氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯在葡萄上的殘留及膳食風險評估

摘要：為明確氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯在葡萄上的殘留風險，開展了一年十地的規范殘留試驗，建立了高效液相色譜法（HPLC）測定葡萄中氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯殘留的分析方法。結果表明，在0.1～20.0 mg·L-1范圍內，氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯質量濃度與其峰面積均呈良好的線性關系，相關系數大于0.99。在0.05、0.50 mg·kg-1和2.00 mg·kg-1添加水平下，氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯在葡萄中的平均回收率分別為88.1％-112.3％和90.5％-101.5％，相對標準偏差（RSD）分別為3.1％-8.2％和3.5％-9.1％，檢測方法定量限（LOQ）均為0.05 mg·kg-1。采收間隔期為14 d，時葡萄中氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯的殘留中值（STMR）分別為0.16 mg·kg-1和0.12 mg.kg-1，最高殘留值（HR）分別為1.44 mg·kg-1和1.48 mg·kg-1。葡萄中氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯對一般人群的長期膳食攝入風險的貢獻率分別為0.142％和0.036％，短期膳食攝入風險商分別為7.8％和5.7％，對1-6歲兒童的短期膳食攝入風險商分別為19.6％和14.4％。研究表明，按照推薦劑量規范使用，氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯在葡萄中的殘留量對1-6歲兒童和一般人群造成的健康風險處于安全水平。

關鍵詞：氟吡菌酰胺；吡唑醚菌酯；葡萄；殘留；膳食風險評估

中圖分類號：TS255.7 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）01-0030-07 doi：10.11654/jaes.2023-0704

葡萄是我國的主栽果樹之一，產業鏈長、栽培范圍廣。根據國際葡萄與葡萄酒組織統計，2021年我國葡萄種植面積達78.26萬hm2，位居世界第3位，產量居全球首位，葡萄產業對我國農業產業發展和全面推進鄉村振興做出了巨大貢獻。灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染引起的制約葡萄產業發展的主要病害之一，每年導致20％-40％的葡萄減產，嚴重時高達60％以上。目前，化學防治仍是灰霉病田間防治的主要手段。

氟吡菌酰胺（fluopyram）和吡唑醚菌酯（pyraclos-trobin）屬不同作用機理的兩種不同類型殺菌劑，化學結構式見圖1。前者主要通過抑制病原菌琥珀酸脫氫酶而發揮殺菌作用，主要登記用于防治果蔬、花卉等由真菌感染而引起的灰霉病、白粉病、霜霉病等多種病害，而后者為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，主要通過阻止電子在細胞色素b和c1之間的傳遞而抑制線粒體呼吸作用，阻礙三磷酸腺苷的產生導致細胞死亡。氟吡菌酰胺與吡唑醚菌酯的混用或復配制劑能有效擴大對病原菌的防治譜，同時延緩病原菌抗藥性的產生。目前已有氟吡菌酰胺在蘋果、西瓜、石榴和芒果等，以及吡唑醚菌酯在葡萄、香蕉、草莓、柑橘和蘋果等水果上的殘留行為研究，但尚未見針對氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯復配制劑在葡萄上應用的研究報道。因此，明確兩者在葡萄上的殘留水平及膳食風險評估，對于保障葡萄生產過程的風險控制和質量安全監管等均具有重要的意義。

本研究采用高效液相色譜法建立了同時測定氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯在葡萄上的殘留檢測方法，研究了氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯在葡萄中的最終殘留量，并運用點評估法對氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯開展膳食風險評估，旨在為這兩種殺菌劑在葡萄上科學合理使用準則的制定提供技術支撐。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

主要儀器：LC-20AT型高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器（日本島津公司）；AL204型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；NV212B型百分之一天平（奧豪斯儀器有限公司）；Blixer 2型粉碎機（法國Robot-Coupe公司）；Hei-vap型旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司）；SC-3614型離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；KQ-800B型超聲波清洗器（江蘇昆山市儀器公司）；ZD-85型氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；SHB-B95T型循環水真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；Elix 3Synergy UV-R型超純水儀（美國Millipore公司）。

供試藥劑和試劑：氟吡菌酰胺（ fluopyram）標準品，質量分數99.8％（Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）標準品，質量分數98％（沈陽化工研究院有限公司）；50％氟吡菌酰胺·吡唑醚菌酯懸浮劑（氟吡菌酰胺質量分數25％，吡唑醚菌酯質量分數25％，廣東省佛山市盈輝作物科學有限公司）；乙腈（色譜純，霍尼韋爾國際公司），二氯甲烷（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）；氯化鈉、無水硫酸鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；PSA、HC-C18（上海安譜科學儀器有限公司）；超純水，由實驗室Elix3 Synergy UV-R型超純水儀制備。

1.2田間試驗

試驗設計參照《農作物中農藥殘留試驗準則》（NYIT 788-2018）。供試藥劑為50％氟吡菌酰胺·吡唑醚菌酯懸浮劑。葡萄品種為各試驗點當地主栽品種：廣西壯族自治區桂林市、湖南省寧鄉市、山東省泰安市、河南省新鄉市、福建省福安市和貴州省黔南州為巨峰；陜西省西安市為戶太八號；安徽省宿州市為黃金鐘；北京市為玫瑰香；寧夏回族自治區銀川市為美樂。

分別在廣西壯族自治區桂林市、陜西省西安市、安徽省宿州市、北京市、寧夏回族自治區銀川市、湖南省寧鄉市、山東省泰安市、河南省新鄉市、福建省福安市和貴州省黔南州等十地進行最終殘留試驗。每個試驗點設置1個處理小區和1個對照小區，試驗小區不少于8棵葡萄藤，且滿足多次采樣量的要求。于葡萄灰霉病發病前或發病初期開始施藥，將50％氟吡菌酰胺·吡唑醚菌酯懸浮劑以田間推薦的高劑量（200 mg·kg-1）稀釋2 500倍液后均勻噴霧，每棵葡萄噴灑的藥液量，以葡萄和葡萄葉滴水為準，施藥3次，施藥間隔期為7d，于最后一次施藥后間隔14 d和21 d分別采集葡萄樣品。

采樣時戴一次性手套，按照先對照小區后處理小區的順序進行，每個小區采2個獨立樣品，按設計方案采樣時間的要求，隨機在試驗小區內上、下、左、右不同方位從不少于8棵葡萄藤上采集生長正常、無病害的葡萄樣品（不少于1 kg），裝入容器中，容器內外各加上標簽。田間樣品在采集后，8h內運回實驗室，并將從田間采摘的葡萄樣品去除果柄后，用粉碎機加于冰將葡萄樣品粉碎混勻，四分法分別取250 g樣品2份，裝入封口密封袋中，貼好標簽，于-18℃冰箱中保存待測。

1.3分析方法

1.3.1色譜分析條件

Agilent ZORBAX extend-C18色譜柱（4.6 mmx250 mm，5um）；柱溫為40℃；流動相：A為乙腈、B為超純水，流速為1.0 mL·min-1；梯度洗脫程序：A：B體積比為60： 40，保持16 min；A：B體積比為95：5，保持5 min；A：B體積比為60：40，保持14 min。進樣量：20uL；測定波長：270 nm。在此條件下，氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯的保留時間分別約為7.5 min和14.5 min。

1.3.2樣品前處理

準確稱取粉碎混勻后的葡萄樣品10 g（精確到0.01 g）于250 mL塑料離心瓶中，加入50 mL乙腈，回旋振蕩30 min，于4 000 r·min-1離心5 min，上清液全部置于分液漏斗中；分液漏斗中加入20 mL 5％氯化鈉水溶液，分別用50、30 mL二氯甲烷萃取，過無水硫酸鈉收集有機相于250 mL圓底燒瓶中，于45℃水浴下真空旋轉蒸發至近于，冷卻后用2 mL乙腈定容，待凈化。將定容液轉移至盛有50 mg PSA和50 mg C18的離心管中，漩渦振蕩后離心5 min，經0.22 um有機相濾膜過濾，待檢測。

1.4標準溶液配制及標準曲線的繪制

分別準確稱取含有氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯25 mg（精確到0.1 mg）的標準品，用乙腈溶解并定容至50 mL，配制成質量濃度為500 mg·L-1的標準品母液。準確移取標準品母液，用乙腈稀釋配制成一系列混合標準溶液，使氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯的質量濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、20.0 mg·L-1，采用1.3.1節色譜條件進行測定，以質量濃度為橫坐標、峰面積響應值為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程和相關系數。

1.5添加回收試驗

在空白葡萄樣品中分別添加一定量的氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯標準溶液，添加濃度分別為0.05、0.50、2.00 mg·kg-1，每個添加濃度設5次重復。添加后靜置30 min，按1.3節分析方法進行樣品提取和色譜檢測，計算添加回收率和相對標準偏差（RSD）。

1.6膳食攝入風險評估

1.6.1長期膳食攝入風險

依據我國居民營養與健康狀況調查報止，結合氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯在葡萄中的規范殘留田間試驗殘留中值（STMR，mg·kg-1），按公式（1）計算國家估算每日攝入量（NEDI，mg·kg-1 bw），按公式（2）將NEDI與每日允許攝入量（ADI，mg·kg-1 bw）進行比對計算風險商（RQ，risk quotient），當RQ≤100％時，表示長期膳食攝入風險在可接受范圍，RQgt;100％則表示存在不可接受的長期膳食攝入風險。

NEDI=∑（STMRixEixPixFi）/bw （1）

RQI％=（NEDI/ADI）x100 （2）

式中：i為初級食用農產品代號；E和P分別為食品的可食部分因子和加工因子，葡萄均取1；F為食品消費因子，根據FAO/WHO database CIFOCOss （Chronic individual food consumption database）數據庫提供的我國部分長期膳食消費數據，我國一般人群葡萄的每日膳食消費量（97.5百分位值）為5.587 5 g；bw為我國一般人群人均體質量，為63.0 kg。由于缺少氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯在其他已登記作物上的STMR值，若采用相應的最大殘留限量（MRL，mg·kg-1）值代替STMR進行評估，將超過風險最大化的范圍，失去風險評估的科學意義，因此本研究只計算兩者在葡萄上的NEDI對RQ的貢獻率（RQc，％）。

1.6.2短期膳食攝入風險

短期膳食攝入風險是基于特定人群中短期內（一餐或24 h內）的膳食暴露量，當其超過一定水平的農藥殘留量時可能導致的風險。根據JMPR（ Joint Meeting of Pesticide Residues）評估農藥殘留的短期膳食攝入方法，鮮食葡萄的可食部分單位質量為636.58 g，大于大份額膳食消費量，采用短期膳食風險評估情形（2b）按公式（3）計算國家估算短期攝入量（NESTI，mg·kg-1

bw），按公式（4）將NESTI與急性參考劑量（ARfD，mg·kg-1 bw）進行比對計算短期膳食攝入風險商（％ ARfD），當％ARfD≤100％時，表示短期膳食攝入風險在可接受范圍，％ARfDgt;100％則表示存在不可接受的短期膳食攝入風險。

NESTI=（LPxHRxv）/bw （3）

％ARfD=（NESTI/ARfD）x100 （4）

式中：v為變異因子，表示一批產品中不同個體或同一個體中不同部位的平均殘留量與殘留量高位點值之間的差距，葡萄為3；LP為大份額膳食消費量，我國1-6歲兒童葡萄的大份額膳食消費量（97.5百分位值）為365.90 g，一般人群大份額膳食消費量（97.5百分位值）為569.98 g。1-6歲兒童的人均體質量為16.1 kg；HR為基于規范殘留田間試驗得到的最高殘留值，mg·kg-1。

2結果與討論

2.1方法有效性評價

在0.1-20.0 mg·L-1質量濃度范圍內，氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯的峰面積與其質量濃度呈現出良好的線性相關性，其線性回歸方程分別為y=9 974x-482.8和y=58 305x-341.9，R2均大于0.99，標樣的高效液相色譜圖見圖2。添加回收試驗結果（表1）表明：在葡萄中的添加濃度分別為0.05、0.50、2.00 mg·kg-1時，氟吡菌酰胺的平均回收率在88.1％-112.3％之間，RSD在3.1％-8.2％之間；吡唑醚菌酯的平均回收率在90.5％-101.5％之間，RSD在3.5％-9.1％之間。符合《農作物中農藥殘留試驗準則》（NY/T 788-2018）中殘留分析檢測的要求，根據最低添加水平確定該方法對氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯的定量限（LOQ）均為0.05 mg·kg-1。

2.2最終殘留試驗結果

一年十地的最終殘留試驗結果（表2）表明：采收間隔期為14 d時，氟吡菌酰胺在葡萄中的殘留量在lt;0.05-1.44 mg·kg-1之間，STMR為0.16 mg·kg-1，HR為1.44 mg·kg-1；吡唑醚菌酯在葡萄中的殘留量在lt;0.05-1.48 mg·kg-1之間，STMR為0.12 mg·kg-1，HR為1.48 mg·kg-1。采收間隔期為21d時，氟吡菌酰胺在葡萄中的殘留量在lt;0.05-1.18 mg·kg-1之間，STMR為0.16 mg·kg-1，HR為1.18 mg·kg-1；吡唑醚菌酯在葡萄中的殘留量在lt;0.05-1.41 mg·kg-1之間，STMR為0.11 mg·kg-1，HR為1.41 mg·kg-1。

根據各國氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯在葡萄上的MRL值制定情況可以看出（表3）：50％氟吡菌酰胺·吡唑醚菌酯懸浮劑以田間推薦的高劑量（200 mg·kg-1）稀釋2 500倍液后均勻噴霧，施藥3次，施藥間隔期為7d，于最后一次施藥后間隔14 d和21d分別采集葡萄樣品，僅有吡唑醚菌酯的殘留量超過歐盟規定的鮮食葡萄MRL值（0.3 mg·kg-1）。若作為鮮食葡萄出口歐盟，為避免雙方之間的貿易糾紛，應謹慎使用該藥劑防治葡萄灰霉病。同時田間施藥后不同試驗點間最終殘留量略有差別，其中貴州試驗點在葡萄中不同采收間隔期的最終殘留量均在1.18-1.48 mg·kg-1之間，顯著高于其他試驗點，這可能是該地作物生長狀況、氣候和土壤條件以及人為因素等差異造成的。

2.3膳食風險評估

2.3.1長期膳食攝入風險

我國在《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763-2021）中制定氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯的ADI值分別為0.01 mg·kg-1 bw和0.03 mg·kg-1 bw。按照風險最大化原則，采用采收間隔期為14 d時氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯在葡萄中的STMR（0.16 mg·kg-1和0.12 mg·kg-1）計算NEDI值。結果表明（表4）：葡萄中氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯殘留量的對我國一般人群的RQc分別為0.142％和0.036％，均遠低于100％。表明葡萄中氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯的殘留量對風險商的貢獻率很低，按照推薦劑量和推薦安全間隔期規范使用，該藥劑在葡萄上使用是安全的。

由于我國在《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》（GB2763-2021）中制定氟吡菌酰胺在葉用萵苣和結球萵苣（15 mg·kg-1）上，吡唑醚菌酯在蕪菁葉、芹菜和水芹（30 mg·kg-1）以及菠菜和油麥菜（20 mg·kg-1）上的MRL值均較高，葡萄與這些蔬菜共同食用時可能存在一定的長期膳食攝入風險，值得重點關注。

2.3.2短期膳食攝入風險

氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯的ARfD值分別為0.5mg·kg-1 bw和0.7 mg·kg-1 bw。根據JMPR推薦的評估方法，按照公式（3）和公式（4）計算得到葡萄中氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯殘留對我國1-6歲兒童及一般人群的短期膳食攝入風險，結果表明（表5）：葡萄中氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯殘留對我國1-6歲兒童的％ARfD值分別為19.6％和14.4％，對我國一般人群的％ARfD值分別為7.8％和5.7％，均遠低于100％，說明其短期膳食攝入風險在可接受范圍內。1-6歲兒童的％ARfD均高于一般人群，導致其短期膳食攝入風險較一般人群偏高的原因可能是由于兒童的人均體質量偏小引起，因此兒童人群需要均衡膳食，避免短期大量攝入單種食物以降低農藥短期膳食攝入風險。

3結論

（1）本研究建立了同時測定葡萄中氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯殘留的分析方法，該方法的平均回收率均為88.1％-112.3％，相對標準偏差均為3.1％-9.1％，檢測方法定量限為0.05 mg·kg-1，能滿足農藥殘留分析檢測的要求。

（2）50％氟吡菌酰胺·吡唑醚菌酯懸浮劑防治葡萄灰霉病，以田間推薦的高劑量（200 mg·kg-1）稀釋2 500倍液后均勻噴霧，施藥3次，施藥間隔期為7d，于最后一次施藥后間隔14 d和21d分別采集葡萄樣品，氟吡菌酰胺在葡萄中的殘留量在lt;0.05-1.44 mg·kg-1之間，吡唑醚菌酯在葡萄中的殘留量在lt;0.05-1.48 mg·kg-1之間，均低于我國制定葡萄中氟吡菌酰胺（2 mg·kg-1）和吡唑醚菌酯（2 mg·kg-1）的最大殘留限量值，但應該重點關注作為鮮食葡萄出口歐盟時的殘留水平，避免貿易糾紛。

（3）根據規范殘留田間試驗得到的殘留試驗數據，采用采收間隔期為14 d時，葡萄中氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯的殘留中值和最高殘留值進行長期膳食攝入風險評估和短期膳食攝入風險評估。結果表明，對我國一般人群的長期膳食攝入風險評估中，葡萄中氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯殘留量的貢獻率分別為0.142％和0.036％，風險商貢獻率均遠低于100％，因此該藥劑在葡萄上按照推薦劑量和推薦安全間隔期規范使用是安全的。

（4）對我國1-6歲兒童及一般人群的短期膳食攝入風險評估中，葡萄中氟吡菌酰胺和吡唑醚菌酯殘留量的短期膳食攝入風險商值均低于100％，風險在安全水平范圍內。