外源刺激劑強化芽孢桿菌高效修復Cr(Ⅵ)污染水體

關鍵詞：Cr（Ⅵ）污染；非包埋型刺激劑；包埋型刺激劑；芽孢桿菌；Cr（Ⅵ）還原效率

鉻（Cr）在電鍍、冶金、制革等行業中的廣泛應用使其在環境中大量累積，這些行業產生的廢水、廢渣中的鉻主要以Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）這兩種較穩定的形式存在，據報道，含鉻工業廢水中通常含有50～250mg·L-1的Cr（Ⅵ），盡管處理和稀釋可以降低其濃度，但仍然對環境和人類健康造成危害。研究者們已經探索了多種將Cr（Ⅵ）轉化為Cr（Ⅲ）的方法，以最大程度地減少Cr（Ⅵ）污染，其中化學還原和離子交換法應用最多，但這兩種方法普遍存在成本高和二次污染問題。以微生物為主的生物修復法因其環境友好及運行成本低而成為研究和應用的熱點，然而，當功能微生物單獨在場地施用時，容易受到土著微生物的競爭和外界不利環境的影響，導致其存活率低、定殖效率差，從而降低其對污染物的處理效果。因此，如何利用廉價的外源刺激劑增強微生物活性，促使Cr（Ⅵ）得以高效還原，是亟待解決的技術問題。

生物刺激劑通過提供微生物生長所需的營養元素或改善其生長環境來強化微生物活性，常見的生物刺激劑包括表面活性劑、營養底物和電子供體等。它們通過激活和增強現有微生物群落的代謝活性和降解能力，加速有害物質的降解，許仲軒研究發現表面活性劑通過提供離子和電子等方式，促進微生物的生長、新陳代謝進而增強對環境中重金屬等有害物質的去除效率。營養底物是微生物機體生長、繁殖和完成各種生理活動所需的物質，外源添加氮源和碳源可以刺激微生物的生長和代謝。其中氮源是構成菌體細胞物質和維持胞內氮化合物的主要物質，同時可以提供大量無機鹽及生長因子，傳統的氮源有氨基酸和硝酸鹽等。碳源是構成細胞的物質，為微生物提供生長發育所需能量，傳統的碳源有蔗糖和葡萄糖等。但傳統碳源和氮源等生物刺激劑成本高，難以大規模應用。研究人員開發了一些低成本的碳源和氮源，包括農業廢物、天然纖維素、生物降解的聚合物。其中甘蔗粉是一種安全性高、成本低的可代替傳統碳源的新型碳源，它既能提供廉價的碳源又可以作為電子供體和穿梭體，加速微生物生長。此外，礦物材料由于其表面積大和化學性質穩定等特點被廣泛應用于重金屬污染的防治，蒙脫石是常用的礦物材料，具有離子交換微觀結構，能夠在其表面形成生物膜，為重金屬還原微生物提供保護場所。盡管這些生物刺激劑能夠有效促進微生物生長，但通常存在穩定性差、存活期短和持效性差等問題，這些因素限制了它們的廣泛應用。

包埋法是將微生物菌體包埋在半透性的聚合物凝膠或膜內，小分子的底物和產物可以自由出入，而微生物卻不會漏出的方法。包埋物通常由維持微生物生命周期的氮源、碳源、無機鹽以及生長因子等與黏合劑結合形成的固定化材料組成，這使得微生物具有更高的結構穩定性和更好的抗性，從而減少外部環境的影響。海藻酸鈉通常用作包埋材料的壁材，因為其是由B-d-甘露糖醛酸M和a-1—古洛糖醛酸G嵌段組成的親水多糖，這些糖鏈段的排列和比例為海藻酸鈉提供了獨特的化學物理性能，通過交聯和表面接枝，對重金屬具有較大的吸收和去除能力。例如孫爽使用海藻酸鈉作為載體，以甘蔗粉生物炭為添加劑制備凝膠球，并成功用于Cr（Ⅵ）的還原，掃描電鏡觀察到凝膠球內部存在三維纖維網狀結構，且對Cr（Ⅵ）的最大還原量達到了388.92mg·kg-1，此試驗以單一刺激劑包埋，其局限性較大，難以滿足實際處理過程中復雜環境條件的需求。因此，以多種有機或無機載體組成的復合載體成為研究熱點，實現各種載體材料的相互補充，從而得到更有效的修復手段。

本研究以前期實驗室從青海鉻渣遺留場地分離的芽孢桿菌鉻還原菌為研究對象，實驗室前期研究發現該菌具有生長快、表面積大、對環境要求低等優勢，且在鉻脅迫下可以產生豐富的胞外分泌物，為Cr（Ⅲ）的絡合和沉淀提供大量陰離子基團，從而降低鉻的毒性，但該菌屬于異養微生物，在惡劣的環境條件下很難形成菌群，因此需要外源刺激劑的引入，以提供額外的營養物質，滿足其生長和代謝需求。鑒于此，本實驗通過室內模擬Cr（Ⅵ）污染水環境，研究了成本低廉且無二次污染的氮源型／碳源型／礦物型／離子型微生物刺激劑，在非包埋與包埋條件下對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）的影響，為外源刺激劑增強微生物修復Cr（Ⅵ）污染水體的應用提供理論支撐。

1材料與方法

1.1供試材料

供試菌劑：研究選取的抗鉻芽孢桿菌（Bacillussp，保藏號：CCTCCAB2022416）是本實驗室前期從青海省海西海北化工廠（36°55' 42\"N，101°18 '18\"E，海拔2900m）含鉻廢渣的土壤中篩選而來，現保存于武漢大學的中國典型培養物保藏中心。

供試刺激劑：本試驗所用到的乳酸鈉（純度99%）、尿素（純度100%）、豆粕粉、硫酸銅（純度99%）、碳酸鈣（純度99%）、鈣基蒙脫石（純度95%）和海泡石（純度99%）均購于綿陽垚鑫商貿有限公司，甘蔗殘渣購于四川省綿陽市農貿市場。

1.2試驗方法

1.2.1試驗設計

本研究比較了單一型刺激劑、非包埋型混合刺激劑以及包埋型混合刺激劑對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）的影響，以添加600mg·L-1 Cr（Ⅵ）的LB培養基（酵母提取物5g·L-1、胰蛋白胨10g·L-1和氯化鈉10g·L-1）為純對照，以只添加刺激劑的600mg·L-1Cr（Ⅵ）IB培養基為材料對照，以只添加芽孢桿菌的600mg·L-1Cr（Ⅶ）IB培養基為生物對照組。其中，單一型刺激劑的最佳添加量篩選試驗采用了單因素多水平實驗設計，采用單因素多水平試驗和響應曲面法研究非包埋型混合刺激劑的最佳濃度配比，包埋型混合刺激劑采用凝膠包埋方法對最佳的非包埋型混合刺激劑進行了包埋處理，分別考察了不同類型刺激劑對芽孢桿菌Cr（Ⅵ）還原率影響的時間變化規律。

1.2.2菌懸浮液的制備

配制500mL的LB培養基（酵母提取物2.5g、胰蛋白胨5g和氯化鈉5g），加入蒸餾水充分溶解后定容至500mL，放人溫度121℃的高壓滅菌鍋滅菌20min，滅菌后分裝至錐形瓶中，待溫度降至室溫后接入0.3%（V/V）的處于對數生長期的菌液，培養至OD值為1.2，菌液在4℃、5000r·min-1下離心30min使其分離沉淀，棄上清，加入等量超純水制備成菌懸液（8.0x10-8個·mL-1），放入恒溫振蕩器（溫度：28℃，恒溫振蕩器轉數：160r·min-1）中培養24h后成為菌劑（F），取出放在4℃的冰箱冷藏備用。

1.2.3刺激劑制備方法

碳源型：甘蔗粉和乳酸鈉作為外加碳源型，將購買的甘蔗渣用去離子水反復清洗干凈后，放在70℃烘箱烘干水分，使用高速多功能粉碎機打碎后過100目篩，裝入密封袋中備用。將乳酸鈉透明糖漿狀液體，放置于5℃冰箱備用。

氮源型：尿素和豆粕粉作為外加氮源型，將豆粕粉和尿素過100目篩，裝入密封袋中備用。

離子型：硫酸銅和碳酸鈣作為外加離子型，稱取硫酸銅7.981g溶于100mL的蒸餾水中定容為500mmol·L-1Cu（Ⅱ）母液；稱取碳酸鈣5.004g溶于100mL的水中定容為500mmol·L-1Ca（Ⅱ）母液。分別放置于5℃冰箱備用。

礦物型：鈣基蒙脫石（以下簡稱蒙脫石）和海泡石作為礦物型，將蒙脫石和海泡石過100目篩，裝入密封袋中備用。

1.2.4單因素多水平試驗篩選不同類型刺激劑及最佳投加量

本試驗的刺激劑均使用紫外滅菌法滅菌15min。投加刺激劑和接種0.3%菌液到600mg·L-1Cr（Ⅵ）培養基中，設置3個重復，在28℃，160r·min-1的氣浴恒溫振蕩器中培養，每隔2d取樣2mL測定溶液中的Cr（Ⅵ）含量，到第16天為止（表1）。

1.2.5非包埋型混合刺激劑還原Cr（Ⅵ）的響應曲面試驗設計

由單因素多水平試驗可知，蒙脫石與甘蔗粉對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）的影響最大，所以將甘蔗粉與蒙脫石作為混合型刺激劑的材料。采用單因素多水平試驗優化混合型刺激劑和菌劑投加量的最佳配比。

（1）最佳配比單因素多水平試驗

不同投加量的甘蔗粉+蒙脫石+菌：以優化得到混合刺激劑開展單因素試驗，分別以0、4、6、8g·L-1和10g·L-1的投加量將甘蔗粉投放于含有600mg·L-1Cr（Ⅵ）培養基中，蒙脫石投加量為6g·L-1，菌劑投加量在0.3%。在28℃，160r·min-1的氣浴恒溫振蕩器中培養，每隔2d取樣2mL并測定溶液中的Cr（Ⅵ）含量，共測到第14天，設置3組重復。

不同投加量的蒙脫石+甘蔗粉+菌：以優化得到混合刺激劑開展單因素試驗，分別以0、4、6、8g·L-1和10 9．L-1的投加量將蒙脫石投放于含有600 mg·L-1Cr（Ⅵ）的培養基中，甘蔗粉投加量在8g·L-1，菌劑投加量在0.3%（v/v），其余步驟同上。

不同菌劑投加量+混合刺激劑：以優化得到混合刺激劑開展單因素試驗，分別以0、0.1%、0.3%和0.5%的投加量將菌劑投放于含有600mg·L-1Cr（Ⅵ）的培養基中，甘蔗粉投加量為8g·L-1，蒙脫石投加量為6g·L-1，其余步驟同上。

（2）響應面法優化非包埋型混合型刺激劑協同菌劑（HF）的最佳投加量

基于單因素篩選的甘蔗粉含量（A）、蒙脫石含量、菌劑投加量（C）實驗結果，本文利用回歸方程優化試驗條件（甘蔗粉、蒙脫石、菌劑），確定芽孢桿菌對Cr（Ⅵ）還原率最高時的條件組合（表2）。本試驗將其放入初始含量為600mg·L-1 Cr（Ⅵ）培養基中，在28℃，160r·min-1的恒溫培養箱中培養，于第8天測定Cr（Ⅵ）含量。

1.2.6包埋型刺激劑協同菌劑的制備方法

稱取質量分數為4%（m/V）的海藻酸鈉放人200mL超純水中70℃下加熱充分溶解海藻酸鈉，再稱取1.202g蒙脫石和1.601g甘蔗粉（等量縮小最優配比），放入含有海藻酸鈉的溶液中攪拌均勻，在120℃滅菌20min，冷卻至室溫得到混合液，用10mL注射器分別緩慢滴人已經滅菌的4%（m/V） CaC12溶液中交聯24h，形成固定化小球，用0.3%（m/V）的生理鹽水沖洗，再用無菌水沖洗3次得到海藻酸鈉+混合刺激劑（SH）。同SH制備方法相同，先制混合液，后將培養24h的菌在3000r·min-1離心5min得到菌劑，按照菌液比3：7放入滅菌好的混合液中用渦旋儀振蕩，用10 mL注射器將混合液緩慢滴入4%（m/V）CaC12溶液中交聯24h，用滅菌的0.3%（m／y）的生理鹽水沖洗再用無菌水清洗3次最后得到海藻酸鈉+混合刺激劑+菌（SHF）。

1.2.7包埋型刺激劑對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）的試驗

將600mg·L-1 Cr（Ⅵ）溶液用1moI·L-1的NaOH和HCI調節pH至中性（pH7.0），120℃滅菌20min，冷卻至室溫。在100mL錐形瓶中裝入60mL含量為600mg·L-1 Cr（Ⅵ）溶液，稱取6.001g包埋型刺激劑放入錐形瓶中用封口膜密封，在28℃，160r·min-1的恒溫振蕩器中培養，試驗設置3組重復，每隔2d取樣2mL測定溶液中的Cr（Ⅵ）含量，共測28d，見表3。

1.2.8表征方法

參考許銀等的制樣方法，將暴露于600mg·L-1Cr（Ⅵ）條件下第28天的F、HF和SHF，用0.1mmol·L-1磷酸緩沖液（PBS，pH7.0）洗滌3次，每次5000r·min-1離心15min，棄上清液后收集到F、HF和SHF樣品，分別加入2.5%（m/V）戊二醛溶液在4℃冰箱固定12h，然后用0.1mmol·L-1PBS洗滌3次，每次10min，最后用無水乙醇（25%、55%、75%、95%和100%）進行梯度脫水，放入-80℃冰箱冷凍8h，取出后用冷凍干燥機干燥8h；將處理好的樣品置于SEM-EDS（SU1510，日本日立集團）中觀察微觀結構。

1.3分析方法

非包埋型和包埋型刺激劑對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）的含量采用國家標準方法《水質六價鉻的測定二苯碳酰二肼分光光度法》（GB 7467-1987）進行測定，在波長為540nm測定吸光度，由標準曲線（y=0.540 9x+0.0021，R2=1）查得樣品Cr（Ⅵ）含量，再計算出Cr（Ⅵ）的還原率為：

1.4數據處理

利用Excel 2021和SPSS 21.0對數據進行統計分析。在數據分析之前，對數據進行方差同質性檢驗（Levene檢驗，Plt;0.05）。使用Origin Pr0 2018c（OriginLab，美國）繪圖。

2結果與討論

2.1不同刺激劑及其投加量對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）的影響

不同菌株對營養成分和最佳投加條件需求各不相同，因此需要對其刺激劑和最佳條件進行篩選。研究發現除CK外，隨著時間的延長，不同類型刺激劑單施對Cr（Ⅵ）的還原率表現出不同的影響；當添加刺激劑+菌劑后，在2-4 d對Cr（Ⅵ）還原率呈緩慢增長趨勢，6～8d對Cr（Ⅵ）的還原率顯著提高，10d之后對Cr（Ⅵ）的還原率顯著下降，并且不同投加量所表現出來的還原效果具有差異性（圖1～圖4）。

投加了碳源型刺激劑培養到8d后（圖1），與菌劑相比，G3、G4對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了6.11、7.33個百分點，SL3、SL4對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了2.21、2.31個百分點（Plt;0.05），刺激劑+菌劑組GF3、GF4對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了15.92、17.48個百分點，GF4最高還原率為87.34%，SLF3、SLF4對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了11.31、14.87個百分點（Plt;0.05），SLF4最高還原率為83.34%，培養10d后，發現只添加了碳源型刺激劑對Cr（Ⅵ）的還原率保持穩態下降，而添加了刺激劑+菌劑的還原率持續下降，且還原率依舊比單施刺激劑的還原率高，有研究表明，由碳源氧化產生的電子原本用于生物合成，但當有Cr（Ⅵ）存在時，電子會被用于還原Cr（Ⅵ），從而減慢了生長速度，杜兆林等研究發現，微生物會借助細胞表面及刺激劑帶負電荷的官能團，通過靜電吸引和絡合配位等作用來對鉻吸附，被吸附的鉻會穿過細胞膜進入細胞內，在微生物體內富集或被胞內酶（如還原酶等）將鉻還原成低毒狀態，因此刺激劑+菌劑的還原效率高于刺激劑單施加。SLF和GF含量越高對Cr（Ⅵ）的還原速率越快，可能是含有較多的小分子有機物，如有機酸、單糖、脂類和蛋白等，提供容易利用的溶解性有機碳源，能夠快速釋放出微生物可利用的碳源和營養物質，促使微生物還原Cr（Ⅵ）速率提高。從“變廢為寶”和還原Cr（Ⅵ）效果的角度考慮，選擇甘蔗粉作為碳源型刺激劑。

投加了氮源型刺激劑培養8d后（圖2），與菌劑相比，U3、U4對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了7.12、9.42個百分點，D3、D4對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了4.01、9.42個百分點（Plt;0.05），刺激劑+菌劑組UF3．UF4對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了13.07、14.01個百分點，UF4最高還原率為82.36%，DF3、DF4對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了15.12、15.56個百分點（Plt;0.05），DF4最高還原率為84.23%；培養10d后發現UF4和DF4對Cr（Ⅵ）的還原率下降緩慢，其他投加量下降較迅速，由此可知Cr（Ⅵ）還原率是隨著UF和DF含量的增加而增加，可能是含量越高，釋放出的可利用氮源的數量就越多，使芽孢桿菌對Cr（Ⅵ）產生了抗性。但是與豆粕粉相比芽孢桿菌對尿素的利用率較低，尿素是一種含有兩個氨基（NH2）的有機化合物，它的結構相對簡單，微生物可能更傾向于利用更復雜的氮源，如蛋白質或氨基酸，因為這些化合物中的氮更容易被微生物利用。豆粕粉本身作為有機氮源能給微生物提供豐富的氮源、蛋白質、礦物質等，使菌體生長量大，更有利于對Cr（Ⅵ）的還原，所以選擇豆粕粉為氮源型刺激劑。

與其他處理（4、6、8 mmol·L-1）相比，投加了10mmol．L-1離子型刺激劑后Cr（Ⅵ）的還原率呈先慢后快的增長趨勢（圖3）。在反應前2d時對Cr（Ⅵ）的還原率的增長較為緩慢．可能是芽孢桿菌在添加到含Cr（Ⅵ）的水體中同時受到了高濃度的離子影響，使芽孢桿菌不能產生足夠的還原酶來還原Cr（Ⅵ），對芽孢桿菌的生長產生了抑制作用，在第4天后對Cr（Ⅵ）的還原開始緩慢增長。培養至6d后，與菌劑相比，可知Ca（Ⅱ），、Ca（Ⅱ）。對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了6.79、6.85個百分點，Cu（Ⅱ）3、Cu（Ⅱ）4對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了6.73、7.37個百分點，刺激劑+菌劑組合Ca（Ⅱ）、Ca（Ⅱ）對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了10.16、11.70個百分點（Plt;0.05），Ca（Ⅱ）最高還原率為79.78%，Cu（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了11.02、9.72個百分點（Plt;0.05），Cu（Ⅱ）最高還原率為78.68%；培養到8～10d后發現刺激劑+菌劑對Cr（Ⅵ）的還原率持續下降，Cr（Ⅵ）降低菌株的活性和破壞菌株蛋白質的結構，并且存在離子間競爭吸附的可能，而單施刺激劑的處理中刺激劑含量高的處理對Cr（Ⅵ）的還原率保持恒定。Cr（Ⅵ）還原受到共存金屬離子的影響，與菌劑相比在添加刺激劑后，對Cr（Ⅵ）還原效果得到提升，其中Ca（Ⅱ）可以提高細胞活性，促進Cr（Ⅵ）生物還原，Cucn）含量超標會嚴重影響細胞發育。這與王廣順等研究變化趨勢一致，0.2～0.4mmol·L-1Cu（Ⅱ）含量對菌株Thp2-23還原Cr（Ⅵ）有明顯促進作用，隨著Cu（Ⅱ）含量的增加到0.4mmol·L-1以上促進作用呈現先增強后減弱的現象，高含量Cu（Ⅱ）抑制Thp2-23還原Cr（Ⅵ）。因此，選擇Ca（Ⅱ）3作為協同微生物還原Cr（Ⅵ）的離子型刺激劑。

投加礦物型刺激劑（圖4），培養到8d后，與菌劑相比，得知M2、M3對Cr（Ⅵ）的還原率分別提高了1.67、8.33個百分點，P：、P3對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了3.23、4.21個百分點（Plt;0.05），添加刺激劑+菌劑組MF2、MF3對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了16.52、18.84個百分點，MF3最高還原率為87.88%，PF2、PF3對Cr（Ⅵ）的還原率分別顯著提高了10.07、14.94個百分點（Plt;0.05），PF3最高還原率為83.78%。由此可知在第8天后，MF比PF對Cr（Ⅵ）的還原率高，海泡石是由Si-O-Si鍵斷裂形成的Si-OH．Si-0四面體中的氧原子及與Mg“配位結合的水分子，而蒙脫石是由Si-0四面體和Al-（0，OH）八面體組成，具有更強的親水性，能夠進行離子交換，吸附Cr（Ⅵ）中有害的陰離子基團（Cr0、Cr0），它既能為Cr（Ⅵ）提供電子也能作為微生物的附著材料，供其生長，減少Cr（Ⅵ）對芽孢桿菌的脅迫，所以選擇蒙脫石作為協同微生物還原Cr（Ⅵ）的礦物型刺激劑。

綜上可知，碳源型的甘蔗粉、氮源型的豆粕粉、離子型的Ca（Ⅱ）、礦物型的蒙脫石對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）的效率較高于其他刺激劑，它們的最佳投加量分別為10g·L-1、10g·L-1、10mmol·L-1、8g·L-1。尤其是甘蔗粉和蒙脫石對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）的刺激效果最佳，還原率分別達到了87.34%和87.88%。

2.2非包埋型混合刺激劑對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）的影響

隨著時間的延長，不同的投加量對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）的影響顯著增加，在培養2d后對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）不顯著，可能是芽孢桿菌對新環境適應的過程，培養8d后對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）顯著，10d之后還原率持續性降低（圖5）。甘蔗粉的不同投加量對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）的影響見圖5a，培養2d后，不同投加量的甘蔗粉對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）不顯著；培養到8d后，甘蔗粉的投加量為6、8、10g·L-1對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）增強，分別為94.13%、94.39%%、95.46%，與菌劑比較，分別顯著提高了23.79、24.53個和25.61個百分點，與單施蒙脫石比較，分別顯著提高了14.36、17.78個和18.76個百分點（Plt;0.05），因此當甘蔗粉投加量在10g·L-1后，芽孢桿菌對Cr（Ⅵ）還原情況最佳。蒙脫石的不同投加量對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）的影響見圖5b，培養2d后，蒙脫石投加量為8g·L-1時，對Cr（Ⅵ）還原率高于其他投加量，分別顯著提高了15.27、7.59、1.16個和6.03個百分點，培養到4～8d之后，與菌劑相比，顯著提高了22.65個百分點，與單施甘蔗粉相比，顯著提高了10.13個百分點（Plt;0.05），因此當蒙脫石投加量在8g·L-1后，芽孢桿菌對Cr（Ⅵ）還原情況最好，高瑞麗等研究發現單獨添加蒙脫石對重金屬的鈍化效果好，且質量比為5%時，鈍化效果最顯著。不同投加量的菌劑還原Cr（Ⅵ）的影響見圖5c，培養2～8d后，在菌劑投加量為0.3%時對Cr（Ⅵ）還原最顯著（Plt;0.05）。由此可知，混合型刺激劑不僅給菌提供了底物營養還提供了具有吸附性能的黏土礦物，使芽孢桿菌對Cr（Ⅵ）的還原效率顯著高于單施刺激劑。

由單因素試驗結果可以得到不同投加量的蒙脫石、甘蔗粉、菌劑投加量對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）有影響。本試驗采用三因素三水平16個試驗點響應面優化進行試驗，最終得到優化還原Cr（Ⅵ）的回歸模型（表3）。通過Design Expert建立二次曲面模型，擬合響應面回歸方程：

對該方程用回歸方差分析，F值和P-value值代表相關系數的顯著性，由表3可知，F值為148.79，為極顯著（Plt;0.0001），失擬項（P=0.264 5）不顯著，決定系數R2為0.9943，R2值越大，說明模型擬合度越高，精確度越高。比較三種獨立變量的F值可知對Cr（Ⅵ）還原率的影響順序為菌劑投加量gt;甘蔗粉gt;蒙脫石，而且AC（甘蔗粉與菌劑投加量）與BC（蒙脫石與菌劑投加量）交互項顯著。

為了描述各因子之間的交互作用對Cr（Ⅵ）還原的三維響應曲面見圖6。交互作用的強弱主要通過響應面曲線圖的形狀來體現，曲線的坡度越陡，說明兩個變量之間的交互作用越顯著；反之，表示交互作用不顯著。在固定菌劑投加量為3%、甘蔗粉投加量為6-10g·L-1、蒙脫石投加量為4～8g·L-1的條件下，Cr（Ⅵ）還原的響應曲面坡度變化較小，表明蒙脫石和甘蔗粉的交互作用不顯著（圖6a）。然而，當蒙脫石含量為6g·L-1時，甘蔗粉在6～10g·L-1，菌劑投加量在0.1%-0.5%范圍內，Cr（Ⅵ）還原的響應曲面呈現出陡峭的坡度，表明它們之間的交互作用非常顯著（圖6b）。Cr（Ⅵ）還原率隨著菌劑投加量的增加呈先增后減的趨勢；隨著甘蔗粉含量的增加，Cr（Ⅵ）還原率緩慢降低，這可能是因為芽孢桿菌生長量超過錐形瓶容量，導致生長停止。同時，甘蔗粉作為芽孢桿菌的碳源提供豐富的營養，但在營養過剩的情況下，微生物吸收變得困難。當甘蔗粉含量為8g·L-1，蒙脫石在4～8g·L-1，菌劑投加量在0.1%-0.5%范圍內時，Cr（Ⅵ）還原的響應曲面坡度較陡，表明它們之間的交互作用顯著（圖6c）。因此，得出結論：Cr（Ⅵ）還原率隨著菌劑投加量的增加先增加后減小，而隨著蒙脫石含量的增加，Cr（Ⅵ）還原率降低。采用響應面分析法可以有效地確定混合刺激劑的最佳投加量，并在減少工作量的同時實現條件優化，這種統計學方法已廣泛應用于各種篩選試驗的優化，并建立三維立體曲面圖，可以更直觀地分析不同混合投加量還原Cr（Ⅵ）的影響趨勢。本研究通過響應曲面分析法驗證甘蔗粉、蒙脫石和菌劑投加量三個因素對還原Cr（Ⅵ）的影響，優化混合刺激劑最優組合為甘蔗粉投加量8g·L-1、蒙脫石投加量6g·L-1、菌劑投加量0.3%。反應8d后，與菌劑相比增加了32.53個百分點。

2.3包埋型混合刺激劑對芽孢桿菌Cr（Ⅵ）還原率的影響

在Cr（Ⅵ）脅迫下，隨著時間的延長，發現SHF還原Cr（Ⅵ）的持久性顯著高于HF（圖7）。HF在第2-6天內Cr（Ⅵ）的還原率高于包埋型刺激劑，還原率最高達到95.95%，其在第8天之后還原率開始顯著下降，28 d后下降到74.93%，說明非包埋型刺激劑對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）在短期內能夠達到很好的效果，但后期由于HF不能提供良好的保護環境，造成芽孢桿菌死亡且前期已經還原的Cr（Ⅲ）被氧化成有毒的Cr（Ⅵ），因此缺乏持久性。相比而言，SH在第2天對Cr（Ⅵ）影響未表現JLH差異性，在第6天SH對Cr（Ⅵ）還原有較顯著變化，還原率分別為78.56%；從第6天開始SH在平緩增長，說明包埋型刺激劑中的材料在一定程度上影響Cr（Ⅵ）還原。而SHF在第2天時還原率為85.97%，與菌劑相比，還原率顯著提高了19.74個百分點，第6天時還原率顯著增加23.35個百分點（Plt;0.05），Cr（Ⅵ）還原率隨著時間的增加而增加。2-6d SHF還原率高，說明材料保護菌免受Cr（Ⅵ）毒害，且未加菌劑的SH對Cr（Ⅵ）有還原作用，因此材料本身對Cr（Ⅵ）有一定的還原作用。SHF可以提供一種保護性的環境，降低外界環境對芽孢桿菌的不利影響，并釋放出的材料作為電子供體增強微生物的還原酶活性，加速還原Cr（Ⅵ）。第8天時，與未加菌的包埋型刺激劑相比，SHF還原率顯著提高了18.76個百分點，與HF相比，SHF還原率顯著增加了15.43個百分點；第28天時，與未加菌的包埋型刺激劑相比，SHF對Cr（Ⅵ）還原率顯著提高了11.15個百分點，與HF相比，SHF還原率顯著提高了21.16個百分點（Plt;0.05）。由此可知在Cr（Ⅵ）暴露下，SHF依然能夠長效地保護微生物免受鉻離子毒害，包埋型刺激劑控制甘蔗粉和蒙脫石的釋放速率，使其在一段時間內逐漸釋放，這種時效性釋放有助于維持刺激劑對芽孢桿菌的影響，并延長其在環境中的作用時間，Song等發現將芽孢桿菌KSB7固定在花生生物炭上與地膚聯用，可以顯著提高微生物的豐度，鉻的可提取量降低了53.42%。

2.4芽孢桿菌表面結構的表征

為了直觀地顯示在Cr（Ⅵ）脅迫下芽孢桿菌的變化，使用SEM觀察試驗28d后的材料，發現未加Cr（Ⅵ）的芽孢桿菌呈直桿狀，表面光滑．菌株形態較完整，未出現變形（圖8a）；而在Cr（Ⅵ）脅迫下未添加包埋型混合刺激劑的芽孢桿菌細胞出現皺縮甚至破裂的現象，形態結構不完整（圖8b），表明微生物在沒有營養物質條件下，生長代謝緩慢，Cr（Ⅵ）使菌株細胞表面活性成分受到破環；添加非包埋混合刺激劑的菌出現輕微皺縮，點狀斷裂，形態結構較為完整，表明混合型刺激劑不能長時間對芽孢桿菌提供能量和生存空間（圖8c）；而SHF表現出較為完整的形態結構，未出現皺縮的情況，推測包埋型混合刺激劑可以作為芽孢桿菌的保護機制（圖8e），包埋型混合刺激劑具有多孔結構，有利于細菌表面附著，孔狀結構即可以為菌株提供生存空間，也能為營養物質和污染物提供流通的通道。在Cr（Ⅵ）脅迫下，包埋型混合刺激劑中觀察到芽孢桿菌末端出現絨毛狀產物（圖8f），該物質在未經Cr（Ⅵ）處理的芽孢桿菌中未曾出現，因此猜測該物質可能是芽孢桿菌產生的胞外分泌物（如胞外蛋白等）通過絡合配位等作用來固定Cr（Ⅲ），或使Cr（Ⅲ）以氫氧化物等形式沉淀。為驗證猜想，對其出現絨毛狀產物表面進行EDS分析（圖8g），發現除了0元素外Cr元素含量較多，猜測芽孢桿菌細胞表面存在鉻還原產物。Chatterjee等從SEM中觀察銅綠假單胞菌吸附Cr（Ⅵ）前后產物的變化可知，未經處理的銅綠假單胞菌表面光滑、不曾出現不定形物質，而經Cr（Ⅵ）處理后發現Cr（Ⅲ）沉淀物以不定形物質聚集在細胞表面。陳旭等對奇異變形桿菌還原Cr（Ⅵ）的研究中，用EDS分析檢測結果與以上結果一致。Das等也進行類似的觀察，發現淀粉樣芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）也有相似的特征。

結果表明，外源刺激劑在不同添加方式（非包埋型和包埋型）中顯著提高了芽孢桿菌對Cr（Ⅵ）的還原，特別是，非包埋型刺激劑在短期內迅速提升了芽孢桿菌對Cr（Ⅵ）的高效還原，而包埋型刺激劑使得芽孢桿菌對Cr（Ⅵ）的還原表現出長效性，并顯著降低了Cr（Ⅵ）的毒性。在一定范圍內，增加刺激劑的含量有助于提高微生物對Cr（Ⅵ）的高效還原效率，需要注意的是，過量的營養條件可能產生負面效應。因此，在本研究中甘蔗粉在10mg·L-1時對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）最佳，而蒙脫石在8mg·L-1時對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）最佳。本研究只關注了芽孢桿菌對600mg·L-1Cr（Ⅵ）的還原，未深入探討低濃度及不同溫度條件下刺激劑對芽孢桿菌的影響，僅使用SEM-EDS對芽孢桿菌的表面形態變化和元素確定進行了觀察，而并未深入研究在刺激劑的作用下芽孢桿菌是否通過胞外聚合物參與還原過程，或者是否涉及細胞內部的特異性功能等問題。因此，要準確揭示芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）的機制，還需要進一步研究和深入探討。

通過以上研究結果，建議在實際的微生物修復Cr（Ⅵ）的治理工程中，應急治理項目優先使用非包埋型混合刺激劑，該類型刺激劑可以在短時間內提升工程菌的Cr（Ⅵ）還原能力，非應急項目建議優先使用包埋型混合刺激劑，其能顯著提升工程菌的Cr（Ⅵ）長效還原能力?；旌闲痛碳┲刑荚葱汀⒌葱汀⒌V物型和離子型刺激劑的添加種類和比例應根據場地的實際情況進行靈活調整。

3結論

（1）篩選得到Ca（Ⅱ）、蒙脫石、豆粕粉、甘蔗粉這四種刺激劑為廉價無二次污染的刺激劑，其對芽孢桿菌還原Cr（Ⅵ）效率的提升能力排序為甘蔗粉gt;蒙脫石gt;豆粕粉gt;Ca（Ⅱ）。

（2）由還原效果最佳的蒙脫石和甘蔗粉構建混合刺激劑，以響應曲面得出對Cr（Ⅵ）還原率的影響順序為菌劑投加量gt;甘蔗粉gt;蒙脫石，且甘蔗粉+菌劑和蒙脫石+菌劑對Cr（Ⅵ）還原影響顯著。

（3）與非包埋型刺激劑相比，包埋型刺激劑顯著提升了芽孢桿菌對Cr（Ⅵ）還原的長效性，隨著處理時間的延長，Cr（Ⅵ）去除率不斷增強，在第28天時對Cr（Ⅵ）還原率增加到97.09%。

（4）SEM-EDS觀察可知包埋型刺激劑有效地保護了芽孢桿菌，減小了Cr（Ⅵ）對其細胞的毒害作用，細胞結構完整，未出現皺縮和斷裂。