煙草香氣相關基因CRISPR/Cas9編輯突變體庫的構建

摘要： 為探究CRISPR/Cas9基因編輯技術構建煙草突變體庫的可行性，該研究以烤煙品種‘紅花大金元’為實驗材料篩選了100個可能參與煙草香氣代謝的基因，設計相應的100個sgRNA并構建了由100個CRISPR/Cas9編輯載體組成的質粒庫，獲得轉基因材料后分析了載體的共轉化率、靶向編輯率和脫靶編輯情況。結果表明：（1）通過農桿菌介導100個sgRNA的共轉化后，在172個陽性轉化株中檢測到了其中的77個sgRNA，共轉化率為77%。（2）在77個攜帶sgRNA的轉基因后代中，69個sgRNA對目標基因進行了靶向編輯，編輯率為89.6%。（3）脫靶位點測序檢測發現，只有1個sgRNA在非目標靶位點產生了脫靶編輯，表明CRISPR/Cas9基因編輯技術在煙草中的脫靶概率非常低。綜上所述，利用CRISPR/Cas9載體庫共轉化對煙草基因進行高通量靶向編輯以構建突變體庫的方法切實可行，并且該方法有共轉化率高、編輯率高和脫靶編輯概率低等特點。

關鍵詞： 煙草， CRISPR/Cas9， 煙草香氣， 靶向編輯， 脫靶編輯

中圖分類號： Q943文獻標識碼： A文章編號： 1000-3142（2024）07-1278-11

Construction of a mutant library associated witharoma genes in tobacco using CRISPR/Cas9

ZENG Wanli1， LIANG Gang2， GAO Qian1， LI Yuanchuan3， XU Li1，JIANG Jiarui1， XU Yong1， XIANG Haiying1*

（ 1. Yunnan Key Laboratory of Tobacco Chemistry， R & D Center of China Tobacco Yunnan Industrial Co.， Ltd.， Kunming 650231， China;2. CAS Key Laboratory of Tropical Plant Resources and Sustainable Use， Xishuangbanna Tropical Botanical Garden， Chinese Academyof Sciences， Kunming 650223， China; 3. Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China ）

Abstract： To explore the feasibility of constructing a tobacco mutant library using the CRISPR/Cas9 gene editing technology， we designed sgRNAs of 100 aroma related genes in tobacco， constructed a plasmid library composed of 100 corresponding CRISPR/Cas9 editing vectors， and analyzed the co-transformation rate， on-target editing rate， and off-target editing of transgenic offspring using the tobacco variety ‘Honghua Dajinyuan’ as experimental material in this study. The results were as follows： （1） After co-transformation of 100 sgRNAs mediated by Agrobacterium tumefaciens， 77 of them were detected in 172 positive transformation strains， with a co-transformation rate of 77%. （2） Among 77 transgenic offspring carrying sgRNA， 69 sgRNAs edited the target genes， with an editing rate of 89.6%. （3） Sequencing detection revealed that only one sgRNA produced off-target editing at a non-target site， indicating a very low probability of off-target editing of CRISPR/Cas9 in tobacco. In summary， it is feasible to construct a mutant library by the co-transformation of a CRISPR/Cas9 vector library to edit a large number of candidate target genes in tobacco. This method has the characteristics of high co-transformation rate， high editing rate， and low probability of off-target editing.

Key words： tobacco， CRISPR/Cas9， tabacco aroma， on-target editing， off-target editing

CRISPR/Cas9基因編輯是一種在基因組水平上對DNA序列進行定點改造的遺傳操作技術。CRISPR基因編輯系統由Cas9核酸酶和引導RNA（single guide RNA，sgRNA）組成。sgRNA的一段（～20 bp）與靶基因互補的DNA序列可以特異性地識別靶DNA，而Cas9核酸酶對靶DNA進行切割，造成雙鏈靶DNA 的斷裂，誘發內源性DNA的非同源末端修復機制（Jinek et al.， 2012）。DNA修復過程會引起DNA核苷酸的缺失或增加等錯配，導致基因移碼突變，實現基因敲除。CRISPR/Cas9基因編輯系統也可以對目的基因進行特定修飾（如點突變和基因插入）。例如，在CRISPR基因敲除構建策略的基礎上，添加計劃插入修飾的DNA片段即可對特定基因插入和替換遺傳修飾。

CRISPR/Cas9基因編輯系統因其低成本、構建簡單和高效等優點，已經在人類、動物和植物等生物體中被廣泛利用，目前已成為基因功能研究和基因定向修飾的一個有效工具（Knott & Doudna 2018; Chen et al.， 2019）。在植物中的應用表明，CRISPR/Cas9系統不僅可高效誘導產生DNA突變，而且誘導的突變可穩定遺傳。該技術可以在基因組水平上對DNA序列進行定點改造以創制優異種質資源。例如：Li等（2023）利用CRISPR/Cas9基因編輯技術將普通煙草中N’基因的抗性核心區域精準替換為野生煙中N’alata基因的對應區域，使得栽培煙草獲得了TMV-U1抗性；Qin等（2021）利用CRISPR技術對NIC基因進行編輯產生了尼古丁含量極低的煙草新種質；CRISPR/Cas9基因編輯技術還可用于水稻和番茄等作物的快速馴化（Lemmon et al.， 2018; Li et al.， 2018; Yu et al.， 2021），為加快新品種的創制奠定了基礎。CRISPR/Cas9基因編輯技術在煙草中的成功應用（Schachtsiek & Stehle， 2019; Zhang et al.， 2023），預示著該技術在未來煙草育種中蘊藏著巨大的潛力。

煙草香味是煙葉及卷煙感官質量的重要指標之一。煙草的香氣前體物主要有質體色素、西柏烷和賴百當類菇醇、酚類化合物、氨基酸和還原糖、脂類、生物堿六大類（汪耀富等，2006）。因其內在香氣前體合成相關基因的表達不同，不同煙草品種的香氣前體種類及含量不同（呂婧等，2014），換言之，煙草香氣前體種類和含量很大程度上由煙草本身的遺傳因素決定。隨著煙草基因組測序的完成，次生代謝產物相關合成酶的基因注釋也日趨完善。因此，從基因層面挖掘控制煙草香氣前體物的關鍵基因，通過遺傳操作改變相關基因的表達水平可以實現定向培育特定香味的煙草品種。利用CRISPR-Cas9對煙葉香味基因進行高通量靶向突變，將為優異性狀新種質的創建、重要功能基因的批量挖掘以及煙草分子設計育種奠定基礎。

傳統煙草育種工作主要靠多親本多組合，也就是將不同優良性狀的煙草種質資源進行遺傳整合，構建優質煙草新品種。但是，這種傳統的雜交育種方式不僅耗費大量人力及財力，而且要耗費多年時間。一些優異性狀因聯鎖累贅而無法整合在同一品種里，也在一定程度上限制了優異品種的創制。CRISPR/Cas9基因編輯技術不僅可以不依賴于遺傳雜交對緊密連鎖的基因進行同時編輯，還可以突破傳統雜交育種無法將連鎖優異位點進行整合的限制，因此利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術有望加速煙草香味品質改良。

盡管基因編輯技術已被應用于構建水稻、玉米等突變體庫，但尚未應用于煙草基因突變體庫的構建。本研究以煙草栽培品種‘紅花大金元’為材料，對其100個可能與煙草香味品質相關的功能基因進行靶向設計，構建CRISPR/Cas9載體庫并進行共轉化，獲得了煙草香味品質相關的基因編輯突變體庫?；虬邢蚝兔摪蟹治霰砻?，利用CRISPR-Cas9技術構建煙草突變庫是切實可行的。本研究旨在驗證煙草高通量基因編輯技術的可行性，為煙草基因功能研究和新種質創制提供新方法和新思路。

1材料與方法

1.1 實驗材料

本文以烤煙品種‘紅花大金元’為實驗材料。

1.2 靶位點序列設計

香味相關候選基因的注釋參考煙草基因組數據庫NCBI Nicotiana tabacum Annotation Release 100（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_euk/Nicotiana_tabacum/100/）。利用在線工具CRISPR-GE（http：//skl.scau.edu.cn/; Xie et al.， 2017）設計目標基因的特異靶位點，從候選靶位點中選擇位于基因編碼區前端的靶點。依據靶位點設計和克隆原則設計引物，正向引物為5′-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTT-3′，反向引物為5′-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATC-3′。其中，正向引物的20個N是靶位點序列，反向引物的20個N是靶位點序列的反向互補序列，引物退火后的黏性末端恰好與載體Bsa I線性化后的載體形成堿基互補配對。

1.3 CRISPR/Cas9 載體構建方法

以克隆一個基因的CRISPR/Cas9 載體為例：（1）按照上述的引物設計原則，合成相應的正向引物和反向引物；（2）將正向引物和反向引物進行退火反應，形成雙鏈DNA ［退火反應體系：5×Annealing Buffer for DNA Oligos 4 μL，上下游引物各4 μL（50 μmol·μL-1），Nuclease-free water 補至20 μL。反應程序： 95 ℃ 5 min，每8 s 下降0.1 ℃，直至25 ℃（約90 min），4 ℃保存］；（3）將退火反應得到的產物連接到經Bsa I 酶切的CRISPR/Cas9載體pORE-Cas9/ gRNA上 ［連接體系：退火產物2 μL，酶切產物3 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，T4 DNA Ligase（400 U·μL-1）1 μL，無菌水補至20 μL］；（4）連接產物轉化DH5α受態細胞，利用菌落PCR篩選陽性克?。ㄉ嫌我餅閁6-F：5′-GATCTCCCAGTCACGACGTT-3′，下游引物為目的基因上靶位點的反向互補序列）；（5）擴繁陽性菌斑，提取質粒，進行測序驗證。

1.4 遺傳轉化

將100個質粒的濃度均調整為l00 ng·μL-1，每個取1 μL，混勻，然后轉化農桿菌GV1301，涂布在含有卡那霉素和慶大霉素的YEB培養基上，黑暗條件下28 ℃培養3 d。用液體YEB培養基洗脫全部菌落，-80 ℃凍存，作為后期轉化煙草的CRISPR-Cas9編輯菌種。煙草種子播種于育苗培養皿中育苗，待長到4片葉子（約30 d），便可將其移入培養瓶中，于26 ℃、16 h 光/8 h暗條件繼續培養30 d，備用。 在超凈工作臺中，用打孔器將葉片打成直徑5 mm大小的圓形葉盤。用40 mL MS液體培養基將YEB培養基活化的CRISPR-Cas9編輯菌種懸浮成菌液（OD600： 0.6～0.8）置于50 mL離心管內。將葉盤轉移到盛有菌液的 50 mL離心管內，浸泡侵染10 min，再平鋪于MS固體培養基上，28 ℃，黑暗， 共培養3 d。之后將葉盤下表面接觸培養基，放置于含NAA（0.02 μg·mL-1）、6-BA（0.5 μg·mL-1）、羧芐青霉素（500 μg·mL-1）、卡那霉素（100 μg·mL-1）的MS培養基上，在（28 ℃，光照16 h）/（25 ℃，黑暗8 h）條件下培養，至長出分化芽（約2個月后），切下分化芽（1～2 cm）插入含有羧芐青霉素和卡那霉素的MS培養基上進行生根培養，分化芽約10 d后出根。

1.5 編輯素材的鑒定

為每個煙草單株編號，每個單株取少許葉片提取DNA。用公共引物 （正向：5′- CTTCAAAAGT

CCCACATCGCTTAG-3′； 反向： 5′-TGCAGGACTAG

TGGATCAGC-3′）進行PCR，并用正向引物對產物進行測序。通過序列比對，提取相應單株的靶位點序列。根據靶點序列匹配相應的靶基因，并在靶位點兩側設計靶基因的特異性引物，進行PCR擴增，對PCR產物測序。通過序列比對分析相應單株的靶位點是否被編輯。

2結果與分析

2.1 靶位點設計

根據煙草基因組的功能注釋以及文獻調研，本研究選擇了100個可能參與煙草香氣前體物質合成相關的基因（圖1），它們編碼的蛋白參與次生代謝產物合成，離子吸收轉運和信號轉導等生物學過程。CRISPR/Cas9編輯技術可用來對特定基因進行編輯以創制功能缺失突變體。CRISPR/Cas9編輯系統由Cas9蛋白和sgRNA組成，其中Cas9負責剪切DNA，而sgRNA前端20個堿基通過堿基互補配對的方式識別靶位點。靶位點的3′端還應包含一個由3個堿基NGG（N代表4種堿基中的一種）組成的原間隔相鄰基序 （protospacer adjacent motif，PAM）基序。同一個基因通常有多個靶位點可以選擇。為保證對特定基因的編輯特異性，本研究利用CRISPR/Cas9設計工具CRISPR-GE為每個基因設計了特異性的靶位點。為確保通過CRISPR/Cas9編輯獲得的突變體為功能缺失型突變體，靶位點設計在目標基因靠前的外顯子編碼區區域（圖1）。針對同一個基因存在多個不同轉錄本情況，靶位點選擇在這些轉錄本的共有外顯子編碼區域。煙草屬于異源四倍體植物，某些基因通常存在一個序列高度相似的同源基因。對一些存在序列高度相似同源序列的基因，設計工具有時無法設計靶向單一基因的sgRNA（單靶點sgRNA）。針對這種情況，本研究選擇了可以同時靶向兩個同源基因的sgRNA（雙靶點sgRNA）。由于靶位點的GC含量比例增加可以提高編輯率，所以當存在多個可選靶位點時，本研究選擇了GC含量最高的靶位點（圖1）。

2.2 CRISPR/Cas9載體庫構建

在本研究所用的基因編輯載體中，煙草花葉病毒的35S啟動子用來驅動Cas9基因，擬南芥的U6-26啟動子用來驅動sgRNA骨架達。載體上的sgRNA前端預留了一段20 bp的插入序列，該序列包含兩個Bsa I酶切位點（圖2）。載體經Bas I酶切后，產生兩個特異性的黏性末端，可用來連入20 bp的靶位點序列。根據方法中提及的靶位點引物設計原則合成一對包含20 bp反向互補序列的引物，這一對引物經過退火反應后形成的雙鏈DNA包含兩個與載體匹配的黏性末端。由于該DNA的兩個黏性末端恰好可以與編輯載體的黏性末端完全匹配（圖2），所以可以通過T4 DNA酶將片段與載體連接。連接反應后，轉化大腸桿菌，抗性板篩選菌斑，PCR擴增鑒定陽性克隆，測序正確后提取質粒。通過該流程，本研究總共構建了100個CRISPR/Cas9質粒，這些質粒按等比例混合后形成了一個CRISPR/Cas9載體庫。

2.3 CRISPR/Cas9編輯分析

為了構建突變體庫，本研究將上述的CRISPR/Cas9載體庫轉化農桿菌，然后通過葉盤法轉化煙草，再利用抗生素篩選后獲得陽性轉基因煙草幼苗。由于轉基因植物攜帶了U6-26/sgRNA骨架，因此可以在U6-26啟動子區和sgRNA區分別設計上、下游引物并通過PCR測序獲取陽性轉基因植物的靶位點序列（圖3）。根據提取的靶位點序列找到其對應的靶位點及靶基因。在靶位點兩側設計特異性引物，PCR擴增后測序，然后通過序列比對分析判斷靶基因是否在靶位點附近被編輯。本研究從172個轉基因植株中鑒定到77個不同sgRNA的植株。收獲T0代陽性植株的種子后，種植T1代植株，然后從每個sgRNA株系中選擇7個單株進行靶位點測序分析。

測序結果表明，在61個單靶點sgRNA中，55個有靶向編輯，6個沒有靶向編輯；在16個雙靶點sgRNA中，13個靶向編輯了雙靶基因，1個靶向編輯了2個靶基因的其中1個，2個未靶向編輯靶基因（表1）。sgRNA的靶向編輯率為89.6%（69/77）。

2.4 CRISPR/Cas9脫靶編輯分析

為了評估編輯植株中是否存在脫靶編輯的情況，本研究利用BLAST軟件預測了77個sgRNA的潛在脫靶位點。已有研究表明，sgRNA與脫靶位點的堿基錯配數量大于1個就可以阻止該位點被編輯，而1個堿基錯配仍有較大可能會導致脫靶編輯發生（Naeem et al.， 2020），因此本研究只分析了存在1個錯配堿基的脫靶位點是否被編輯。在獲得的77個sgRNA中，20個sgRNA有1個脫靶位點，1個sgRNA有2個脫靶位點（表1）。在脫靶位點兩側設計特異性引物后進行PCR擴增測序，結果表明只有1個sgRNA的脫靶位點被編輯（圖4）。

3討論

煙草的香味來源于在煙葉片中合成并累積的香味化學成分。香味相關成分的含量和種類受到相關代謝途徑基因的類型及表達水平的控制。受限于煙草種質資源遺傳基礎方面的研究不足，煙草香味品質相關代謝物合成的基因尚未被大規模鑒定。煙草基因組測序和基因功能注釋的完成為煙草香味的研究提供了新動力。本研究利用生物信息學分析獲得了100個與煙草香味品質相關的基因，研究這些基因的功能可為后續改善煙草香味品質提供基因資源。

確定某個基因是否與煙草香味相關并對其功能進行解析很大程度上依賴于相關基因突變體的研究。基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術日趨成熟，利用該技術研究和創制不同香味品質的煙草種質資源對于煙草工業的可持續發展尤為重要。利用CRISPR-Cas9基因編輯技術高通量構建突變體庫已經應用于水稻（Lu et al.， 2017; Meng et al.， 2017; Chen et al.， 2022）、番茄（Jacobs et al.， 2017）、玉米（Liu et al.， 2020）和大豆（Bai et al.， 2020）等二倍體植物。本研究成功將CRISPR-Cas9基因編輯技術應用于四倍體植物煙草突變體庫的構建。最近，CRISPR-Cas9基因編輯技術已成功應用于油菜突變體庫的構建（He et al.， 2023），這也是該技術首次應用于十字花科的異源四倍體植物。本研究的編輯對象煙草是茄科的異源四倍體植物，該突變體庫的成功構建為在茄科多倍體植物中開展高通量靶向編輯提供了一個成功的案例。

在利用農桿菌共轉化獲得CRISPR-Cas9基因編輯突變體庫的方法中，共轉化率、編輯率和脫靶編輯率是研究人員比較關注的問題。本研究結果表明，煙草的共轉化率可以達到77%，因此可以獲得大多數載體的轉基因煙草，這保證了煙草基因突變體庫的高覆蓋率。煙草的轉基因通過愈傷組織轉化實現，單次轉化的基因編輯率高。本研究證明，共轉化多基因編輯載體同樣可以實現較高的基因編輯率（89.6%）。CRISPR-Cas9基因編輯技術潛在的脫靶作用是制約其應用的一個主要因素。本研究進行了脫靶位點分析，結果顯示，77個sgRNA中只有1個位點產生了脫靶編輯，這說明CRISPR-Cas9對靶位點的識別具有很強的特異性。由于本研究未進行全基因組測序分析，所以不能排除編輯植株仍然存在脫靶編輯的可能性。值得提及的是，在編輯植物中總能篩選到Cas9基因與編輯位點位于不同染色體上的植株，在育種實踐中可以通過遺傳分離和純化選擇去除轉基因標簽或脫靶編輯位點。

4結論

本研究利用CRISPR/Cas9技術成功構建了煙草香味相關基因的突變體庫，表明CRISPR/Cas9基因編輯技術高通量編輯煙草基因可用于構建煙草突變體庫，該方法具有共轉化率高、靶向編輯率高和脫靶編輯率低等特點。本研究為煙草香味功能基因的研究提供了遺傳資源，為煙草香味重要性狀的分子改良提供了種質資源。該技術方法并不是僅限于構建煙草香味品質相關基因的突變體庫，而是可用于在煙草中構建研究人員感興趣的任何性狀的基因突變體庫，這將加速煙草功能基因的研究。

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（責任編輯周翠鳴）