長期不同施肥對小麥田土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

摘要：為研究不同施肥措施對華北潮土區(qū)小麥田土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，為華北地區(qū)農(nóng)田合理施肥提供數(shù)據(jù)支持，本研究以農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所長期施肥試驗(yàn)為平臺，利用高通量測序技術(shù)，研究不施肥對照（CK）、單施有機(jī)肥（M）、單施氮肥（N）、無機(jī)肥配施（NPK）、有機(jī)肥配施無機(jī)肥（MNPK）5種不同施肥措施對小麥田土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響。結(jié)果表明：MNPK處理的土壤固碳細(xì)菌Shannon指數(shù)最高，顯著高于M、N、NPK和CK處理；M、N和NPK處理的Shannon指數(shù)與CK無顯著差異。影響固碳細(xì)菌α多樣性指數(shù)的主要影響因素是微生物量碳、微生物量氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、全氮和pH值。華北平原農(nóng)田土壤固碳細(xì)菌優(yōu)勢菌群相對豐度發(fā)生改變，門水平上，變形菌門（Proteobacteria，96.11%-99.97%）為優(yōu)勢菌門；與CK相比，4種施肥處理顯著降低了變形菌門相對豐度。在綱水平上，優(yōu)勢菌綱為γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，68.31%-89.14%）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，4.29%-27.3 2%）和β-變形菌綱（Betaproteobacteria，1.62%-7.71%）；與CK相比，N、NPK和MNPK處理顯著降低了γ-變形菌綱相對豐度，M處理顯著增加了γ-變形菌綱相對豐度；NPK、MNPK處理顯著增加了α-變形菌綱的相對豐度，而M處理顯著降低α-變形菌綱的相對豐度；4種施肥處理顯著增加了β-變形菌綱的相對豐度。冗余分析結(jié)果顯示，不同施肥處理土壤pH值、微生物量碳、微生物量氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、土壤總有機(jī)碳和C/N是影響土壤固碳細(xì)菌群落特征變化的主要影響因子。研究表明，長期有機(jī)肥配施無機(jī)肥處理更有利于土壤微生物固碳，土壤pH降低和養(yǎng)分積累是土壤固碳細(xì)菌群落和多樣性變化的重要原因。

關(guān)鍵詞：施肥；小麥田；固碳細(xì)菌；cbbL基因；群落結(jié)構(gòu)；高通量測序

中圖分類號：S154.3；S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）08-1796-09 doi：10.11654/jaes.2023-0922

施肥是重要的農(nóng)業(yè)管理措施之一，合理的施肥措施能夠提升土壤肥力，并提高作物產(chǎn)量。土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要動力，調(diào)控生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動，在維持生態(tài)系統(tǒng)功能中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。土壤的碳儲存是其最重要的功能之一，土壤中貯存的1500 Pg有機(jī)碳占陸地生態(tài)系統(tǒng)碳庫的2/3，約是植物碳庫的3倍、大氣碳庫的2倍。施肥可以提高作物產(chǎn)量，但長期不合理施肥也會產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致土壤微生物多樣性下降。

土壤固碳細(xì)菌是土壤碳循環(huán)的重要微生物群落，具有同化CO2能力，能夠吸收大氣中的CO2轉(zhuǎn)化為有機(jī)質(zhì)并儲存于土壤中，這一過程不僅能夠有效提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，也對緩解全球氣候變化做出積極貢獻(xiàn)。每年通過土壤微生物固定的大氣中的CO2約0.6-4.9 Gt C，占陸地生態(tài)系統(tǒng)固定大氣CO2的0.5%-4.1%。在已知的生物固碳途徑中，卡爾文循環(huán)是最主要的自養(yǎng)微生物固定CO2的途徑，該過程的關(guān)鍵作用酶是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubis-CO）。cbbL是RubisCO的主要編碼基因之一，具有高度保守性。目前，固碳基因cbbL被廣泛應(yīng)用于固碳微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究實(shí)驗(yàn)中。土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性受施肥量、施肥方式、土地利用方式和植被類型等影響。

華北平原是我國主要的糧食主產(chǎn)區(qū)，主要以小麥／玉米輪作為主要種植制度，在保障我國糧食生產(chǎn)中起著重要作用。該地區(qū)存在氮肥施用過量，有機(jī)肥不施或少施等問題。目前，長期不同施肥措施對華北農(nóng)田土壤碳固存影響及其固碳微生物的響應(yīng)機(jī)制還不明確。為此，本研究依托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所于2016年建立的長期定位施肥試驗(yàn)，以不同施肥處理的表土（0-20 cm土層）為研究對象，以卡爾文循環(huán)功能基因cbbL為標(biāo)記基因，利用IlluminaMiSeq高通量測序技術(shù)，研究不同施肥處理下土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化，并耦合土壤化學(xué)性質(zhì)分析影響固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的關(guān)鍵因子，明確影響潮土固碳微生物的主要因素，揭示其影響規(guī)律，以期為華北地區(qū)合理施肥提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所武清野外科學(xué)試驗(yàn)站（39°21＇N，117°12＇E），屬暖溫帶半濕潤大陸季風(fēng)型氣候區(qū)，海拔6.3 m，年均溫11.6℃，年均降水量為520-660 mm，年平均無霜期196-246 d。土壤類型為潮土，試驗(yàn)開始前土壤的基本理化性質(zhì)為：pH 8.24，有機(jī)質(zhì)含量18 g·kg-1，全氮含量1.18 g·kg-1，全磷含量0.79 g·kg-1，速效磷含量18.6mg·kg-1。

1.2 樣品采集及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

自2016年開始長期試驗(yàn)，種植制度為典型冬小麥—夏玉米輪作，田間管理按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)生產(chǎn)模式進(jìn)行。設(shè)置5個施肥處理：（1）對照（CK，不施肥）、（2）單施有機(jī)肥（M，10 t·hm-2·a-1）、（3）單施氮肥（N，200 kg·hm-2·a-1，以N計(jì)，下同），（4）無機(jī)肥配施（NPK，200kg·hm-2·a-1，P2Os 100 kg·hm-2·a-1，K2O 100 kg·hm-2·a-1），（5）有機(jī)肥配施無機(jī)肥[MNPK，化肥（N 140 kg·hm-2·a-1，P2O5 70 kg·hm-2·a-1，K2O 70 kg·hm-2·a-1）；有機(jī)肥3 t·hm-2.·a-1。氮肥為尿素（N，46.0%）（內(nèi)蒙古博大實(shí)地化學(xué)有限公司生產(chǎn)），磷肥為過磷酸鈣（P2O5，12%，中化化肥有限公司生產(chǎn)），鉀肥為硫酸鉀（K2O，52%，史丹利農(nóng)業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)）。有機(jī)肥為酵母源顆粒型煙莖生物有機(jī)肥（含氮量2.00-/0，含磷量1.5%，含鉀量1.5%），由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)。完全隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積為96 m2（12 m×8m），小區(qū)之間用水泥板進(jìn)行隔斷，每個處理4次重復(fù)。

小麥季與玉米季施肥量相同。每年9月底玉米收獲后，有機(jī)肥和磷鉀肥全部作基肥，60%氮肥作基肥在冬小麥播種時一次性施入，在小麥拔節(jié)期追施40%氮肥。6月初小麥?zhǔn)斋@后，有機(jī)肥和磷鉀肥全部作基肥，60%氮肥作基肥在夏玉米播種時一次性施入，玉米小喇叭口期追施40%氮肥。

1.3 土壤樣品的采集

于2022年6月在小麥?zhǔn)斋@期采集土壤樣品。用直徑5 cm的土鉆，在每個小區(qū)按照“S”型取樣法采集土壤，取樣深度為土壤耕層0-20 cm，混合后得到每個小區(qū)的復(fù)合樣品。去除土壤中的凋落物、作物根系及動植物殘?bào)w裝入滅菌自封袋，放在冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。將土壤樣品過2 mm篩后，分為3份。一份儲存于4℃冰箱，用于速效養(yǎng)分和土壤微生物量碳、氮的分析；一份于-80℃冷凍保存，用于土壤微生物分析；一份自然風(fēng)干后，用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH采用玻璃電極法（土水比為1：2.5）測定；土壤總有機(jī)碳（TOC）采用重鉻酸鉀-外加熱法測定；土壤全氮（TN）含量采用濃硫酸-催化劑消煮-流動注射比色法測定；土壤銨態(tài)氮（NH+4-N）、硝態(tài)氮（NO-3-N）含量采用氯化鈣溶液浸提—流動分析儀（AA3，德國）測定；土壤易氧化有機(jī)碳（EOC）采用333 mmol·L-1高錳酸鉀氧化法測定；土壤微生物量碳（MBC）采用氯仿熏蒸-硫酸鉀提取法測定，土壤微生物量碳換算系數(shù)為0.45；土壤可溶性有機(jī)碳（DOC）經(jīng)振蕩浸提后上清液過0.45 μm濾膜后用TOC儀測定。

1.4.2 土壤DNA提取與PCR擴(kuò)增

土壤DNA提取：按照E.Z.N.A. Soil DNA Kit快速提取試劑盒說明書提取土壤樣本的DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測DNA的質(zhì)量和純度。

PCR擴(kuò)增：以基因組DNA為模板，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增cbbL基因。首先第一輪擴(kuò)增引物為cbbL-F（5，-GACTTCACCAAAGACGACGA-3＇）和cbbL-R（5，-TC-GAACTTGATTTCTTTCCA-3＇），第二輪擴(kuò)增引物為cbbL-F（5＇- CATCATGTTCGACCAGGACT -3＇）和cbbL-R（5＇-TCGAACTTGATTTCTTTCCA-3'）。在Forward Primer和Reverse Primer的5'末端各添加8bp的barcode序列，以區(qū)分不同的樣本。最后將帶有barcode序列的通用引物在ABI 9700 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。其中擴(kuò)增體系包含DNA樣品30 ng，F(xiàn)orward/Reverse Primer各1μL， BSA 3μL， 2xTaq Plus MasterMix 12.5 μL，用無菌水補(bǔ)充至終體積25 μL。一輪反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)，72℃延伸7min。二輪反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，共20個循環(huán)，72℃延伸7 min。采用絕對定量法，將含有目標(biāo)片段的質(zhì)粒稀釋10倍作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，在各反應(yīng)完成后，設(shè)置溶解曲線程序（50-95℃），用來定量檢測PCR產(chǎn)物的特異性，最后通過ABI 7500 Software（version 2.0.6）來分析所得的數(shù)據(jù)并計(jì)算各處理中基因的拷貝數(shù)。

1.4.3 高通量測序與生物信息學(xué)分析

生物信息分析：通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性。測序由北京奧維森基因科技有限公司完成，對純化后的擴(kuò)增cbbL基因進(jìn)行Illumina MiSeq PE 300平臺上機(jī)測序。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過Trimmomatic和Flash軟件預(yù)處理，去除低質(zhì)量reads，根據(jù)PE數(shù)據(jù)之間overlap關(guān)系將成對的reads拼接成一條序列。去除tags兩端的barcode序列及引物序列，去除嵌合體及其短序列等后得到高質(zhì)量的clean tags，拼接過濾后的clean tags，利用QiimeⅡ和Vsearch軟件進(jìn)行97%相似度可操作分類單元（OTU）聚類分析。對比GreenGenes數(shù)據(jù)庫，對每個OTU進(jìn)行物種注釋。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS26軟件進(jìn)行單因素方差分析，使用Duncan法進(jìn)行差異顯著性比較（P＜0．05）。運(yùn)用Origin 2021軟件制圖。使用R 3.5.1軟件包進(jìn)行固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，使用R 3.5.1及Excel軟件作圖。采用Canoc05軟件進(jìn)行土壤化學(xué)性質(zhì)、固碳細(xì)菌群落與土壤微環(huán)境之間的冗余分析（RDA），使用499次蒙特卡洛置換檢驗(yàn)結(jié)果的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)變化

連續(xù)7a不同施肥處理改變了土壤化學(xué)性質(zhì)（表1）。4種施肥處理的土壤pH值均顯著低于CK。4種施肥處理的土壤TOC、TN、N03-N和MBN含量均顯著高于不施肥CK。NPK處理的土壤NH+4-N含量顯著高于CK，M、N和MNPK處理的土壤NH+4-N含量與CK無顯著差異。M和MNPK處理的土壤TN含量顯著高于N和NPK處理，N處理的土壤TN含量與NPK處理無顯著差異。M和MNPK處理的土壤TOC含量顯著高于N和NPK處理，N處理的土壤TOC和TN含量與NPK處理無顯著差異。M處理的土壤TOC含量比N和NPK處理分別提高了41.85%、45.41%。MNPK處理的土壤TOC含量比N和NPK處理分別提高了12.04%、14.85%。說明施用有機(jī)肥有利于土壤碳固存。

2.2 土壤活性碳組分含量與碳庫指數(shù)變化

不同施肥處理下土壤活性碳組分含量見表2。M、NPK和MNPK處理的土壤MBC顯著高于CK；N處理的土壤MBC含量高于CK，但無顯著差異。M和MNPK處理的EOC含量高于或顯著高于CK、N和NPK處理；N和NPK處理的土壤EOC含量高于CK，但無顯著差異。M、N、NPK處理和MNPK處理的DOC含量無顯著差異，均顯著高于CK。

2.3 土壤固碳細(xì)菌群落多樣性變化

土壤固碳細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)變化見表3。由表3可見，MNPK處理的Chaol指數(shù)、Observed specy指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)最高。MNPK處理的Chaol指數(shù)、Observed specy指數(shù)顯著高于CK、M和N處理（P＜0.05），同時高于NPK處理，但無顯著差異P＞0．05）。MNPK處理的Shannon指數(shù)顯著高于M、N、NPK處理和CK處理（P＜0.05）。MNPK處理的Simpson指數(shù)均顯著高于CK處理（P＜0．05），均高于M、N和NPK處理，但無顯著差異（P＞0．05）。

土壤固碳細(xì)菌α多樣性指數(shù)與土壤化學(xué)性質(zhì)相關(guān)性分析結(jié)果見表4。土壤固碳細(xì)菌Chaol和觀測值指數(shù)與土壤NH+4-N、MBC和MBN含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。土壤固碳細(xì)菌Shannon指數(shù)與土壤MBC和MBN含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0．01）。土壤固碳細(xì)菌Simpson指數(shù)與土壤TN含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0．05），與土壤pH值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0．05），與NH+4-N、NO-3-N、MBC和MBN含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0．01）。影響土壤固碳細(xì)菌α多樣性指數(shù)的主要土壤環(huán)境因子是土壤pH、TN、NH+4-N、NO-3-N、MBC和MBN含量。

2.4 不同施肥處理土壤固碳細(xì)菌群落組成與相對豐度

采用cbbL基因文庫對不同施肥處理下的土壤固碳細(xì)菌群落進(jìn)行分析。測序結(jié)果在97%相似度水平下聚類得到20 071個OTU，各施肥處理的土壤中的OTU數(shù)量從311-765個不等。經(jīng)對比鑒定得到2個門、3個綱和53個屬的土壤固碳細(xì)菌群落信息。不同施肥處理固碳細(xì)菌門、綱、屬分布及相對豐度不同（圖1）。以門作為分類學(xué)水平，變形菌門Proteobacteria為固碳細(xì)菌cbbL優(yōu)勢菌門，各處理相對豐度為96.11%-99.97%。與CK相比，4種施肥處理顯著降低了變形菌門的相對豐度。以綱作為分類學(xué)水平，γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、a-變形菌綱Alphaproteobac -teria和β-變形菌綱Betaproteobacteria為固碳細(xì)菌cb-bL優(yōu)勢菌綱，各處理相對豐度分別為68.31%-89.14%、4.29% -27.32%、1.62%-7.71%。相較于CK處理，N、NPK和MNPK處理顯著降低了γ-變形菌綱相對豐度，M處理顯著增加了γ-變形菌綱相對豐度；NPK、MNPK處理顯著增加了α-變形菌綱的相對豐度，而M處理顯著降低α-變形菌綱的相對豐度；4種施肥處理顯著增加了β-變形菌綱的相對豐度。

以屬作為分類學(xué)水平，9個優(yōu)勢固碳細(xì)菌屬為：堿桿菌屬A lkalilimnicola（8.99%-32.07%）、硫代堿弧菌屬Thioalkalivibrio（2.52% -37.52%）、堿螺菌屬Alka-lispirillum（2.68%-27.62%）、硫簇菌屬Sulfuricaulis（3.05%-18.38%）、硫腐菌屬Sulfurifustis （0.26%-10.74%）、紅桿菌屬Rhodobacter （2.48%-10.54%）、短桿菌屬Brevirhabdus（1.33% -10.96%）、紅球菌屬Rhod-ovulum （0.10%-4.42%）和Hydrogenophaga （0.91%-5.55%）。與CK處理相比，M、N、NPK、MNPK處理顯著提高堿桿菌屬Alkalilimnicola、硫簇菌屬Sulfuricau-lis等固碳細(xì)菌的相對豐度；4種施肥處理均顯著降低固碳細(xì)菌Thioalkalivibrio、AlkalispiriJJum的相對豐度。

2.5 土壤固碳細(xì)菌與土壤環(huán)境因子RDA分析

為進(jìn)一步揭示不同施肥處理對土壤環(huán)境因子和微生物活性的影響，利用土壤化學(xué)性質(zhì)作為環(huán)境變量進(jìn)行冗余（RDA）分析（圖2）。紅色箭頭的方向和長度揭示了土壤化學(xué)性質(zhì)變量之間的相互關(guān)系及其對固碳細(xì)菌群落的影響程度。第一、二排序軸的變異解釋值分別為62.55%、20.68%，共解釋了83.23%的變異值。結(jié)果表明，相較于不施肥，施肥處理影響固碳細(xì)菌群落，不同施肥處理影響土壤固碳細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)。根據(jù)Forward Selection分析，第一軸與pH呈正相關(guān)，與NH+4-N、MBC、MBN、NO-3-N、TN、EOC、TOC、C/N呈負(fù)相關(guān)；第二軸與C/N、EOC、TOC、TN、MBC和NH+4-N呈正相關(guān)，與NO-3-N、MBN和pH呈負(fù)相關(guān)。對土壤固碳細(xì)菌達(dá)到顯著影響的化學(xué)因子包括：pH（F=7.7，P=0.002），MBN（F=5.9，P=0.002）、MBC（F=8.8，P=0.002）、NH+4-N （F=8.9，P=0.002）、NO-3-N （F=10.5， P=0.002），均達(dá)到極顯著影響，TOC（F=3.6，P=0.028）、C／N（F=4.0，P=0.042），達(dá)到顯著影響；而EOC（F=1.6，P=0.178）、TN（F=0.6，P=0.554）未達(dá)到顯著影響。

3 討論

3.1 施肥對土壤理化性質(zhì)的影響

施肥能夠改變土壤理化性質(zhì)，影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)，但由于肥料類型、施用量和施用時間長短不同，不同研究者得出的施肥對土壤pH值、有機(jī)碳、活性有機(jī)碳和養(yǎng)分含量的影響存在較大差異。土壤pH值是土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，是影響土壤微生物活性和養(yǎng)分有效性的重要因素。劉紅梅等對華北潮土區(qū)施肥研究表明，連續(xù)10。單施化肥、單施有機(jī)肥和無機(jī)肥配施有機(jī)肥處理均顯著降低了土壤pH值。本研究4個施肥處理較不施肥處理均顯著降低了土壤pH，與其研究結(jié)果一致。此外，與不施肥處理相比，施肥處理顯著提升土壤TOC、TN和NO-3-N含量，這與劉彩霞等在研究施肥對毛竹林土壤養(yǎng)分研究結(jié)果一致。本研究中，與不施肥處理相比，施肥處理能夠顯著提高土壤TOC和EOC含量，且施有機(jī)肥M和MNPK處理優(yōu)于單施氮肥和無機(jī)肥配施處理。這一研究結(jié)果與蘇鑫等、Baldi等、張瑞等研究結(jié)果一致。這是因?yàn)閱问┗蔔和NPK處理無外源有機(jī)物質(zhì)的輸入，土壤有機(jī)碳主要來源于作物根茬、土壤微生物和中小動物的活動；此外，化肥處理提供的養(yǎng)分多為無機(jī)態(tài)養(yǎng)分，除一部分被作物吸收利用外，大部分因?yàn)閾]發(fā)和土壤滲漏損失，進(jìn)入到環(huán)境中，所以其土壤有機(jī)碳含量較施有機(jī)肥處理增加的少。與CK相比，各施肥處理能顯著降低土壤pH值，其中M、MNPK處理對pH值的降低效率優(yōu)于N和NPK處理，可能原因是有機(jī)肥的施入導(dǎo)致土壤中產(chǎn)生有機(jī)酸，加之固碳細(xì)菌活動所產(chǎn)生的CO2，共同作用導(dǎo)致土壤吸附鹽基離子的能力增強(qiáng)。土壤氮素含量方面，與CK相比，所有施肥處理均顯著增加了土壤中的TN、NO-3-N、MBN含量，其中M、MNPK處理對土壤中TN含量的提升效果更加顯著。方海瑞等研究表明，長期單施有機(jī)肥和化肥配施有機(jī)肥處理顯著增加黑土土壤微生物量碳和氮的含量。本研究發(fā)現(xiàn)，施有機(jī)肥處理顯著提高了土壤MBN和MBC含量，證明了有機(jī)肥料添加有利于提高土壤微生物活性。本研究與其研究結(jié)果一致，進(jìn)一步支持了有機(jī)肥在提升土壤碳儲量和改善碳庫質(zhì)量方面的作用。這是因?yàn)橛袡C(jī)肥的投入不僅直接向土壤中輸入了碳、氮、磷和鉀元素，而且有機(jī)肥中富含的有機(jī)物可通過微生物分解作用提高土壤有機(jī)碳含量。

3.2 施肥對土壤固碳細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

不同施肥措施會影響土壤固碳微生物多樣性。土壤微生物Shannon指數(shù)表示群落多樣性，其值越大表明固碳細(xì)菌群落多樣性越高。本研究表明，連續(xù)7。進(jìn)行不同施肥處理，施有機(jī)肥M、MNPK處理的Shannon指數(shù)高于或顯著高于單施氮肥和無機(jī)肥配施處理。陳森林研究南方紅黃壤地區(qū)固碳細(xì)菌cbbL基因文庫的構(gòu)建，結(jié)果表明施用有機(jī)肥處理中cbbL基因多樣性指數(shù)明顯高于施用化肥。本研究結(jié)果與其一致。相關(guān)性分析表明，土壤固碳細(xì)菌α多樣性指數(shù)的Chaol和Observed species指數(shù)與土壤NH+4-N、MBC和MBN含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；Shannon指數(shù)與土壤MBC和MBN之間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系；Simp-son指數(shù)與土壤TN含量呈顯著正相關(guān)，與土壤pH值呈顯著負(fù)相關(guān)，與NH+4-N、NO-3-N、MBC和MBN含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。說明不同施肥措施引起土壤養(yǎng)分和微生物學(xué)性狀發(fā)生改變是導(dǎo)致土壤固碳細(xì)菌α多樣性指數(shù)產(chǎn)生差異的重要原因。

土壤固碳細(xì)菌群落組成受植被類型、土壤類型和土壤養(yǎng)分含量等因素的綜合影響。本研究表明，施肥顯著影響了土壤固碳細(xì)菌群落組成，在門水平上，主要以變形菌門為主，這與劉紅梅等和Wang等研究一致。本研究發(fā)現(xiàn)，與不施肥對照相比，施肥處理顯著降低變形菌門的相對豐度。本研究中，γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、γ-變形菌綱Alphaproteo-bacteria和β-變形菌綱Betaproteobacteria為土壤中的優(yōu)勢菌綱，這與劉紅梅等在華北潮土區(qū)的研究結(jié)果一致。Fierer等研究發(fā)現(xiàn)，Proteobacteria與土壤中的碳代謝密切相關(guān)，其中α- Proteobacteria被識別為主要的木質(zhì)素分解者。本研究中相較于CK處理，NPK、MNPK處理顯著提高α-Proteobacteria的相對豐度，α-Proteobacteria的固碳細(xì)菌通過分解木質(zhì)素，在支持土壤健康與生產(chǎn)力的同時，對環(huán)境保護(hù)和全球碳循環(huán)產(chǎn)生積極影響。在屬水平上，探究施肥處理對土壤固碳細(xì)菌α多樣性指數(shù)的影響時，發(fā)現(xiàn)MNPK處理對土壤固碳細(xì)菌群落多樣性的影響更加顯著。相對于CK處理，4種施肥處理顯著提高了堿桿菌屬Alka-lilimnicola、硫簇菌屬Sulfuricaulis等固碳細(xì)菌的相對豐度；均顯著降低固碳細(xì)菌Thioalkalivibrio、Alkalispi-rillum的相對豐度。MNPK處理相較于M、N、NPK處理顯著改變了土壤固碳細(xì)菌的結(jié)構(gòu)，顯著提高硫簇菌屬Sulfuricaulis、紅桿菌屬Rhodobacter、短桿菌屬Brevrhabdus和紅球菌屬Rhodovulum等固碳細(xì)菌的相對豐度；顯著降低硫代堿弧菌屬Thioalkalivibrio相對豐度。施肥引起的固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，如堿桿菌屬、硫簇菌屬、硫腐菌屬、紅桿菌屬、短桿菌屬、紅球菌屬等固碳細(xì)菌屬對不同環(huán)境因素的變化更為敏感，是群落多樣性形成的主要驅(qū)動因素。堿桿菌屬、硫簇菌屬、紅桿菌屬和硫腐菌屬通過各自獨(dú)特的代謝途徑參與有機(jī)物的轉(zhuǎn)換和碳的儲存。紅桿菌屬和硫腐菌屬屬于紫色非硫細(xì)菌，通過光合作用將CO2轉(zhuǎn)換為有機(jī)物，有效固定碳。堿桿菌屬和硫簇菌屬通常與硫循環(huán)相關(guān)，在極端環(huán)境中通過氧化還原反應(yīng)參與碳固定。這一結(jié)果表明，有機(jī)肥與無機(jī)肥配施提供了豐富的碳源和營養(yǎng)物質(zhì)，為固碳細(xì)菌的增長創(chuàng)造了有利條件。

土壤固碳細(xì)菌群落與土壤理化因子的冗余分析結(jié)果表明，土壤pH值與土壤固碳細(xì)菌群落變化極顯著相關(guān)。說明土壤pH值是影響華北潮土區(qū)土壤固碳微生物的主要影響因子，連續(xù)7a施肥導(dǎo)致了土壤pH值顯著下降（表1），進(jìn)而影響了土壤固碳微生物群落。劉彩霞等認(rèn)為土壤pH值與土壤固碳微生物群落變化顯著相關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。研究表明，土壤養(yǎng)分有效性變化是土壤固碳細(xì)菌群落變化的重要因素。本研究結(jié)果表明，土壤NO-3-N、NH+4-N、MBN、MBC、TOC和C/N與土壤固碳細(xì)菌群落變化顯著相關(guān)，說明土壤養(yǎng)分含量變化是驅(qū)動華北潮土區(qū)的土壤固碳微生物群落變化的重要環(huán)境因子。

本研究比較了經(jīng)過連續(xù)7a不同施肥處理下，華北典型麥玉輪作農(nóng)田土壤固碳微生物群落和多樣性變化，分析探討了土壤固碳細(xì)菌特征與土壤環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系。研究結(jié)果可為華北農(nóng)田合理施肥提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。但本研究只初步進(jìn)行了固碳細(xì)菌cbbL基因的一個功能基因群的變化分析，需要開展更多的碳功能基因群落變化對不同施肥措施響應(yīng)關(guān)系研究．并探討土壤碳、氮組分變化與其之間的耦合作用關(guān)系。

4 結(jié)論

（1）連續(xù)7a不同施肥處理下，施肥較不施肥處理顯著增加土壤總有機(jī)碳、全氮、硝態(tài)氮、微生物量氮和可溶性碳含量，施有機(jī)肥處理較單施氮肥和無機(jī)肥配施處理顯著提高土壤總有機(jī)碳和全氮含量。

（2）連續(xù)7a不同施肥處理下，MNPK處理提高了土壤固碳細(xì)菌的o多樣性指數(shù)。影響固碳細(xì)菌α多樣性指數(shù)的主要因素是MBC、MBN、NH+4-N、NO-3-N、TN和pH值。

（3）連續(xù)7a不同施肥處理下，華北平原農(nóng)田土壤固碳細(xì)菌優(yōu)勢菌群相對豐度發(fā)生改變，這種改變在門、綱、屬分類水平上均有體現(xiàn)。冗余分析結(jié)果顯示，不同施肥處理土壤pH值、MBC、MBN、NO-3-N、NH+4-N、TOC和C/N是影響土壤固碳細(xì)菌群落特征變化的主要影響因子。

（責(zé)任編輯：葉飛）