不同山茶種質組培條件下染色體倍性的維持與變化

摘要： 植物染色體的倍性維持和變化受環境因素影響，組培再生過程由于培養條件等因素往往導致染色體的結構和倍性變化。為探索組培條件下山茶種質的倍性變化，該研究利用山茶種質的愈傷組織誘導體系，通過流式細胞儀分析倍性變化情況，并結合秋水仙素處理對組培再生條件下倍性的穩定性和變化進行分析。結果表明：（1）10個山茶種質中6個為二倍體，2個為四倍體，1個為六倍體和1個為十倍體，在組培誘導愈傷及再生過程中不同倍性的種質材料能夠保持穩定的倍性。（2）獲得了秋水仙素處理的最適誘導條件，即培養基配方為秋水仙素濃度20 mg·L-1，愈傷增殖培養10 d。（3）對56個獨立組織樣品（含愈傷和芽）開展了倍性檢測發現，有38個組織樣品的倍性在1.5～2.5倍之間，11個組織樣品產生了低于1.5倍性的特異現象。該研究結果進一步探索了不同山茶種質之間的倍性關系，為山茶屬植物的倍性調控和多倍體誘導提供了理論基礎。

關鍵詞： 山茶屬， 染色體倍性， 組織培養， 秋水仙素， 流式細胞術

中圖分類號： Q943文獻標識碼： A文章編號： 1000-3142（2024）07-1299-08

Maintenance and variation of chromosome ploidy undertissue culture conditions of differentCamellia germplasms

LI Yaxuan1，2， LI Xinlei1， LI Jiyuan1， YIN Hengfu1*

（ 1. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Research Institute of Subtropical Forestry， ChineseAcademy of Forestry， Hangzhou 311400; 2. Nanjing Forestry University， Nanjing 210037 ）

Abstract： The maintenance and variation of ploidy in plants are influenced by environmental factor， and the tissue culture regeneration can often cause changes of chromosome structures and ploidy levels. In order to explore the ploidy variation of Camellia germplasm under tissue culture conditions， the callus induction system of Camellia germplasm was used to analyze the ploidy changes by flow cytometry， and the stability and variation of the ploidy under tissue culture generation were analyzed in combination with colchicine treatment. The results were as follows： （1） Six of ten of Camellia germplasms were diploid， two of them were tetraploid， one hexaploid and one decaploid， and the germplasm materials largely maintained stable ploidy levels during the tissue regeneration processes. （2）The optimum conditions for colchicine treatment were obtained， that is， the callus was cultured in treatment medium containing colchicine at 20 mg·L-1 for 10 d， followed by regeneration in tissue-differentiation culture. （3）The ploidy analyses were carried out on the treated tissues in different differentiation states， and the results showed that most of the independent tissues （including 56 callus and shoots） were found to be aneuploids， 38 tissues had ploidy between 1.5 to 2.5 ， and 11 tissues produced less than 1.5. This study further explores the ploidy relationship between different Camellia germplasms， and provides a reference for an in-depth study of ploidy regulation and polyploid induction of Camellia.

Key words： Camellia， chromosome ploidy， tissue culture， colchicine， flow cytometry

山茶（Camellia japonica）隸屬于山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia），是我國傳統木本觀賞花卉 （閔天祿， 1992；Gao et al.， 2005），俗稱耐冬。山茶原產于中國，17世紀中由日本傳入歐洲，由此在歐洲、美洲等地開始進行了廣泛種植 （陳國方等， 2013）。根據國家山茶協會的統計，山茶花的品種已經超過3萬個 （Wang et al.， 2021）。觀賞山茶種質的地理起源復雜，并且存在種間雜交，這使得其染色體倍性存在較大差異（Tanaka et al.， 2006；Hembree et al.， 2019）。在山茶科里，山茶屬與核果茶屬的基本染色體數都是1n=1x=15，但是其他屬的基本染色體數量并不完全一致，如紫莖屬的基本染色體數為1n=1x=15或者1n=1x=17，福蘭茶屬、大頭茶屬、木荷屬的基本染色體數為1n=1x=15或1n=1x=18（Hembree et al.， 2019）。山茶屬植物的倍性存在多種多樣的變異，從三倍體到十倍體都有被報道，其中六倍體為較常見的多倍體（Kondo， 1977；Hembree et al.， 2019）。

植物染色體倍性的變化會影響到許多性狀（Serrano-Mislata et al.， 2015）。比如，來自不同倍性的雜交種子發育后，可能會引起胚乳發育失敗，最終產生生活力低或者沒有活力的種子；另外，奇數倍性的植物在生育力上不及偶數倍性的作物（Kondorosi et al.， 2000）。產生多倍體變異的原因包括自然變異和誘變變異等，其中誘變變異又可以分為物理誘導和化學誘導。目前，大多數人工誘導多倍體的方法是用化學試劑（包括秋水仙素、氟樂靈、氨磺靈等）對正在產生細胞分裂的植物器官、組織、細胞等進行處理，誘導其產生多倍體（彭盡暉等， 2004；程紅英， 2010）。秋水仙素在植物多倍體誘變上被應用得最為廣泛。秋水仙素主要提取于百合科秋水仙（Colchicum autumale）的種子和鱗莖，具有較強毒性（彭盡暉等， 2004）。秋水仙素的主要作用機制如下：通過與有絲分裂細胞接觸，秋水仙素可以與微管蛋白異二聚體結合，導致有絲分裂中期的染色體不能在赤道板上進行排列，影響染色體的分布（彭盡暉等， 2004）。

組培再生過程中，培養條件和介質因素導致體細胞變異、染色體結構重排、倍性變化等情況，這非常普遍（Leite et al.， 2019）。Phillips等（1994）研究發現，不同培養基的組培再生條件下，染色體畸變、非整倍體和多倍體經常發生在體外再生體中。在馬鈴薯、小麥、水稻等農作物中，體細胞無性系等植株可以出現染色體畸變、DNA甲基化、基因突變等多種方式（韋彥余等，2004）。在山茶屬植物中開展組培擴繁體系具有應用意義，然而組培條件下不同倍性種質的染色體完整性研究還比較缺乏。

山茶屬種質有較復雜和高頻率的染色體倍性變化，二倍體、四倍體、六倍體常有出現，那么不同倍性的材料在組培條件下能否維持完整倍性，是否會發生倍性的變化還值得研究。

因此，為明確山茶屬觀賞材料的倍性情況，本試驗參考了前人在山茶屬植物中建立的再生體系（劉海英，2011；吳斌等，2013），研究不同倍性材料之間形態學上與不同組織培養階段下的染色體的倍性變化情況，擬探討以下問題：（1）收集到的10個山茶種質的倍性情況；（2）秋水仙素處理后山茶染色體加倍的濃度和時間條件。本研究結果通過對山茶染色體倍性的檢測分析了不同山茶種質的倍性情況，并探索了山茶染色體變異誘導的最適條件，為多倍體育種的理論奠定基礎。

1材料與方法

1.1 試驗材料和采樣

所使用的山茶種質采自中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所山茶種質資源圃以及金華山茶物種園，采樣時間為2021年7—8月，樣品類型為嫩葉、花芽等組織（表1）。具體的種質信息如下：單體紅山茶（Camellia uraku）、浙江紅山茶（C. Chekiangoleosa）、滇山茶（C. reticulata）、大花紅山茶（C. magniflora）、峨眉紅山茶（C. omeiensis）、全緣紅山茶（C. subintegra）、山手（C. japonica ‘Shanshou’）、南山茶（C. semiserrata）、尖萼紅山茶（C. edithae）、金蝶飛葉（C. japonica ‘Jindiefeiye’）。

1.2 山茶種質愈傷組織的培養

前期采集獲得了10種山茶種質的樣品，經過自來水沖洗和外植體消毒后，使用MS-D2培養基誘導愈傷組織。MS-D2培養基配方如下：瓊脂6.5 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、MS培養基粉末4.43 g·L-1、NAA 0.5 mg·L-1、2，4-D 0.5 mg·L-1、6BA 1 mg·L-1、椰汁50 mL·L-1。外植體消毒流程如下：使用75%酒精浸泡并搖動外植體，使充分接觸2 min；用滅菌后的純水沖洗2次后，使用5%次氯酸鈉消毒10 min；剝離外部已褐化的外層苞片后、切開并接種進培養基。經暗培養約1個月后，待脫分化的愈傷組織長到約0.5 cm × 0.5 cm大小后，將已褐化的原外植體切除后，移入組織培養瓶中進行光照培養，條件為12 h光/12 h暗、光照強度4 000 lx、溫度（25±2）℃。

1.3 山茶種質愈傷組織的流式細胞儀分析

（1）取適量愈傷組織（0.1～0.2 g）放入3.5 cm培養皿中，培養皿中放入2 mL的細胞裂解液（Tris 200 mmol·L-1、MgCl2 4 mmol·L-1、Triton 0.5%， pH 7.5），用鋒利的刀片切成小塊后冰上放置約15 min。（2）使用移液槍吸取塑料培養皿中的上清液，將上清液經過孔徑40 μm的尼龍濾膜過濾，轉移至2 mL的圓底塑料管中，并做好標記。根據濾液體積，加入1/100體積的PI染料（100 mg·L-1），輕輕混勻后用錫箔紙封閉，置于冰上保存至上機檢測。（3）使用BD Accuri C6流式細胞儀對山茶愈傷組織以及誘導后的組織進行倍性測量，使用FL2-A作為x軸，SSC-H作為y軸對測定值進行分析。

1.4 山茶組織秋水仙素處理和培養

依據秋水仙素設定的處理濃度，配置CS4培養基（瓊脂6.5 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、MS培養基粉末4.43 g·L-1、TDZ 1 mg·L-1、PAA 15 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1、椰汁50 mL·L-1），并對耐冬愈傷組織進行培養。秋水仙素濃度分別為10、20、30 mg·L-1，處理時間為10、15、20 d，處理完成后轉入不含秋水仙素的CS4培養基中，利用流式細胞儀測定DNA含量并估算染色體倍性。為了快速檢測處理效果，倍性檢測首先采用混測法，即將5～6個愈傷組織混合檢測，根據倍性變化結果對每個愈傷組織樣本進行單個測定，每個樣品重復3次，用于數據處理和分析。

2結果與分析

2.1 建立10個山茶種質愈傷組織和組培再生過程

山茶種質的外植體經過約30 d的誘導和繼代后出現愈傷組織，獲得愈傷組織的山茶種質包括單體紅山茶、浙江紅山茶、大花紅山茶、滇山茶、峨眉紅山茶、尖萼紅山茶、金蝶飛葉、南山茶、全緣紅山茶、山手（表1）。其中，全緣紅山茶的愈傷組織較為松散，其他山茶種質培育的愈傷組織較為緊密且獲得的愈傷組織未出現明顯的死亡與褐化等情況，說明現有體系能夠高效獲得愈傷組織（圖1），其中FCM-1代表誘導的初代愈傷組織，FCM-2為愈傷繼代培養后階段，FCM-3為愈傷組織轉入組織分化培養（CS4培養基）階段，之后通過2～3次繼代（30～50 d）獲得部分分化的愈傷組織或者芽狀組織。

2.2 山茶屬植物種質不同培養階段的染色體倍性檢測

根據實驗室前期結果，以遺傳穩定的二倍體耐冬為對照，通過流式細胞儀分析檢測10個山茶屬種質材料，根據估算其核內DNA的含量推斷染色體倍性（表2）。結合圖1所示的組培再生過程，分別選取不同培養階段的組織（FCM-1、FCM-2、FCM-3）開展流式細胞儀分析。由表2可知，不同培養條件下的染色體DNA含量在同一個材料當中變化細微，其倍性沒有發生明顯變化；檢測的山茶屬種質組織材料包含6個二倍體、2個四倍體、1個六倍體、1個十倍體。這說明所選用種質存在較大的倍性變化，但是在當前組培再生條件下其倍性保持穩定。

2.3 耐冬多倍體誘導

隨著處理濃度和處理時間的增加，秋水仙素會使植物愈傷組織失去生命活力（張煥玲等， 2008）。為了探究秋水仙素處理對山茶組織染色體的影響，我們利用組培再生體系，設置了耐冬秋水仙素處理條件（表3）。由表3可知，在濃度10 mg·L-1條件下致死的個體數量未達到半數，達到半致死的天數約為48 d；在濃度20 mg·L-1條件下處理10 d后約有預期效果。因此，秋水仙素在濃度20 mg·L-1培養基下處理10 d被選為處理的最適合條件，進而開展耐冬的處理研究。

2.4 秋水仙素處理耐冬組織的倍性檢測

使用流式細胞儀，測定了經秋水仙素處理（濃度20 mg·L-1， 處理10 d）的56個獨立愈傷來源的分化組織（其中含有4個芽組織）的倍性變化情況（圖2：A）。結果發現，秋水仙素誘導對耐冬的倍性產生了顯著改變， 除了少數的愈傷組織為二倍體，大部分愈傷組織和芽組織中倍性呈現出非整倍性的梯度性變化（圖2：B），其中最小倍性為1.2倍，最大倍性為3.2倍。這說明秋水仙素處理造成了耐冬染色體倍性的不穩定變異，但是整倍性加倍或者減少的事件出現的情況較低。

3討論與結論

3.1 山茶屬植物組培再生和染色體倍性維持

在染色體倍性的鑒定中，與核型鑒定方法相比，流式細胞術由于準確性較高、檢測速度較快等特性被廣泛推廣，適用于大規模組織樣品的倍性檢測分析，有利于高效獲得染色體倍性的變化信息（瑞菲爾·努納茲等， 2005；李靖等， 2008）。山茶屬植物的組織中含有多種次生代謝物質，其中單寧化合物在流式分析過程中能夠跟熒光染料（如碘化丙啶）結合，造成較強的背景信號（Huang et al.， 2013）。在山茶屬植物中，通過優化細胞核裂解液和選取次生代謝物含量低的幼嫩組織，流式細胞分析通常能解決背景信號的問題（Huang et al.， 2013）。但是，一些山茶屬植物材料（油茶、茶梅等）的單寧類物質含量較高，使得在流式分析的重復性不高（賈文慶，2015）。Weber等（2008）研究發現，植物愈傷組織均為未分化的、較為幼嫩的細胞團，其中次生代謝物含量較少，有利于開展流式細胞儀檢測。本試驗使用脫分化的愈傷組織進行流式細胞儀分析，能獲得重復性較高的細胞核分離效果，增強了檢測的穩定性。因此，本研究方案減少了雜質對山茶倍性測定的影響，避免了山茶新鮮組織中單寧等物質的背景熒光，提高了實驗的準確性與可重復性。

Syeed等（2021）研究表明組織培養及其再生的過程能夠造成染色體的斷裂、重組等，從而影響染色體倍性的變異。如Ali等（2017）在香芹（Coriandrum sativum）中的研究發現，基因組大小在體胚誘導組織與種子萌發苗之間存在較大變異，說明培養基條件能夠影響基因組的穩定性。

本研究發現，在常規的組織再生過程中，不同倍性的山茶屬種質的染色體倍性相對穩定，這保障了研究方案中不同處理對染色體倍性的連續性研究。但是，不同的組培條件對山茶屬基因組穩定性的影響研究還不充分。山茶屬植物組培再生途徑周期較長，激素的組成、培養時間等條件對染色體倍性的維持和變化的研究還有待進一步深入。

3.2 秋水仙素處理山茶屬植物后染色體倍性的變化

在觀賞植物的染色體加倍的報告中，使用秋水仙素對植物進行誘導的成功率最高（Manzoor et al.， 2019）。例如，在與山茶屬近緣的杜鵑花（Rhododendron fortune）中，利用0.1%秋水仙素處理24 h就能高效地誘導出多倍體組織（Mo et al.， 2020）。本研究發現，山茶屬植物對秋水仙素具有較高的抵抗性，在30 mg·L-1的培養基中其半致死的時間約為1個月。本試驗使用固體培養基對山茶進行了培養，研究表明秋水仙素的處理能夠使再生組織的染色體倍性發生顯著變化，但是極少（約為1%）出現類似整倍性的變化。本研究發現，秋水仙素處理后的山茶組織呈現頻繁的非整倍體細胞。盡管類似的結果在其他植物中也有發現，如柑橘（Gmitterjr et al.， 1991）、葡萄（Kara et al.， 2019）等。Park等（2016）研究指出，由于非整倍體植物通常表現出發育異常、不育或致死性，因此很少評估非整倍體植物的經濟用途。Park等（1999）通過使用未成熟種子的培養和隨后的胚培養，從184個不同的三倍體雜交葡萄藤之間的各種雜交中回收了5個染色體數目在51～59之間的非整倍體植物。在山茶屬植物中的非整倍體出現得較多（56個樣品中有38個組織的倍性在1.5～2.5倍之間），推斷其形成原因如下：（1）由于秋水仙素處理對組培不同類型細胞中紡錘絲的作用存在特殊性，山茶屬植物組培條件下細胞處于不均勻等分裂狀態，它抑制紡錘絲的效果不盡相同，因此產生的并不是完整的多倍體，并存在染色體缺失、染色體嵌合等情況，造成倍性檢測的結果不均一；（2）山茶屬植物對秋水仙素的響應存在差異，盡管前期實驗設計中的秋水仙素濃度對愈傷組織的生長抑制作用不明顯，但是處理濃度及作用時間可能在細胞增殖過程中存在敏感性差異。另外，本研究發現11個組織樣品（19.6%）產生了低于1.5倍性的特異現象，我們推測這可能是由于在有絲分裂過程中，秋水仙素的處理導致細胞中染色體加倍過程出現障礙，因此造成丟失了部分染色體。綜上結果，秋水仙素對山茶屬植物處理條件（如秋水仙素的處理濃度、處理時間、處理部位等）需要進一步優化，以達到最佳的整倍體誘導的效果。

本實驗通過探索組培條件下山茶種質的維持與變化情況，測試了使用秋水仙素對山茶種質資源的加倍的最適條件，為今后探索山茶種質資源的加倍提供了基礎，并為山茶多倍體的育種打下了基礎。

參考文獻：

ALI M， MUJIB A， TONK D， et al.， 2017. Plant regeneration through somatic embryogenesis and genome size analysis of Coriandrum sativum L. ［J］. Protoplasma， 254： 343-352.

CHEN GF，HE HP， YU L， 2013. Historical evolution of Camellia species and their garden applications ［J］. Sci Technol Innov Herald， 13： 230-231. ［陳國方， 何海平， 俞琳， 2013. 山茶花品種的歷史演化及其園林應用 ［J］. 科技創新導報， 13： 230-231.］

CHENG HY， 2010. Study on polyploid induction of Cinnamomum camphora by colchicine ［D］. Wuhan： Huazhong Agricultural University： 11-12. ［程紅英， 2010. 秋水仙素誘導樟樹多倍體的研究 ［D］. 武漢： 華中農業大學： 11-12.］

GAO JY， PARKS CR， DU YQ， 2005. Collected species of the genus Camellia an illustrated outline ［M］. Hangzhou： Zhejiang Science and Technology Press.

GMITTER FG， LING XB， CAI CY， et al.， 1991. Colchicine-induced polyploidy in Citrus embryogenic cultures， somatic embryos， and regenerated plantlets ［J］. Plant Sci， 74（1）： 135-141.

HEMBREE W， RANNEY T， JACKSON BE， et al.， 2019. Cytogenetics， ploidy， and genome sizes of Camellia and related genera ［J］. HortScience， 54（7）： 1124-1142.

HUANG H， TONG Y， ZHANG QJ， et al.， 2013. Genome size variation among and within Camellia species by using flow cytometric analysis ［J］. PLoS ONE， 8（5）： e64981.

JIA WQ， 2015. Fundamental study on reproductive biology and ploidy breeding of Camellia flower ［D］. Beijing： Chinese Academy of Forestry. ［賈文慶， 2015. 山茶花生殖生物學及倍性育種基礎研究 ［D］. 北京： 中國林業科學研究院.］

KARA Z， SABIR A， YAZAR K， et al.， 2019. Effects of colchicine treatments on some grape rootstock and grape varieties at cotyledon stage ［J］. Selcuk J Agric Food Sci， 32（3）： 424-429.

KONDO K， 1977. Chromosome numbers in the genus Camellia ［J］. Biotropica， 9（2）： 86-94.

KONDOROSI E， ROUDIER F， GENDREAU E， 2000. Plant cell-size control： growing by ploidy？ ［J］. Curr Opin Plant Biol， 3（6）： 488-492.

LEITE CT， FERREIRA DA， TAVARES VIEIRA AT， et al.， 2019. In vitro responses in Passiflora species with different chromosome numbers， ploidy levels and nuclear 2C values： revisiting and providing new insights ［J］. Plant Cell， Tissue Organ Cult， 136： 549-560.

LI J， LI CB， DUN WT， et al.， 2008. Application progress flow cytometry （FCM） in the biological research ［J］. Chin Agric Sci Bull， 24（6）： 107-111. ［李靖， 李成斌，頓文濤，等， 2008. 流式細胞術（FCM）在生物學研究中的應用 ［J］. 中國農學通報， 24（6）： 107-111.］

LIU HY， 2011. Plantregeneration and callus induction of Camellia oleifera ［D］. Wuhan： Huazhong Agricultural University. ［劉海英， 2011. 油茶組培再生體系建立及愈傷組織誘導 ［D］. 武漢： 華中農業大學.］

MANZOOR A， AHMAD T， BASHIR MA， et al.， 2019. Studies on colchicine induced chromosome doubling for enhancement of quality traits in ornamental plants ［J］. Plants， 8（7）： 194.

MIN TL， 1992. Revision of the Camellia sinensis group of plants ［J］. Acta Bot Yunnan， 14（2）： 115-132. ［閔天祿， 1992. 山茶屬茶組植物的訂正 ［J］. 云南植物研究， 14（2）： 115-132.］

MO L， CHEN JH， LOU XZ， et al.， 2020. Colchicine-induced polyploidy in Rhododendron fortunei Lindl. ［J］. Plants， 9（4）： 424.

NUNEZ R， LIU BC， XU ZL， et al.， 2005. A concise handbook of flow cytometry principles and research applications ［M］. Beijing： Chemical Industry Press. ［瑞菲爾·努納茲， 劉秉慈， 徐增祿， 等， 2005. 流式細胞術原理與科研應用簡明手冊 ［M］. 北京： 化學工業出版社.］

PARK YS， HEO JY， PARK SM， 2016. Production of hypo- and hypertetraploid seedlings from open-， self-， and cross-pollinated hypo- and hypertetraploid grape ［J］. Korean J Hortic Sci Technol， 34（5）： 771-778.

PARK SM， WAKANA A， HIRAMATSU M， 1999. Most hypotetraploid seedlings from self-pollinated tetraploid grapes （Vitis complexes） have abnormal cotyledons ［J］. J Fac Agric， 44（1/2）： 81-89.

PENG JH， ZHANG LB， PENG XY， 2004. Progress in the application of colchicine in plant ploidy breeding ［J］. Hunan For Sci Technol， 31： 22-25. ［彭盡暉， 張良波， 彭曉英， 2004. 秋水仙素在植物倍性育種中的應用進展 ［J］. 湖南林業科技， 31： 22-25.］

PHILLIPS RL， KAEPPLER SM， OLHOFT P， 1994. Genetic instability of plant tissue cultures： breakdown of normal controls ［J］. Proc Natl Acad Sci， 91（12）： 5222-5226.

SERRANO-MISLATA A， SCHIESSL K， SABLOWSKI R， 2015. Active control of cell size generates spatial detail during plant organogenesis ［J］. Curr Biol， 25： 2991-2996.

SYEED R， MUJIB A， MALIK MQ， et al.， 2021. Mass propagation through direct and indirect organogenesis in three species of genus Zephyranthes and ploidy assessment of regenerants through flow cytometry ［J］. Mol Biol Rep， 48： 513-526.

TANAKA J， TANIGUCHI F， HIRAI N， et al.， 2006. Estimation of the genome size of tea （Camellia sinensis）， camellia （C. japonica）， and their interspecific hybrids by flow cytometry ［J］. Chagyo Kenkyu Hokoku （Tea Res J）， 101： 1-7.

WANG YN， ZHUANG HF， SHEN YG， et al.， 2021. The dataset of Camellia cultivars names in the world ［J］. Biodivers Data J， 9： e61646.

WEBER J， GEORGIEV V， PAVOLV A， et al.， 2008. Flow cytometric investigations of diploid and tetraploid plants and in vitro cultures of Datura stramonium and Hyoscyamus niger ［J］. Cytometry Part A： J Int Soc Anal Cytol， 73（10）： 931-939.

WEI YY， ZHAO MA， WANG XJ， 2004. Application of plant somatic cell asexual variation in plant trait improvement ［J］. Plant Physiol Newsl， 40（6）： 763-771. ［韋彥余， 趙民安， 王曉軍， 2004. 植物體細胞無性系變異在植物性狀改良中的應用 ［J］. 植物生理學通訊， 40（6）： 763-771. ］

WU B， LI JY， FAN ZQ， et al.， 2013. Camellia japonica ‘Naidong’ healing tissue induction and plant regeneration ［J］. Plant Physiol J， 49（4）： 343-346. ［吳斌， 李紀元， 范正琪， 等， 2013. 山茶 ‘耐冬’愈傷組織誘導與植株再生 ［J］. 植物生理學報， 49（4）： 343-346.］

ZHANG HL， LI JH， LI ZQ， 2008. Induction of polyploidy by colchicine treatment of Eucommia seeds ［J］. J NW For Univ， 23（1）： 78-81. ［張煥玲， 李俊紅， 李周岐， 2008. 秋水仙素處理杜仲種子誘導多倍體的研究 ［J］. 西北林學院學報， 23（1）： 78-81.］

（責任編輯鄧斯麗）