乳果糖酶法制備工藝研究進展

乳果糖是由半乳糖和果糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成的二糖，化學式為C12H22O11，是乳糖的異構化產物。市售乳果糖多為微黃色透明糖漿，具有甜味（蔗糖的60%-80%）、水溶性。此外，與乳糖相比，乳果糖具有更高的甜味和醇溶性，并且在酸熱條件下具有高穩定性，這一特點可使其用作酸性食品的益生元補充劑。乳果糖天然存在，可在加熱牛乳過程中產生，但含量甚微。服用后，可不被胃酸消化分解直達小腸，經腸道微生物發酵產生短鏈脂肪酸（主要為乙酸、丙酸、丁酸），降低腸道微生態PH，改善腸道微生態，促進益生菌生長，抑制有害菌，并且具有潤腸通便等功效。在醫學上，乳果糖經常被用來肝性腦病、便秘和腹瀉等疾病的治療，且安全性高，無任何負面作用。

乳果糖的制備方法主要有三類：化學異構法、電活化技術、酶法。化學異構法具有轉化率高、操作簡便等特點，是目前唯一工業化的乳果糖制備方法。其原理為乳糖在強堿性條件下發生Lobry-de Bruyn-van Ekenstein反應，使其結構中的葡萄糖基團異構成為果糖基團。硼酸是該法中最常用且轉化率最高的催化劑，但硼酸的大量添加也使得后續精制過程的難度急劇增加，這是限制乳果糖制備規模增加的一個重要原因。電活化技術是一種新興的乳果糖制備技術，具有安全、環保、清潔、綠色等特點。該反應在施加電場的反應器中進行，施加電場后，陰極一端將產生適于乳果糖異構的強堿性條件，且無需加入催化劑，降低了后續脫鹽和純化工序的難度，但仍存在于轉化率較低的問題。酶法合成乳果糖一般條件溫和，被認為是一種可克服化學法合成局限性和問題的友好替代方法，糖苷水解酶和纖維二糖差向異構酶是兩種被報道可用于制備乳果糖的兩種酶。本文綜合目前已有報道，對乳果糖酶法合成工藝研究進展做出綜述。

1.β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）可催化乳糖水解為半乳糖和果糖，該酶在催化乳糖水解的過程中還伴隨著轉苷反應，生成乳果糖。β-半乳糖苷酶法是第一個被發現可用于制備乳果糖的生物酶，存在多種來源，包括嗜熱古細菌、礦硫化葉菌、黑曲霉、克魯維酵母等。其合成機理可具體解釋為β-半乳糖苷酶利用乳糖和D-果糖為底物，通過轉苷反應，解離出1分子D-葡萄糖后的半乳糖基團再通過縮合1分子D-果糖而形成乳果糖，最終產物包括乳果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖等。20世紀70年代末，Vaheri和Kaupinnen使用脆壁酵母（Saccharomyces fragilis）來源的β-半乳糖苷酶催化乳糖的轉苷反應，乳果糖的產量僅為7.8g/L，得率約為3%。2009年，有研究顯示，米曲霉來源的β-半乳糖苷酶具有較高的轉苷活性，制備的乳果糖含量約為65g/L，但該法由于轉化率低和后續純化難度大等原因而無法大規模應用。

2.β-葡糖苷酶

20世紀末，有研究發現來源于強烈熾熱球菌（Pyrococcus furiosus）的β-葡糖苷酶具有與β-半乳糖苷酶類似的轉苷活性，可催化轉苷反應用于制備乳果糖。在隨后的研究中，研究人員又將乳果糖的產量提升到了15.0g/L。由此可見，β-葡糖苷酶雖具有轉苷特性，但其活性較低，轉化率同樣較低。因此，β-葡糖苷酶并未引起業界的廣泛關注。

3.纖維二糖差向異構酶

纖維二糖差向異構酶在厭氧瘤胃細菌白色瘤胃細菌（Ruminococcus albus）的培養液中被首次發現，隨研究的深入，多種來源的纖維二糖差向異構酶被發現，包括溶纖維真細菌（Eubacterium cellulosolvens）、脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）等。纖維二糖差向異構酶具有差向異構作用，可以β-1，4-糖苷鍵連接的纖維二糖、乳糖、D-葡萄糖等為催化底物，并作用于該類低聚糖的還原末端，生成差向異構體，同時又能將醛糖異構化為酮糖。研究報道，纖維二糖差向異構酶可以乳糖為唯一底物制備乳果糖，在適當條件下可將乳果糖轉化率提升至58%，乳果糖濃度高達406g/L，并且該體系中添加硼酸可將乳果糖轉化率進一步提升至88%，此時反應體系中乳果糖濃度為616g/L。由此可見，纖維二糖差向異構酶是目前已有報道中最為高效合成乳果糖的酶，其轉化率可與化學方法相當。與此同時，纖維二糖差向異構酶還具有安全性高、無須添加多余底物、產物精制較為便捷等特點。因此，該酶具有工業化應用潛力。但纖維二糖差向異構酶同樣具有弊端，即當溫度升高至80℃時，該酶表現出熱穩定性差等特點，這一弊端也局限了其大規模應用。

此外，使用纖維二糖差向異構酶還可能會導致副產物依匹乳糖含量過高的問題，而各國藥典和法律法規等則對其含量做出嚴格限制。因此，通過蛋白質工程對纖維二糖差向異構酶進行改造以降低依匹乳糖產量是一可行思路，也愈加吸引各國學者的目光。Shen等使用定向進化并對突變體進行篩選后得到了不產生依匹乳糖的五位突變體。Park等首先分析了纖維二糖差向異構酶酶活性中心與甘露糖基團C-2的相互作用原理，隨后選擇兩個關鍵的殘基位點進行飽和突變，得到新的突變體，使用該突變體制備乳果糖可得到43.5%的轉化率。Shen等則對纖維二糖差向異構酶的熱穩定性進行了研究，結果顯示，雙位點突變可使酶在高溫下的活性半衰期提高4倍，最適反應溫度提高7.5℃，底物催化效率提升29%。目前，相關研究尚不完善，但蛋白質工程極具潛力，是一個較好的突破方向。

4.酶固定化技術

酶的催化過程具有高效和專一等特點，但部分酶離開特定環境往往產生穩定性差和不可重復利用等不利于生產的現象。因此，酶固定化技術愈加吸引人們的關注。酶固定化技術起源于20世紀初。1916年，Nelson等發現蔗糖酶可吸附在氧化鋁和焦炭上，并且仍然可以發揮催化作用。1969年，日本田邊制藥公司將米曲霉源氨基酰化酶固定化，并且在L-蛋氨酸生產中得到成功應用。這也是世界首例工業化應用的固定化酶。1971年，國際酶工程第一屆會議提出固定化酶概念，即經過物理或化學方法處理，使得酶限定在某些固定的區域，保持其催化活性，并且可重復利用的酶。

固定化酶在穩定性（pH穩定性、溫度穩定性）、重復利用性、產物后續處理以及經濟性方面具有無可比擬的優越性。目前，酶的固定化技術由傳統的吸附法、共價結合法、包埋法、交聯法等向新型載體固定化技術（輻射處理固定法、光化學固定法、等離子體固定法和電化學聚合固定法）、無載體固定化酶技術（交聯溶解酶（CLDEs）、交聯酶晶體（CLECs）、交聯酶聚集體（CLEAs）和交聯噴霧干燥酶（CLSDs）以及定向固定化技術方向發展，而固定化酶載體隨著固定化技術研究的深入由傳統的物理吸附載體、共價連接載體、截留載體以及膠囊包埋載體等向磁性載體、納米材料載體、環境敏感性載體以及導電載體等新型載體材料方向發展。Wang等將纖維二糖差向異構酶固定于Duolite A568樹脂上，經吸附和交聯等完成固定，性能表征結果顯示，該固定化酶在50℃條件下，其活力可維持12h不受損失；在70℃條件下，反應15批次仍然可以保留90%酶活。可見，該固定化酶具有一定的應用價值。此外，還可采用固定化細胞技術。Gu等使用枯草芽孢桿菌作為固定化載體，負載量1.47mg/1011個芽孢，負載率為79.4%，并使用該固定化酶進行乳果糖的制備，產量可達395g/L，轉化率達到56.4%，生產強度98.75g/（L·h），反復使用8 批次后可保留70%酶活。

結語

乳果糖具有多種優異的生理功能特性，已經在臨床醫藥行業、食品行業和動物飼料行業等領域得到了廣泛應用。目前，乳果糖的年世界產量超過60000t，荷蘭蘇威公司和日本森永乳業公司是兩大乳果糖生產企業。自乳果糖問世以來，乳果糖在人們日常生活中的應用越來越廣泛，這也對乳果糖的制備技術提出更高要求，各國學者和企業也在不斷推陳出新，旨在建立更安全、更環保、更高效、更節能的乳果糖制備技術體系。

目前，對乳果糖制備生產的研究主要集中于生產工藝、純化精制、功能研究以及高酶活性微生物篩選等方面。在工藝上，目前的關注點主要集中在提高酶的使用壽命和穩定性以及后續精制純化過程。對于提高酶的使用壽命和穩定性方面，固定化酶技術是一個主要的發展趨勢。在精制純化方面，目前的生產工藝往往導致產品中副產物或底物等含量過高，包括蔗糖、葡萄糖、乳糖和依匹乳糖等。這些物質在理化性質等方面和乳果糖存在一定的相似性，因此也導致了分離純化過程的難度和成本增加，極大地限制了乳果糖產業化和工業化的發展。色譜分離技術是當前主要的分離純化技術，在進行色譜分離純化前，首先應考慮除去多量的乳糖，否則將產生乳糖結晶析出堵塞色譜柱的問題。因此，業界人員也將目光投向了結晶乳果糖上。而結晶乳果糖制備難度較大，成本高等特點也成為了一個制約因素。在產酶微生物篩選方面，酶活力高、穩定性高、產率高是微生物篩選上的目標。科研人員不僅對微生物來源方面進行研究，同時還進行了對現有菌株的誘變篩選以及基因工程菌株的構建等方面的研究。

綜上，乳果糖的酶法制備還存在諸多技術難題與制約因素。酶法轉化作為一種可克服化學合成局限性和問題的友好替代方法，在我國存在極大的應用空間和市場潛力，但與此同時，乳果糖生產制備領域需要解決的問題和填補的空白還有很多，仍需廣大科研人員持續關注和深入研究。