牛糞對雙孢菇茵渣堆肥過程中碳氮轉化及真菌群落的影響

摘要：為揭示牛糞對雙孢菇菌渣堆肥過程中真菌群落動態及其對碳氮轉化的影響，使用高通量測序技術探索了牛糞和菌渣堆肥過程中真菌群落組成、結構的變化，利用生物信息學的方法分析了真菌群落及其與碳、氮組分間的相互作用關系。以牛糞和菌渣作為研究對象，采用條垛式堆肥的方法共堆肥42 d，設CK（100％雙孢菇菌渣）和CD（雙孢菇菌渣：牛糞=7：3）兩個處理。結果表明：CD處理比CK堆肥總有機碳（TOC）降低2.17％，腐熟期碳、氮分別提高48.69％和4.01％，發芽指數（GI）提高49.33％。添加牛糞提高了菌渣堆肥中真菌群落豐富度和多樣性，堆體溫度高且高溫期延長23 d；子囊菌門和擔子菌門是兩處理的優勢菌門；CD處理食線蟲菌屬（Duddingtonia）、Coprinellus、鬼傘屬（Coprinopsis）、細粒嗜熱菌屬（Thermomyces）的相對豐度均高于CK，有利于碳氮轉化。利用Pearson相關系數構建網絡模型，分析篩選出與碳氮轉化相關的核心真菌屬，CD處理有2個與TOC相關的核心真菌屬（50％正相關），CK處理中有7個屬與TOC相關（28.6％正相關）。菌渣牛糞聯合堆肥真菌共現網絡的關聯性和復雜性更高，真菌群落間競爭減弱，平均路徑長度較低，網絡更敏感。菌渣堆肥添加牛糞可改變核心真菌與TOC和總氮（TN）間的關系，在CD處理中TOC核心菌與TOC呈正相關，而在CK處理中呈負相關。兩處理TN核心菌與TN間均呈顯著正相關關系，與TOC負相關。研究表明，菌渣與牛糞聯合可使堆體快速升溫，延長堆體的高溫期，核心真菌通過增加與其他微生物的相互作用，影響碳氮轉化，降低TOC損失率，提高堆肥品質。

關鍵詞：堆肥；菌渣；牛糞；真菌群落；碳氮轉化；核心真菌

中圖分類號：S141.4 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）01-0162-12 doi：10.11654/jaes.2023-0019

食用菌栽培過程中會形成大量的食用菌殘渣，隨著食用菌產業的發展，菌渣產量持續增加。菌渣中富含氮、磷、鉀等礦質元素，是寶貴的可再生資源。但由于菌渣中木質纖維素含量高，并攜帶植物病原菌，直接施用于土壤會造成環境污染。將菌渣進行高溫堆肥處理，可以減少菌渣中植物病原菌含量，并提高菌渣肥效。大量研究表明，菌渣與動物糞便聯合堆肥能夠顯著提高堆體溫度，加快物質轉化和腐殖化進程，改善堆肥產品質量，添加牛糞的效果好于雞糞和豬糞。余文娟等的研究表明堆肥后的菌渣電導率（EC）顯著降低，更適合作為育苗基質。單洪濤等發現金針菇菌渣堆肥中的放線菌具有富集Na+、Mg2+、Ca2+等離子的能力，其可使菌渣中可溶性鹽含量大幅降低。

菌渣堆肥過程中，微生物的代謝活動會消耗碳、氮營養。降低堆肥過程中碳、氮損失率對提高堆肥質量具有重要意義。真菌可利用多種碳源，在物質的循環過程中發揮著重要作用。真菌是纖維素、木質素等難降解有機化合物的主要分解菌，能通過分泌纖維素、半纖維素水解酶和漆酶等胞外酶分解木質纖維素，同時真菌菌絲體的機械穿插作用，對堆肥原料起一定的物理破壞作用，促進生化反應。Maji等和Organo等的研究表明木霉能加速水稻秸稈的降解和堆肥的腐殖化進程。Monteiro等發現Duddingtomia能促進有機物的降解，并捕食植物寄生線蟲。Gong等發現在堆肥中接種Phanerochaete chrysosporium能顯著促進木質素和纖維素的降解，提高堆肥溫度，延長高溫階段，提高堆肥效率和最終堆肥質量。許多研究表明，真菌參與有機氮的礦化、生物固氮作用、硝化和反硝化過程。Bello等發現在牛糞-玉米秸稈堆肥過程中，Ciliophora和Pleosporales介導總氮（TN）轉化，Scedosporium和Microascaceae決定NO-3轉化，Coprinopsis cinerea和Penicillium oxalicum影響NH+4轉化。微生物的反硝化作用使氮以N2和NO2等氣體形式排入大氣，從而導致氮素損失，N2O是真菌反硝化過程的唯一產物，Fusarium、Pen，iciltium、Monographella、Acremonium、Gibberella，Eurotium、Pseudallescheria是N2O最主要的潛在生產者。細菌是固氮微生物的主體，但是真核生物可以與細菌建立共生關系共同參與生物固氮。Berry等證明了無論豐度如何，關鍵菌群在有機物轉化過程中都發揮著重要作用。然而從真菌角度探討堆肥過程中畜禽糞便添加對碳氮轉換影響的研究還較少，菌渣堆肥中添加牛糞對于養分轉換的微生物學機制尚不清楚。

為了進一步解析畜禽糞便在雙孢菇菌渣堆肥過程中的促進作用，探究畜禽糞便對堆肥過程中營養轉化及真菌群落結構的影響，本研究以牛糞作為雙孢菇菌渣堆肥的添加劑，探究牛糞對菌渣堆肥過程中真菌群落動態、真菌群落及核心真菌對碳氮轉化的影響，為控制堆肥進程、減少氮素損失、提高雙孢菇菌渣堆肥質量和效率提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗設計與采樣

本研究在黑龍江八一農墾大學試驗基地進行。雙孢菇菌渣取自大慶恒瑞食用菌有限公司，牛糞取自安達畜牧業基地，其基本理化性狀見表1。采用條垛式堆肥的方法，堆體為梯形，下底長2.5 m、寬1.5 m，頂長1.9 m、寬0.9 m，高1.5 m。試驗設兩個處理，將雙孢菇菌渣和牛糞以7：3體積比充分混合均勻作為CD處理，以雙孢菇菌渣單獨堆肥作為對照（CK）。初始含水率約為60％，堆肥過程中每天測量堆體溫度和環境溫度，根據溫度變化在第10、20、29天人工翻堆3次，當堆體溫度穩定趨近于室溫時認為堆肥腐熟完全。分別于升溫期（第1天）、高溫期（第3天）、降溫期（第17天）和腐熟期（第36天）進行樣品采集，在距離堆頂20、70、120 cm的每個位置隨機采樣5點，采集的樣品質量約0.5 kg，混勻后將樣品一式兩份，一份保存于-80℃超低溫冰箱中用于高通量測序，另一份風干磨碎用于理化指標分析。CK和CD 4個時期分別標記為CK1、CK3、CK17、CK36和CD1、CD3、CD17、CD36。

1.2理化指標的測定

采用自動溫度記錄儀（DS192X，上海發泰精密儀器儀表有限公司，中國）測量堆肥過程中堆肥溫度和環境溫度，每天下午3：00記錄堆體頂部、中部和底部的溫度，取其平均值作為當天的溫度。理化指標的測定參照鮑士旦的方法進行，每個樣品重復測定3次。含水量采用烘干法測定；總有機碳（TOC）采用重鉻酸鉀容量法測定；TN采用凱氏定氮法測定；NH+4-N和NO-3-N采用2 mol·L-1 KCl溶液提取，分別采用靛酚藍比色法和雙波長紫外分光光度法測定；pH和EC采用pH計和電導儀測定（液固比10：1）。

1.3高通量測序

選擇第1、3、17天和第36天的樣本進行高通量測序。按照說明書，使用土壤DNA試劑盒（飛凈Phygene，福建）進行DNA提取，提取后的DNA經過純化、擴增后進行高通量測序。高通量測序在北京奧維森基因科技有限公司的Illumina MiSeq300平臺上進行，擴增ITS1區測定真菌ITS序列，引物為ITSl-F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2（TGC-GTTCTTCATCGATGC）。原始數據通過序列拼接、過濾和去嵌合體后得到優質序列，然后進行OTUs聚類及物種注釋。基于OTUs聚類結果，進行Alpha多樣性、Beta多樣性分析，基于物種注釋結果進行真菌群落結構差異分析。

1.4生物信息學和統計分析

真菌多樣性指數和OTUs豐度使用R的“vegan”包計算。為探索真菌群落組成和功能與非生物因素的關系，利用R的“ggcor”包（0.9.8.1）對環境因子與微生物（OTUs水平）之間的關系進行Mantel分析，用OmicShare tools繪圖（https：//www.omicstudio.cn/tool/62.）。采用R的“plot（g）”包進行核心真菌篩選和共線網絡分析，利用Gephi軟件可視化并計算拓撲屬性。使用AMOS軟件（IBM；SPSS AMOS 20.0.0）構建結構方程模型，評估真菌群落、核心真菌對菌渣堆肥過程中碳氮轉化的貢獻。

2結果與討論

2.1理化參數變化

2.1.1溫度的變化

堆肥過程中堆體溫度和環境溫度的變化見圖1。前3d兩處理堆體溫度均迅速上升，CD處理堆體溫度在第3天達到54℃，在第5天達到最高溫（56℃），高溫期（gt;50℃）共持續了20 d。CK處理堆體溫度在第3天達到最高值（47℃）并持續4d，但始終未超過50℃。CD處理升溫快，堆體溫度高可能是由于牛糞中含有大量的可利用碳源和氮源（表1），微生物活動旺盛，可有效消除原材料中的病原體和雜草種子，使堆肥符合安全標準。CK堆肥物料100％為雙孢菇菌渣，菌渣中缺乏微生物可利用的有效碳源和氮源，微生物生長發育受阻，導致堆體溫度不高。另外，也可能與物料本身所含的微生物豐度差異有關。微生物分解有機物產生熱量是堆體溫度變化的主要原因，雙孢菇菌渣與牛糞聯合堆肥提高了堆體溫度及微生物活性，加速了堆肥進程。

2.1.2碳氮組分含量的變化

TOC是微生物本身所依賴的碳源與能源。兩個處理堆肥TOC含量總體呈下降趨勢（圖2a），但CD處理始終高于CK，到堆肥結束時CD處理TOC損失率（11.96％）較CK處理低（14.13％）。這可能與CD處理原材料中含有大量的TOC有關。CD處理微生物活動旺盛，堆體溫度高，但TOC損失率較低，表明菌渣與牛糞聯合堆肥在加速有機物料降解的同時有利于TOC的保存，提高了堆肥質量。

TN可以為微生物生長提供氮源。兩個處理TN含量總體呈降低趨勢（圖2b），CD處理TN含量一直下降，但始終高于CK；CK處理TN含量在0-3 d降低較快，3d之后逐漸升高，這與郭夏麗等和劉林培等的研究結果一致。這可能與堆肥前期微生物繁殖需要大量的氮素營養有關，CK處理中微生物可直接利用的有效氮源較CD少，需要消耗營養和能量來分解難降解有機物，從而導致升溫期消耗TN較多。CK處理后期TN含量升高可能有兩方面的原因：一是有機物大量分解產生的“濃縮效應”；二是微生物的生物固氮作用。

CK處理NH+4-N（圖2c）和NO-3-N（圖2d）含量始終高于CD處理。CK處理NH+4-N含量呈現前期快速升高后期迅速降低的趨勢，降溫期NH+4-N含量達到峰值；CK處理NO-3-N含量呈現先降后升的趨勢，高溫期含量最低，腐熟期含量最高，約為CD處理的2倍；CD處理NH+4-N和NO-3-N含量總體呈增加趨勢，但增加的幅度相對較小。以上結果說明菌渣-牛糞聯合堆肥有利于降低NH+4-N和NO-3-N含量。NH3揮發往往受到NH+4-N濃度、pH和溫度的影響。CK處理NH+4-N、NO3-N含量均高于CD，可能導致氮的大量損失。

2.2真菌群落組成及多樣性

本研究共聚類出114個真菌OTUs，其中CD處理91個，CK處理58個，兩個處理共有OTUs為35個，兩處理OTUs隨堆肥進程均呈現先升高后降低的趨勢（圖3a）。用Chaol和Shannon指數來評價真菌群落豐富度和多樣性，CD處理的真菌群落豐富度和多樣性均高于CK處理（圖3b）。真菌群落的多樣性和豐富度越高，越有利于有機成分的轉化。

用PCoA進一步闡明CD和CK處理真菌群落組成的變化（圖3c），PCoA1和PCoA2分別解釋了總變異的34.0％和22.3％。所有樣本被分為兩個集群，兩個處理之間存在分散趨勢，說明不同堆肥處理真菌群落組成差異較大。前人的研究強調了糞肥中的化學和有機成分對土壤細菌群落組成具有重要影響。Banerjee等的研究顯示了營養添加對細菌和真菌的總體微生物生物量和豐度的積極影響。本研究表明，菌渣中的真菌群落主要受牛糞的化學和有機成分的影響。理化性質的結果進一步支持了這一點。牛糞施入后，TOC和TN均出現升高趨勢。CD處理各樣品間距離矩陣比CK處理更小，說明CD處理在堆肥不同階段的真菌群落組成是相似的。

選擇相對豐度前5的真菌門和前10的真菌屬繪制桑基圖（圖4）。發現子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）是堆肥過程中的兩個優勢真菌門。子囊菌門和擔子菌門是有機物降解的主要真菌，能夠參與木質纖維素等惰性碳的分解。擔子菌門在CD處理堆肥的前期相對豐度較高，特別是高溫階段，它可以利用多種碳源，產生特殊的抗逆結構，能在極端的條件下生存（比如高溫）。而子囊菌門是堆肥后期的優勢菌門。

位于前10的真菌屬大多屬于子囊菌門和擔子菌門。子囊菌門中相對豐度最高的屬是食線蟲真菌屬（Duddingtonia），其次是毛霉菌屬（Elaphomyces）、HyaLorbiLia、木霉屬（Trichoderma）和細粒嗜熱菌（Thermomyces）。食線蟲真菌屬是一種腐生真菌，能夠促進有機化合物的降解。鬼傘屬（Coprirzopsis）來自于甲基營養酵母，其產生的漆酶可以降解多種有機化學污染物，如氯酚和多環芳烴類物質，同時其還能促進木質素氧化。細粒嗜熱菌是一種嗜熱的分解纖維素的子囊菌，能夠產生耐熱木聚糖酶，在聚合碳水化合物的降解中起重要作用。從堆肥中分離出的細粒嗜熱菌可分泌超過60種不同的纖維素酶、半纖維素酶和其他糖基水解酶。這類真菌在堆肥中能夠去除游離養分并吸收氨，已被廣泛作為促進堆肥制備和加速蘑菇生長的接種物。木霉屬在兩個處理中均存在，有報道指出木霉對纖維素的分解起著至關重要的作用，它可以通過產生纖維素水解酶促進纖維素的水解。Coprinellus和鬼傘屬是擔子菌門中相對豐度較高的屬，在CD處理高溫期相對豐度顯著高于CK。Elizabet等的研究表明Coprinellus radians能促進二苯并噻吩等大分子物質的轉化。

2.3真菌群落與環境因子之間的關系

環境因素是影響微生物群落動態和物質轉化的主要影響因素。為了解真菌群落和環境變量之間的相關性，使用R軟件進行了Mantel分析，以評估堆肥條件與真菌OTU豐度之間的相關性（圖5）。前人研究發現，堆肥環境因素（如溫度、C/N和pH）會顯著影響真菌群落的組成。本研究結果表明，真菌群落豐度與理化因子間存在相關性，其中溫度、pH、EC、TN和TOC對真菌群落豐度有顯著影響（Plt;0.05）。在兩個處理中，真菌的相對豐度均與TOC、TN顯著正相關，說明菌渣堆肥過程中真菌群落參與碳、氮的轉化，不同堆肥處理真菌的群落組成不同，對碳、氮轉化的影響也不相同。

2.4核心真菌篩選及真菌群落間關系網絡分析

微生物間的相互關系及環境因子均影響微生物群落的結構和功能，進而影響碳、氮的轉化過程。本研究利用網絡分析篩選出參與碳、氮轉化的核心真菌屬（圖6）。網絡中有較多真菌屬與NH+4-N和NO-3-N相關，表明真菌的生長對NH+4-N和NO-3-N的變化更加敏感。這可能是因為NH+4-N和NO-3-N是大多數微生物的有效氮源。CK和CD網絡分別包含15個和13個節點（核心真菌屬）、26條和17條邊，平均度分別為2.375和2.000，網絡密度分別為0.158和0.125，說明CD處理的網絡復雜度比CK低，但平均路徑長度大于CK處理。有報道指出，平均路徑較短的網絡，存在密集連接的節點，并且網絡可以在節點之間快速傳播。這可能使網絡對擾動更加敏感，比如病原菌的傳播，說明添加牛糞使菌渣堆肥的網絡更穩定。碳、氮相關的真菌屬主要由Ascomycota、Basidiomycota和Chytridiomycota組成，分別占比47.2％、16.6％、16.6％。Ascomycota和Basidiomycota既是重要的纖維素降解菌，同時又是重要的反硝化真菌。它們一方面通過分泌多種水解酶將木質纖維素降解為單體后參與碳代謝過程，另一方面其具有很強的N03同化能力，將NO-3中的氮摻入微生物生物質中，從而減少NO-3的浸出或反硝化造成的損失。

在CK網絡中，與TOC相關的核心菌屬共有7個（28.6％正相關）；在CD處理中，與TOC相關的核心菌屬共有2個（50％正相關）。CK網絡中與TOC負相關的核心菌屬較多，且有更多菌屬參與TOC分解，這可能是CK處理TOC損失率較高的一個原因。Elaphomyces和Cyllamyces在兩個網絡中都是TOC的核心菌屬；Cyllamyces在兩個網絡中均為正相關；Elaphomyces在CK網絡中正相關，在CD網絡中負相關，但Elaphomyces在CD處理中相對豐度小于CK處理，這也可能是CD處理碳損失率較低的一個原因。Duddingtonia、Elaphomyces和Trichoderma在CD網絡中是TN核心真菌，并且在網絡中作為hub菌起到樞紐的作用，這進一步說明它們參與堆肥的碳氮循環。研究表明Trichoderma可以通過產生多種酶來降解木質纖維素，同時參與反硝化過程，在厭氧條件下能夠將硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為NO、N2O和N2。在CK網絡中Trichoderma是連接TOC與NO-3-N的hub菌，與TOC顯著負相關，與N03-N正相關。在CD網絡中Trichoderma與TN顯著正相關，通過Elaphomyces與TOC和N03-N相連接。結果說明菌渣一牛糞聯合堆肥改變了真菌屬參與碳、氮轉化的途徑。

利用網絡對CK和CD處理中真菌群落在OTU水平上的共現模式進行分析。2個處理在共現網絡拓撲結構上存在顯著差異（圖7a）。CK和CD處理的共現網絡分別由67個節點、157條邊和75個節點、228條邊組成。與CK相比，CD處理的共現網絡邊、點、平均度、網絡密度都有所提升。已有研究表明，有機物輸入可以增強土壤細菌共現網絡的復雜性，本研究表明牛糞施入后可用養分的增加使真菌的功能發生改變，真菌間的相互作用增強，真菌群落間的關聯性和復雜性增強。網絡中的正相關表示共生關系，負相關表示競爭或捕食關系，聯合堆肥減輕了競爭關系，而加強了物種之間的共生和互惠。CD處理相較于CK處理正相關的比例增加，負相關的比例降低，這可能歸因于真菌群落在較長時期的共同進化過程中的共生作用。這一結論正好驗證了PCoA分析中CD處理樣本間距離矩陣更加緊密的原因。網絡內部各成員間存在明顯的聚集關系，整個網絡被劃分為不同的模塊（Module）。CD和CK網絡均包含10個模塊，在CD處理中，module2、module3與TOC含量顯著正相關（圖7b），其中Elaphomyces（OTU_4）存在于mudule2中，Elaphomyces是TOC的核心菌屬，猜測以Elaphomyces為中心與module2中的其他菌相互作用，共同影響TOC代謝。module3中大多數能注釋到的真菌均與木質纖維素降解有關，如：新麗鞭菌科（Neocallimastigaceae）、盲腸鞭菌屬（Caecomyces）、被孢霉屬（Mortierella）等，并且module3中的新美鞭菌屬（Neocallimastix）、棘孢霉屬（Spizellomyces）、木霉屬（Trichoderma）均為互惠共生微生物。猜測module3主要是由具有降解木質纖維素的功能菌組成，通過功能菌間互惠共生影響有機碳降解。

此外，叢枝菌根真菌對于碳氮循環的影響不容忽視，它對團聚體中的碳形成和穩定起到關鍵作用。研究表明，叢枝菌根分泌的球囊霉素可以通過增強團聚體的穩定性來調節碳匯過程，它既可以保持肥力，又可以加強碳捕獲能力。在CD處理中發現較高豐度的叢枝菌根真菌（OTU_396）。AMF（OTU_396）所在的module2與module4聯系較為緊密，且多為正相關，這兩個模塊既參與碳代謝又參與氮代謝。以上說明聯合堆肥激活了AMF真菌的互作效應，從而驅動更多真菌參與碳氮代謝。

2.5真菌群落和核心真菌對堆肥碳氮轉化的貢獻

結構方程模型用來評估真菌群落、核心真菌對碳、氮循環過程的直接或間接影響，結果見圖8。在兩個處理中，碳氮核心真菌均能顯著影響TN。這可能與碳氮循環彼此相連有關。兩個處理中TN和TOC間顯著的正相關關系也證實了這一點。在CK處理中，Chaol直接顯著影響TN，但在CD處理中并無顯著影響，說明真菌豐富度影響堆肥TN的轉化因條件而異。在CK處理中，module2和module3可直接顯著影響TN，但兩個模塊內的菌屬多與碳循環有關，說明核心真菌屬間存在互作效應。module2中Caecomyces和Orpinomyces均是NO-3-N的核心真菌；module3中的Coprinellus是NH+4-N的核心真菌。可能是通過這些核心菌屬與模塊內部其他菌屬相互作用來影響TN。在CD處理中，TOC核心真菌、N核心真菌與TOC和TN顯著相關，是碳轉化的主要貢獻者。這也可能是CD處理TOC損失率降低的主要原因。

3結論

（1）雙孢菇菌渣堆肥過程中添加牛糞可以提高堆體溫度和初始碳氮含量，降低總有機碳損失率，提高堆肥產品品質。

（2）菌渣堆肥中添加牛糞可以提高真菌多樣性和豐富度，縮小各時期距離矩陣，使真菌群落組成更相似。Ascomycota、Basidiomycota和Chytridiomycota是促進碳氮轉化的主要真菌門，核心菌屬Elaphomyces、Cyllamyces、Duddingtonia、Elaphomyces和Trichoderma對碳、氮轉化起至關重要的作用。添加牛糞后真菌群落共線網絡的復雜性降低，促進真菌群落之間的互惠共生關系。

（3）結構方程模型分析表明總有機碳核心真菌、氮核心真菌及關鍵真菌群落是影響堆肥碳、氮轉化的關鍵因素，真菌群落豐富度對碳、氮轉化的影響因堆肥條件不同而異。