高效液相色譜-串聯質譜法檢測雞組織及雞蛋中新型獸藥氟雷拉納殘留

摘 要：基于高效液相色譜-串聯質譜法建立雞組織（雞肉、雞肝、雞皮和雞腎）及雞蛋中新型獸藥氟雷拉納殘留的檢測方法。將低（0.10 mg/kg）、中（0.25 mg/kg）、高（0.50 mg/kg）劑量氟雷拉納分2 次灌胃（間隔7 d）白羽母雞后獲得陽性動物樣品。樣品經乙腈提取、PRiME HLB固相萃取小柱凈化后，以甲醇和5 mmol/L甲酸銨溶液為流動相，Eclipse Plus C18色譜柱為分離柱進行梯度洗脫，電噴霧負離子模式電離，在多反應監測模式下檢測，繪制基質匹配校準曲線，外標法定量。結果表明：氟雷拉納在0～200 ng/mL質量濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數（R2）＞0.99，方法檢出限為2.0 μg/kg，定量限為5.0 μg/kg；在5、15、50 μg/kg加標水平下，雞組織（雞肉、雞肝、雞皮、雞腎）和雞蛋中氟雷拉納的平均加標回收率為81.2%～99.1%，相對標準偏差為1.29%～7.86%（n=6）。該方法成功應用于陽性動物樣品中氟雷拉納殘留量的檢測。綜上，該方法簡便、快速、靈敏，適用于雞組織及雞蛋中氟雷拉納獸藥殘留的檢測。

關鍵詞：氟雷拉納；高效液相色譜-串聯質譜；獸藥殘留；固相萃取；雞組織及雞蛋

Determination of Residues of the Novel Veterinary Drug Fluralaner in Chicken Tissues and Eggs byHigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LING Yihan1， WANG Xiaomeng1， WU Shouxun1， ZHOU Ting1， LI Xingjie1， ZHOU Heting1，

ZHANG Shuwen1， YIN Wenya1， WANG Jianping2， WANG Yi3，*

（1. West China School of Public Health/West China Fourth Hospital， Sichuan University， Chengdu 610041， China;

2. Animal Nutrition Institute， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China;

3. Sichuan Institute of Food Inspection， Chengdu 611731， China）

Abstract： This study established a methodfpnplvUbgZay6jxBXunjAA== for the determination of fluralaner residues in chicken tissues （meat， liver， skin and kidney） and eggs by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Positive animal samples were obtained from white-feathered laying hens orally administered of low （0.10 mg/kg）， medium （0.25 mg/kg） and high（0.50 mg/kg） doses of fluralaner （in two fractions， 7 d apart）. Samples were extracted with acetonitrile and purified by solid phase extraction on a PRiME HLB column. The target analyte was separated on an Eclipse Plus C18 column with gradient elution using a mobile phase consisting of methanol and 5 mmol/L ammonium formate solution and analyzed using electrospray ionization in the negative ion mode with multiple reaction monitoring （MRM）. A matrix-matched calibration curve was prepared and the external standard method was used for quantification under the optimal conditions. The calibration curve showed good linearity in the concentration range of 0–200 ng/mL with correlation coefficient （r2） greater than 0.99. The limit of detection （LOD） and the limit of quantification （LOQ） were 2.0 and 5.0 μg/kg， respectively. The recoveries of added fluralaner from chicken meat， eggs， liver， skin and kidney were 81.2%–99.1% with relative standard deviations （RSDs） of 1.29%–7.86% at spiked levels of 5， 15 and 50 μg/kg （n = 6）. The method is simple， rapid， sensitive， and has been successfully applied for the determination of fluralaner residues in medicated chicken samples.

Keywords： fluralaner; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; veterinary drug residues; solid phase extraction; chicken tissues and eggs

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240702-165

中圖分類號：TS207.3 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）10-0030-06

引文格式：

凌藝菡， 王瀟萌， 武首薰， 等. 高效液相色譜-串聯質譜法檢測雞組織及雞蛋中新型獸藥氟雷拉納殘留[J]. 肉類研究， 2024， 38（10）： 30-35. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240702-165. http：//www.rlyj.net.cn

LING Yihan， WANG Xiaomeng， WU Shouxun， et al. Determination of residues of the novel veterinary drug fluralaner in chicken tissues and eggs by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2024， 38（10）： 30-35. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240702-165.   http：//www.rlyj.net.cn

據聯合國糧食及農業組織統計，2020年我國成為全球第一大雞蛋生產國和全球第二大雞肉生產國[1]。作為家禽養殖業中危害最嚴重的外寄生蟲之一，雞皮刺螨（Dermanyssus gallinae）又稱家禽紅螨，給禽養殖業帶來巨大威脅[2-4]。調查顯示，我國家禽雞皮刺螨感染率達57.1%，且仍呈現上升趨勢，給我國雞肉和雞蛋生產造成巨大的經濟損失[5-7]。目前，為控制病蟲害、提高食用動物產品質量[8]，獸藥被廣泛應用，由此也帶來了獸藥過度使用和濫用等安全問題[9-10]。

氟雷拉納是一種新型的異噁唑啉類除螨劑，能夠有效防治雞皮刺螨病，主要通過抑制γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和L-谷氨酸（L-glutamic acid，Glu）門控氯離子通道發揮作用，氯離子通道關閉后，蟲體細胞過度興奮，最終癱瘓甚至死亡[11-13]。其商品化試劑Exzolt?已經被歐盟批準用于治療雞的雞皮刺螨病[14-15]，由于其相對安全，在國外已被廣泛應用[16]。氟雷拉納在動物體內由肝臟代謝，具有清除率低、易蓄積、殘留量高等缺點，長期超劑量使用可能導致哺乳動物出現神經失調[17]。因此，為規范氟雷拉納的使用，降低殘留藥物對人體的潛在風險，歐盟、澳大利亞農獸藥管理局、我國臺灣省衛生福利部和巴西國家衛生監督局等陸續增訂了其在各類動物組織中的最大殘留限量要求[18]，我國農業農村部于2023年也發布了試行版最大殘留限量標準[19]。部分國家或地區氟雷拉納最大殘留限量見表1。

目前關于氟雷拉納的研究多集中于其作用機制、代謝動力學評價及毒理學等方面[20-22]，鮮少有對其檢測方法的研究。檢測方法的缺乏不僅增加了食品安全監管部門對違規使用獸藥的監管難度，也使我國在動物源性食品的進出口貿易中處于不利地位。因此有必要建立雞組織和雞蛋中氟雷拉納殘留的檢測方法，對保障動物源性食品安全具有重要意義。高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法兼具色譜技術的高效分離與質譜技術的良好定性優勢，是迄今獸藥殘留分析領域較準確、高效的定性、定量方法，也是大多數實驗室獸藥殘留檢測的常用方法[23-24]；固相萃取法凈化樣品可獲得更低的檢出限，滿足低含量獸藥殘留檢測要求[25]。綜上，本研究擬基于固相萃取-HPLC-MS/MS法建立一種雞組織及雞蛋中的氟雷拉納新型獸藥殘留定性及定量檢測方法，以期為此類獸藥檢測方法研究及標準的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白羽母雞 眉山溫氏畜牧有限公司。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 成都市諾爾施科技責任有限公司；甲酸銨、乙酸銨（均為色譜純） 美國Thermo Fisher Scientific公司；乙酸乙酯、正己烷（均為分析純） 成都市科隆化學品有限公司；貝衛多（0.112 5 g氟雷拉納/片） 默沙東動物保健品（上海）有限公司；100 μg/mL氟雷拉納標準儲備液（純度＞99.4%，CAS：864731-61-3） 天津阿爾塔科技有限公司；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

PRiME HLB固相萃取柱（150 mg/3 mL）、HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）、C18固相萃取柱（500 mg/3 mL） 沃特世科技（上海）有限公司；6460三重四極桿串聯質譜儀（配有電噴霧電離（electronspray ionization，ESI）源）、1200高效液相色譜儀、ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，3.5 μm） 美國Agilent公司；Milli-Q Academic超純水儀 美國Millipore公司；H2050R高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；TurboVap LV氮吹濃縮儀 瑞典Biotage公司；XS105DU電子天平 梅特勒-托利多科技（中國）有限公司；Reax Top渦旋振蕩器 德國Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物喂養

選取180 d左右日齡、體質量（2.0±0.2）kg、未使用任何獸藥的健康白羽母雞12 只。空白組（3 只）給予生理鹽水，實驗組（9 只，每組3 只）以溶液方式灌胃氟雷拉納獸藥貝衛多，分別按照低（0.10 mg/kg）、中（0.25 mg/kg）、高（0.50 mg/kg）劑量給藥，其中高劑量組為推薦治療劑量組。采用不含任何抗生素的基礎日糧預飼3 d后進入實驗期，實驗期共計7 d，首次給藥后間隔7 d，再次以溶液方式灌胃相同劑量。實驗期自由飲水，均飼喂不含抗生素的基礎日糧。所有動物程序均按照SICAU 2021-042《四川農業大學實驗動物護理和使用指南》進行。所有動物在末次給藥1 d后屠宰，采集雞肉、雞皮、雞肝、雞腎，－20 ℃保存。在此期間收集所有雞蛋，4 ℃保存。

1.3.2 樣品前處理

稱取（2.0±0.02）g樣品，置于50 mL具塞離心管（聚丙烯）中，加入10 mL乙腈，于渦旋振蕩器中渦旋1 min，超聲15 min，10 000 r/min離心5 min，重復上述操作1 次，合并2 次上清液，混勻后取5 mL過PRiME HLB固相萃取柱（150 mg/3 mL），準確量取4 mL流出液，40 ℃氮吹近干，加1 mL初始流動相（5 mmol/L甲酸銨溶液與甲醇體積比2∶8）復溶，過0.22 μm有機濾膜，供檢測使用。

1.3.3 標準溶液配制

移取適量標準儲備液，用乙腈稀釋后配制成500 ng/mL氟雷拉納標準中間液；經1.3.1節樣品前處理制備空白基質溶液，用空白基質溶液逐級稀釋標準中間液，配制成質量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的基質匹配標準工作液。所有溶液現配現用。

1.3.4 檢測條件

HPLC條件：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，3.5 μm）；柱溫30 ℃；進樣體積2 μL；流速0.5 mL/min；流動相A：5 mmol/L甲酸銨溶液，B：甲醇。梯度洗脫程序：0～2 min，20% A；2～6 min，20%～5% A；6～6.1 min，5%～0% A；6.1～10 min，0% A；10～10.1 min，0%～20% A；10.1～12 min，20% A。

MS條件：ESI負離子（ESI－）模式；多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；毛細管電壓3 500 V；干燥氣：氮氣（純度＞99.5%）；霧化氣壓力310.275 kPa；干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速6 L/min，鞘氣溫度300 ℃，鞘氣流速11 L/min。其他MS參數見表2。

1.3.5 樣品中氟雷拉納殘留量計算

樣品中氟雷拉納殘留量按式（1）計算：

（1）

式中：ρ為由標準曲線得到的被測組分質量濃度/（ng/mL）；V為樣品處理后定容體積/mL；m為樣品質量/g；f為稀釋倍數。

1.3.6 基質效應（matrix effect，ME）計算

ME按式（2）計算：

（2）

式中：SMM為基質匹配校準曲線斜率；SRO為溶劑曲線斜率。

1.4 數據處理

在Angileng MassHunt2e1DJIvyAPY6jnljENV1aw==er LC-MS Acquisition工作站進行數據采集和分析，采用Excel 2021進行結果分析，采用Origin 2022繪圖。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

取200 ng/mL氟雷拉納標準溶液，以自動進樣方式在ESI＋、ESI－模式下進行MS全掃描，結果表明，氟雷拉納在ESI－模式下具有較好且穩定的電離效果，準分子離子（[M－H]－）m/z 554，[M－H]－母離子再通過二級質譜掃描得到不同的碎片離子，主要碎片離子為m/z 534、424。對氟雷拉納可能裂解路徑進行解析，結果如圖1所示。準分子離子[M－H]－丟失碎片HF后得到m/z 534的碎片離子，丟失碎片CH4F6后得到m/z 424的碎片離子。選擇相應信號最高的碎片離子m/z 534為定量離子，相應信號次高的碎片離子m/z 424為定性離子。在MRM負離子模式下優化毛細管電壓、霧化氣壓力、干燥氣溫度、干燥氣流速、鞘氣溫度、鞘氣流速等各MS參數，得到較佳MS條件（表2）。

2.2 色譜條件優化

探究不同流動相體系對氟雷拉納峰形和響應信號的影響，分別以甲醇和乙腈作為有機相，進樣氟雷拉納標準品（200 ng/mL）。結果表明，有機相為甲醇時的待測物響應信號明顯高于乙腈，且峰形更好，因此將甲醇作為流動相中的有機相。由于氟雷拉納MS檢測采用負離子模式，在流動相水相中加入少量酸、堿、鹽類可以增強化合物離子化效率，改善待測物峰形，提高檢測靈敏度[26-27]。因此，分別采用0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L甲酸銨溶液和5 mmol/L氨水溶液進行洗脫，考察水相對氟雷拉納峰形和響應信號的影響。結果表明，0.1%甲酸水溶液對待測物的峰形并無明顯改善作用；5 mmol/L氨水溶液導致待測物色譜峰出現拖尾且響應信號降低；5 mmol/L甲酸銨溶液則能明顯提高待測化合物的響應信號，色譜峰峰形尖銳、對稱。因此，本研究確定最終流動相體系以甲醇為有機相，以5 mmol/L甲酸銨溶液為水相，在此條件下獲得氟雷拉納標準品的MRM圖（圖2）。

2.3 提取和凈化條件優化

根據氟雷拉納的溶解性，結合獸藥殘留檢測前處理中常用于沉淀蛋白的提取溶劑，選擇甲醇、乙腈、乙酸乙酯、80%乙腈溶液4 種溶劑對空白雞肉和雞蛋樣品加標后的提取效果進行考察。由圖3可知，乙腈提取效果明顯優于其他3 種提取溶劑，且乙腈能夠使蛋白質快速變性，從而減少蛋白質干擾[28]，因此本研究選擇乙腈為提取溶劑。

雞蛋和雞肉等動物源樣品含有大量脂肪、蛋白質、不飽和脂肪酸等，基質復雜，選擇合適的凈化措施可減少基質對背景的干擾、提高檢測準確性、延長儀器使用壽命[29]。本研究比較HLB（60 mg/3 mL）、C18（500 mg/3 mL）和PRiME HLB（150 mg/3 mL）3 種固相萃取小柱對回收率的影響。結果表明，當雞蛋和雞肉基質出現乳化現象時，較難通過HLB和C18固相萃取小柱凈化，且回收率小于60%，凈化效果較差；而使用PRiME HLB固相萃取小柱凈化時，凈化過程迅速，回收率可達91%。因此，本研究選擇PRiME HLB固相萃取小柱進行凈化。

2.4 ME分析

由于動物源性食品基質較為復雜，凈化不完全會影響待測化合物在離子源中的電離，出現基質增強或抑制效應[30]。ME＞0%，則為基質增強效應，ME＜0%，則為基質抑制效應；ME的絕對值越大，基質干擾越強，0%＜|ME|≤20%表明ME較小，可忽略不計；20%＜|ME|≤50%表明存在中等強度ME，|ME|＞50%表明存在強ME[31]。由圖4可知，除雞蛋外，其余4 種雞組織樣品均存在中等強度的基質增強效應。與其他樣品相比，雞蛋蛋白含量更高、酶活性物質更豐富，即使在前處理中盡量減少可能和預期的干擾，仍可能產生基質抑制效應[32]。為克服樣品ME對定量結果的影響，本方法采用基質匹配校準曲線進行定量分析。

2.5 方法線性范圍、檢出限與定量限

以基質匹配標準工作液中的氟雷拉納質量濃度為橫坐標，相應峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。由表3可知，在5 種基質中，氟雷拉納在0～200 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數（R2）為0.997～0.999。在空白基質中添加一定質量濃度的氟雷拉納標準工作液，經提取凈化后上機測定離子對信號與基線噪音信號比值，以信噪比（RSN）＞3對應的最低含量為檢出限（limit of detection，LOD），RSN＞10對應的最低含量為定量限（limit of quantification，LOQ），得到氟雷拉納在5 種基質中的LOD為2.0 μg/kg，LOQ為5.0 μg/kg。

2.6 回收率和精密度

本研究對5 種空白基質進行5、15、50 μg/kg 3 水平加標回收實驗，每個水平設置6 個平行樣，計算加標回收率，精密度以相對標準偏差表示。如表3所示，3 個加標水平下的平均加標回收率為81.2%～99.1%，相對標準偏差為1.29%～7.86%，符合GB/T 27417—2017《化學分析方法確認和驗證指南》要求。

2.7 實際樣品檢測

采用本方法對氟雷拉納獸藥貝衛多干預后的陽性動物樣品進行氟雷拉納藥物殘留檢測，以驗證該方法在實際樣品中的適用性。不同時間、不同組別雞蛋殘留量最小為（7.66±0.63）μg/kg，最大為（512.50±5.44）μg/kg，小于歐盟的最大殘留限量規定。由表4可知，雞皮中氟雷拉納殘留量最高，當給藥egf0skdZ0ecBMlKYA9bCgTLLgFCnVkZcN9xgx66Q3q0=劑量為0.50 mg/kg時，殘留量超過相關規定；雞肝和雞腎中殘留量基本一致；雞肉中的殘留量最低，當給藥劑量為0.25 mg/kg時，殘留量超過相關規定。該藥的使用應嚴格按照《獸藥產品委員會關于Exzolt的評估報告》[33]中休藥期規定，雞肉和雞腎的休藥期為14 d，雞蛋無休藥期。

3 結 論

本研究以乙腈為提取劑，樣品經PRiME HLB固相萃取小柱凈化，采用HPLC-MS/MS檢測雞組織及雞蛋中氟雷拉納殘留，方法前處理簡單、快速、穩定，線性范圍、靈敏度、回收率和重復性均滿足方法學要求，可為實驗室測定氟雷拉納殘留提供方法參考，為我國制定氟雷拉納最大殘留限量提供技術支撐。

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收稿日期：2024-07-02

基金項目：四川省市場監督管理局科技計劃項目（SCSJ2021017）

第一作者簡介：凌藝菡（1999—）（ORCID： 0009-0000-5070-2762），女，碩士研究生，研究方向為營養與食品衛生。E-mail： tparks@163.com

*通信作者簡介：王毅（1984—）（ORCID： 0000-0002-1438-0345），男，高級工程師，博士，研究方向為食品安全。E-mail： wangyichem@163.com