.0、80.3、78.6℃，此外T3、T4、T5組的總有機碳降解率、種子發芽率也均高于CK、T1、T2組；與T5組相比，T3組升溫更順利，這與超高溫微生物在堆體中的適應過程有關。研究表明，在低溫條件下，冷適應性菌劑和超高溫菌劑聯合應用使堆肥效果提升顯著，25 d即可完成堆肥，且在堆肥開始時加入冷適應性菌劑的前提下，超高溫菌劑加入時間越早，其在堆體中發揮作用越順利，堆肥效果越好．

關鍵詞：低溫；冷適應性菌劑；超高溫菌劑；玉米秸稈；好氧堆肥

中圖分類號：S141.4 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）09-2117-09 doi：10.11654/jaes.2023 -1017

東北地區是我國玉米主要產地之一，玉米種植面積大，玉米秸稈是當前該地區最主要的農業廢棄物之一。好氧堆肥處理后進行肥料化利用是秸稈最為安全的利用途徑之一，好氧堆肥對溫度和菌種有較高的要求。我國東北地區秋季時間較短，而進入冬季后，氣溫下降使得自然微生物的活性顯著減弱，導致發酵周期延長，甚至無法完成堆肥。

在堆肥中添加低溫菌劑是應對低溫條件下堆肥初期升溫難的常用方法之一。張書敏等將篩選出來的低溫復合菌劑在8℃環境下用于玉米秸稈和牛糞堆肥，研究發現添加菌劑可使堆體快速升溫到50℃左右。雖然低溫菌劑可在低溫條件下幫助堆肥成功啟動，使在寒冷地區對玉米秸稈進行大規模好氧堆肥處理成為可能，但絕大部分低溫微生物在中高溫環境中，生存會受到威脅，使得低溫菌劑促進堆體繼續升溫的效果有限，甚至無法達到無害化處理要求。

添加超高溫菌劑能進一步提高堆肥效果，超高溫堆肥技術最顯著的特點是發酵溫度高（≥80℃），最高溫度可達93.4℃，其中的高溫微生物在高于50℃的環境可迅速增殖，同時大量產熱有效殺滅病原菌及雜草種子，促進堆肥清潔生產。崔鵬等研究發現超高溫微生物群落可使堆體中微生物群落更迅速地代謝有機物，產生更多熱量。這充分說明了超高溫菌劑在中高溫環境中可促進堆體大幅升溫，并能提高秸稈中有機物質降解率，同時可有效縮短堆肥周期，但其在低溫條件下無法發揮作用。

由于在低溫條件下單獨使用低溫菌劑或超高溫菌劑應用效果都不甚理想，本研究利用篩選出的冷適應性菌株制成的菌劑與已有的超高溫菌劑聯合，對玉米秸稈進行堆肥處理，以期解決東北地區秋收后玉米秸稈需要快速堆腐的問題，為大批量玉米秸稈的肥料化利用提供有效可行的方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 培養基

細菌培養采用LB培養基，真菌培養采用PDA培養基，復篩的鑒別培養基采用纖維素剛果紅培養基。

1.1.2 超高溫菌劑

供試超高溫菌劑是由河南省沃寶生物科技有限公司提供的商品菌劑，主要菌種為芽孢桿菌、放線菌、嗜熱菌等，有效活菌數≥1×1010個·g-1。

1.1.3 堆肥物料來源及基本性質

供試玉米秸稈取自吉林農業大學試驗田，經自然風干處理后通過機械粉碎為長3-5 cm的堆肥物料；供試雞糞取自長春某養殖場。各堆肥物料基本性質見表1。

1.2 冷適應性菌劑的制備方法

1.2.1 冷適應性菌株的初篩

篩選冷適應性菌株的樣品為常年堆積玉米秸稈場所下的土壤與玉米秸稈混合樣品，取自吉林農業大學試驗田，取樣后立即運回實驗室進行微生物篩選及培養。

在無菌環境下，取上述10 g樣品至滅菌后的150 mL三角瓶內，加入90 mL無菌水，將三角瓶振蕩30 min使其充分分散，靜置，吸取1 mL上清液至裝有9 mL無菌水的10 mL 比色管內，充分搖勻后獲得10-1濃度稀釋液，根據以上步驟反復稀釋制得10-2-10-4濃度稀釋液，分別吸取0.1 mL各稀釋液涂布至LB培養基和PDA培養基上，分別在10℃條件下倒置培養細菌和真菌，每個梯度做3個平行，每天檢查1次。當培養基上長出清晰的菌落后，分別挑取形態不同的菌落至對應的新培養基進行分離純化，成功后進行復篩。

1.2.2 冷適應性菌株的復篩

將純化成功后的各菌株用接種環點接在纖維素剛果紅培養基中心，在10℃條件下倒置培養，培養基上透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值較大者即為具有較強纖維素分解能力的菌株。

1.2.3 菌株鑒定

對復篩出的菌株進行分子生物學鑒定，采用16SrDNA序列分析（菌株總DNA的提取、PCR擴增、PCR擴增的純化及測序）。

在無菌條件下，將3株菌株分別接種在LB固體培養基試管的斜面上，用甘油密封放置于4℃冰箱保存，用于后續試驗。

1.2.4 冷適應性菌劑的制備

將上一步篩選、鑒定后的3株功能菌株分別接種到液體培養基中培養至渾濁，在超凈工作臺中與滅菌后冷卻的載體（玉米秸稈粉：高嶺土=1：1）按1：10的比例混合，在超凈工作臺中風干后充分研磨至顆粒狀，過2 mm篩后收集備用。

1.3 堆肥試驗

1.3.1 堆肥試驗設計

堆肥試驗在吉林農業大學試驗田中進行，將地面輕微壓實并使場地平整無坡度，鋪設塑料布防止滲濾液滲入土壤，在場地四周及上方用塑料布搭建簡易大棚遮擋風雨。堆肥原料為玉米秸稈，輔料為雞糞，質量比為秸稈：雞糞=3：7（干質量），每個堆體質量為100 kg，原料混勻后在堆肥場地中自然堆積成圓錐形，混料后堆體C/N為31.18，含水率為60.29％。根據預實驗將堆肥周期設為30 d，采用人工翻堆的方式控制通氣狀況，在堆肥開始后第1、2、3、4、5、7、9、12、15、18、22、26天進行翻堆及取樣。冷適應性菌劑與超高溫菌劑的添加量均為堆體干質量的0.1％，以不加菌劑為對照組（CK），分別設置5個試驗組，具體如表2所示。

1.3.2 堆肥樣品采集

每次翻堆前對堆肥樣品進行取樣，從堆體的上、中、下部分分別取樣后混勻作為供試樣品，其中一部分直接用于測定pH、電導率、種子發芽指數，其余部分風干磨碎過0.85 mm篩后用于測定總有機碳、總氮、有效磷、速效鉀、銨態氮、硝態氮的含量。

1.4 堆肥指標的測定方法

每天14：00分別對堆體上、中、下層分別測溫，取平均值作為當天的堆體溫度。

取10 g鮮樣與去離子水按1：10的比例混合，160 r·min-1振蕩th，取下后靜置30 min，過濾得到清液分別進行pH和電導率的測定。

總有機碳采用重鉻酸鉀容量法測定，總氮采用凱氏定氮法測定。

硝態氮（NO-3-N）采用鹽酸浸提—紫外分光光度法測定。銨態氮（NH+4-N）采用蒸餾后直接滴定法測定。

有效磷采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測定，速效鉀采用乙酸銨提取-火焰光度法測定。

堆肥樣品毒性評價用種子發芽指數表示：用堆肥樣品浸提液浸透濾紙放入培養皿中，放置10顆大小均勻、飽滿的小白菜種子，以蒸餾水培養結果為對照，在25℃恒溫培養箱中避光培養72 h，得到堆肥樣品的種子發芽指數（CI）。

GI=堆肥浸提液培養種子發芽數×根長／（去離子水培養種子發芽數×根長）

1.5 統計分析

堆肥試驗數據用Excel 2019、Origin Pr0 2021軟件進行分析、繪圖，顯著性分析利用SPSS 26軟件完成。

2 結果與分析

2.1 冷適應性菌劑的制備

2.1.1 冷適應性菌株的篩選

在10℃條件下，從樣品浸提稀釋液中培養純化出的菌株共27株，其中細菌16株（L1-L16）、真菌11株（P1-P11），均可在低溫條件下生長。將驗證純化后的菌株接種到纖維素剛果紅培養基后，篩選出有透明圈的菌株5株，其中細菌4株（L2、L3、L4、L9）、真菌1株（P5），各菌株的透明圈數值見表3。

從表3可以看出，菌株L3、L4、L9的D／d值較大，說明其對纖維素的總體降解能力較強，因此選擇菌株L3、L4、L9用于后續試驗。

2.1.2 菌株鑒定

對菌株L3、LA和L9進行PCR擴增和序列（16SrDNA）的檢測，并將檢測結果與National Library of Medicine數據庫進行比對，結果顯示3株菌株均屬細菌界：菌株L3與芽孢桿菌屬菌[Bacillus subtilis DSM/O（NR 027552.1）]相似度最高，為99.93%，屬于厚壁菌門桿菌綱芽孢桿菌目芽孢桿菌科芽孢桿菌屬的一種枯草芽孢桿菌；菌株L4與假節桿菌屬菌[Pseudar-throbacter chlorophenolicus A6（NR 0745 18.1）]相似性達到99.13%，屬于放線菌門放線菌綱微球菌目微球菌科假節桿菌屬的一種氯酚假節桿菌；菌株L9與普里斯特氏菌屬菌[Priestia aryabhattai B8W22 （NR115953.1）]親緣關系最近（相似性為99.93%），分類學上屬于厚壁菌門桿菌綱芽孢桿菌目芽孢桿菌科普里斯特氏菌屬的一種巨大普里斯特氏菌。

2.2 冷適應性菌劑與超高溫菌劑聯合應用的堆肥效果評價

2.2.1 堆體溫度變化規律

溫度能直接反映出堆肥的進程及其腐熟程度，通過不同堆體間的溫度差異能清晰直觀地認識到其內部的變化。堆肥整體進程可分為起爆期、高溫期及腐熟期，起爆期為微生物在堆體中的適應期，有機物質的降解主要發生在高溫期，高溫期過后堆體內部在腐熟期中逐漸趨向穩定。如圖1所示，CK、T1、T2組的最高溫度分別達到47.5、55.3、46.6℃，3組差異不大，均未能達到《生物質廢物堆肥污染控制技術規范》（HJ 1266-2022）中對發酵溫度及持續時間的要求。

而T3、T4、T5組均添加了冷適應性菌劑及超高溫菌劑，堆體升溫迅速。3組分別在堆肥開始第3、3、5天進入高溫期，分別在第5、6、7天達到最高溫度79.0、80.3、78.6℃。高溫期≥55℃的時間均達到了9 d以上；≥65℃的時間均達到了7 d，達到了Ⅲ1266-2022的要求。T5組溫度在第4天有下降趨勢，在添加超高溫菌劑后溫度迅速上升。

2.2.2 堆肥過程中pH及電導率變化規律

pH能體現出堆肥過程中酸堿物質等的動態平衡關系，同時也能表示堆體中微生物的生存環境是否適宜。如圖2a所示，整個堆肥過程中pH變化規律為先上升后下降，在堆肥結束時處于8.16-8.34范圍內。CK、T1、T2組pH在第7天升高到8.33左右；而T3、T4、T5組分別在第4、4、5天達到8.62左右，更偏堿性。其中T3、T4組變化趨勢一致，T5組前4d的變化趨勢與T1組高度相似，但第4天加入超高溫菌劑后，T5組pH上升的趨勢明顯高于T1組。這說明在高溫期會產生大量氨氣導致堆體pH上升，但這也會增加堆體氮素損失風險。

電導率代表堆體中可溶性鹽的含量，能反映堆體中有機物質的礦化及降解情況，同時成品物料的電導率也能表明其安全程度，根據《綠化用有機基質》（GB／T 33891-2017），用于土壤改良的堆肥成品電導率應在0.5-3.5 mS·cm-1范圍內，如果電導率過高會形成反滲透壓使植物脫水枯萎。如圖2b所示，6組整體上呈現先下降后上升的趨勢，但CK、T1、T2組的變化幅度較T3、T4、T5組小得多，且后期上升幅度較大，超過了標準的安全限值，堆肥結束時只有T3組的電導率未超過3.5 mS·cm-1，處于安全施用范圍內，而T4、T5組的電導率分別為3.70、3.59，略超過標準限值，可稀釋后施用。

2.2.3 堆肥過程中C/N變化規律

堆體總有機碳的變化可以代表堆肥過程中有機質的變化，6組總有機碳均呈現下降趨勢（圖3a）。高溫期結束時，添加兩類菌劑的T3、T4、T5組的總有機碳降解率分別為31.4%、28.70%、33.2%。堆肥結束時6組的總有機碳降解率表現為T3 （45.3%）＞T4（36.3%）＞T5 （36.1%）＞T1（24.6%）＞T2 （19.9%）＞CK（19.0%）。

從圖3b可以看出，6組的總氮含量在整個堆肥過程中變化幅度均不大，在10-20 g·kg-1范圍內，均呈現先上升后下降的趨勢。在高溫期，T3、T4、T5組總氮上升幅度明顯高于CK、T1、T2組。堆肥結束時各組總氮含量在12 g·kg-1左右，各組差異不顯著。

堆肥過程中，C/N是影響微生物生長進而影響堆體升溫和有機物質降解的重要因素之一，微生物利用有機物質的最佳C/N為25-35，隨著堆肥進行C/N不斷下降。從圖4可以看出，堆肥結束時CK、T1、T2組的C/N分別為25.43、22.05、23.62，而T3、T4、T5組的C/N分別降到了18.80、20.84、19.89，與前3組差異顯著。

2.2.4 堆肥過程中銨態氮及硝態氮變化規律

堆肥過程中，銨態氮和硝態氮的變化是堆肥腐熟度評價的常用指標之一。銨態氮是通過微生物將有機氮化物礦化分解轉化而來的，該過程主要發生在高溫期。如圖5a所示，由于CK、T1、T2組在堆肥中期溫度低而使得銨態氮含量上升幅度有限，最高分別為511.0、544.5、518.1 mg·kg-1；而T3、T4、T5組微生物活動劇烈，分別在第2、3、4天達到拐點649.3、631.6、613.2 mg·kg-1。這說明高溫期產生了大量銨根離子，但隨著溫度及pH上升，發生中和反應造成氮元素揮發，加上后期銨態氮成為硝化作用的原料，其含量開始下降，最終分別下降到208.5、204.9、210.3、143.1、150.9、152.0 mg·kg-1，這也是氮損失的主要途徑之一。

通過亞硝化作用及硝化作用，硝化細菌將含氮化合物轉化為硝態氮，硝態氮含量上升也標志著堆體逐漸趨向腐熟。從圖5b中可以看出T1、T3、T4、T5組由于加入了冷適應性菌劑，堆體升溫快，硝態氮含量在堆肥第2天達到最大值。隨后T3、T4、T5組進入高溫期，硝化細菌受溫度限制導致硝態氮含量開始下降，腐熟期溫度下降硝態氮含量又開始回升。堆肥結束時T3、T4、T5組的硝態氮含量顯著高于CK、T1、T2組，達到510 mg·kg-1左右，說明腐熟程度高于前3組。

2.2.5 堆肥過程中有效磷及速效鉀變化規律

隨著堆肥的進行，6組的有效磷及速效鉀含量均在上升（圖6）。從圖6a中可以看到，對于CK、T1、T2組來說，隨著堆肥進行，堆體有效磷含量始終在平穩增長，堆肥結束時增長了437.3%、448.0%、350.0%；T3、T4組在第1-4天屬于快速增長階段，分別增長了248.8%、294.5%，第5-15天增長變得緩慢，腐熟階段又再次增長，最終增長了662.9%、604.5%；而T5組由于超高溫菌劑加入較晚，其增長最快的階段為第2-5天，增長了197.9%，隨后的積累規律與T3、T4組相同，第30天時增長了497.3%。

如圖6b所示，速效鉀含量在堆肥過程中不斷上升，堆肥結束時CK及T1-T5組的速效磷增長率分別為501.4%、818.5%、774.1%、1 204.2%、1 174.6%、981.4%，T3、T4、T5組與CK、T1、T2組差異顯著。

2.2.6 堆肥產品的毒性評價

種子發芽指數是評價堆肥成品毒性最直觀的指標，同時也能揭示堆肥過程中堆體的腐熟程度變化。從圖7可以看出，6組的種子發芽指數均處于上升狀態，在堆肥結束時均≥70%，符合《有機肥料》（NYIT525-2021）的要求。其中T3、T4、T5組的種子發芽指數為118.6%、112.3%、108.7%，與CK、T1、T2組的90.5%、90.3%、95.4%差異顯著；T3組與T5組的種子發芽指數之間有著顯著性差異，但這兩組與T4組的差異均未達到顯著水平。

3 討論

堆肥是有機物料在微生物作用下發生的有機物質分解及腐殖質形成的生化過程，堆肥的整體進程伴隨著溫度、C/N等理化參數的動態變化。微生物通過自身生物氧化作用代謝營養物質，產生大量能量，這些能量一部分被微生物利用，另一部分轉化為熱能，促使堆肥發酵物升溫。

從溫度來看，與CK組相比，單加冷適應性菌劑的T1組能使堆體度過起爆期，但無法進入高溫期，而T2組因為超高溫菌劑沒有發揮作用，溫度變化與CK組相似。在此前提下，設置冷適應性及超高溫兩類菌劑聯合加入堆體，與T1組對比發現，T3、T4、T5組在度過起爆期后溫度并沒有下降，而是在超高溫菌劑的作用下繼續升溫，使得堆體溫度達到80℃左右，高溫期（≥65℃）持續7d。

總有機碳、C/N、種子發芽率等指標也能從側面證明微生物在整個堆肥過程中的作用，也能表明堆體何時趨向成熟。T3、T4、T5組的總有機碳降解率顯著高于CK、T1、T2組，其中最高的T3組比CK組高26.35%；而總氮含量雖然整體變化不大，但由于堆肥完成時堆體總質量下降，說明存在氮素損失；當C/N下降到15-20時一般可認為有機肥料腐熟完成，品質逐漸趨于穩定，T3組C/N下降幅度最大，腐熟度較高，且在第26天時就已經降到20以下。T3、T4、T5組的種子發芽指數及其增長速度顯著高于CK、T1、T2組。從上述結果分析，T3、T4、T5組整體腐熟程度較高，成品較穩定，這充分說明在低溫條件下，起爆期需要有冷適應性菌劑來幫助堆體溫度快速升高，才能為超高溫菌劑在高溫期快速分解有機物質提供良好的環境，而超高溫菌劑能使堆體腐熟度大幅提升，25 d即可完成堆肥。

T3、T4、T5組對比發現，T3組的各項指標表現都很穩定。T3、T4組在經過起爆期后都順利進入高溫期，在超高溫菌劑的作用下對有機物質進行快速分解；T5組在前4d的溫度變化與T1組一致，第4天有下降趨勢，加入超高溫菌劑后，第5天開始迅速升溫，但其堆肥效果不如T3組，可能是由于超高溫微生物適應環境時間短導致的。在實際應用中，如果超高溫菌劑加入不及時，可能會使兩類菌劑的銜接出現問題，導致堆肥無法完成。從總體來看，超高溫菌劑加入時間越早，其適應環境的時間越短，堆體升溫越順利，堆肥進程越穩定。

4 結論

（1）從常年堆積玉米秸稈場所下的土壤與玉米秸稈混合樣品中，篩選出3株能在10℃的環境下快速生長繁殖且能分泌纖維素酶的菌株，分別是枯草芽孢桿菌、氯酚假節桿菌、巨大普里斯特氏菌，將其制成冷適應性菌劑后有助于堆體在低溫條件下升溫。

（2）在低溫條件下，僅使用冷適應性菌劑或超高溫菌劑堆肥結果均不甚理想，而冷適應性菌劑和超高溫菌劑聯合應用堆肥效果提升顯著。在10-15℃的環境下，堆體可在第3天進入高溫期，最長持續11d，最高溫度達到80℃左右，總有機碳降解率最高達到45.3%，有效磷含量提升662.9%，速效鉀含量提升1 204.2%，種子發芽指數提升至118.6%，且在25 d內即可完成堆肥。

（3）在堆肥第0天加入冷適應性菌劑的前提下，超高溫菌劑加入時間越靠前，堆肥效果越好。

（責任編輯：李丹）

基金項目：國家重點研發計劃項目（2021YFD1500805）；吉林省自然科學基金項目（20220101175JC）