補腎活血方中lncRNA00667的分子作用與絕經后膀胱過度活動癥的關系研究

【摘要】目的 通過揭示lncRNA00667在補腎活血方治療絕經后膀胱過度活動癥（OAB）中的作用和相關機制，以期為全面和深入認識OAB的分子遺傳學特征提供實驗研究依據。方法 選擇30只C57BL/6J大鼠（雌），隨機選取其中10只作為假手術組，另外20只經切割卵巢構建OAB模型，建模成功后隨機分成補腎活血方組和生理鹽水組，各10只，3組大鼠術后均常規飼喂1周。術后1周補腎活血方組、生理鹽水組分別灌胃補腎活血方與等量生理鹽水，干預12周。記錄3組大鼠每天的排尿量、排尿間隔時間及排尿次數；處死

3組大鼠，比較3組大鼠體質量、膀胱稱重及臟器指數；取大鼠血漿、膀胱上皮細胞檢測lncRNA00667基因表達情況。結果 假手術組大鼠體質量和膀胱稱重均高于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組的體質量高于生理鹽水組（均P<0.05），生理鹽水和補腎活血方組大鼠膀胱稱重，以及3組大鼠間膀胱臟器指數比較，差異均無統計學意義（均P>0.05）；假手術組大鼠每次尿量、排尿次數均少于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組每次尿量少于生理鹽水組，假手術組排尿間隔時間長于生理鹽水組（均P<0.05），生理鹽水組和補腎活血方組排尿次數和排尿間隔時間比較，以及補腎活血方組和假手術組排尿間隔時間比較，差異均無統計學意義（均P>0.05）；假手術組大鼠血漿和膀胱平滑肌的lncRNA00667表達量均高于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組大鼠血漿lncRNA00667的表達均高于生理鹽水組（均P<0.05），但補腎活血方組和生理鹽水組大鼠膀胱平滑肌中lncRNA00667的表達量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論 采用補腎活血方對絕經后OAB大鼠模型進行干預，可提高lncRNA00667表達水平，改善大鼠排尿活動，促進體質量的恢復，從而獲得較好的效果。

【關鍵詞】膀胱過度活動癥 ; 補腎活血方 ; lncRNA00667 ; 分子功能

【中圖分類號】R694 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.23.0030.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.23.010

膀胱過度活動癥（overactive bladder， OAB）作為臨床上的一種常見病、多發病，其常見癥狀有尿急、尿失禁、夜尿增多及尿頻等，且該病具有病程長、遷延不愈的特點，不僅危害患者身心健康，在一定程度上還加重了患者的精神和生理負擔。OAB是老年婦女常見病，考慮可能與絕經后女性雌激素水平降低，從而促使膀胱頸周圍致密彈力纖維組織、膀胱頸腺體及其導管變薄，導致疾病的發生有關。對于OAB患者，臨床上以對癥治療為主，雌激素替代治療是預防OAB和絕經后綜合征的主要方法。但內分泌替代療法會產生嚴重的心、血管、肝臟等不良反應，以及增加子宮內膜癌的發生風險。因此尋找和研發OAB的更有效的治療方法和手段是臨床研究的重點。一般來說，大部分疾病的發生、發展是一個多基因改變、多步驟演進的復雜過程，目前有許多基因如miR-139-5p、miR-98-5p、Arg已被證實與OAB的發生、發展和預后密切相關，并有望成為OAB新的分子標記物和治療靶點[1]。有研究指出，在生物調控中，蛋白質作為一種執行元件，其中長鏈非編碼核糖核酸

（lncRNA）與蛋白質通過互相作用，可以作用于生物調控。lncRNA對基因表達進行調控的方法較多，并且呈現出多樣化的特點[2]。lncRNA00667作為lncRNA家族的一員，在絕經后機體表達上調后，lncRNA00667可使雌激素水平增加，改善內分泌，使肌肉收縮力下降，對逼尿肌收縮進行抑制，從而達到緩解疾病癥狀的目的[3]。對于絕經后OAB，中醫經典著作中并沒有相關論述，但是以其病證分析和癥狀表現特點為基本依據，可以將其劃分為“小便不禁”“遺尿”“小便頻數”“淋癥”等范疇，認為其病機病因是命門火衰、腎氣虧虛，膀胱氣化無力，早期以濕熱入侵機體在下焦中聚集，或氣機阻滯、情志不舒，阻礙氣血正常運行，使“瘀”“熱”“濕”互結，對膀胱氣化功能產生影響，久至肝、腎、脾虧虛，本虛標實，加劇氣化不利，所以治療應遵循補腎益氣、活血化瘀的基本原則[4]。補腎活血方作為中醫的一個經驗方，方中枸杞、熟地黃可以平補腎中陰陽以益腎氣，獨活、沒藥、山茱萸及杜仲等具有消瘀散結、活血化瘀的功效，與歸尾、補骨脂等合用，不僅可以活血破瘀，還能養血生新，全方共奏活血補腎的功效[5]。基于此，本研究旨在探討lncRNA00667在絕經后OAB采用補腎活血方治療中的分子功能與作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇C57BL/6J雌性大鼠30只，體質量200～220 g，3月齡，SPF級喂養5～7 d以適應環境，觀察無不良反應后，納入實驗。所有大鼠均是來自南方醫科大學附屬廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）醫學實驗動物中心的SPF級動物，動物許可證編號：SCXK（粵）2022-0002。

1.2 主要儀器和試劑 主要儀器：水套式二氧化碳培養箱[上海一恒科技有限公司，型號：BPN-80CW（UV）]，熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測系統（杭州博日科技股份有限公司，型號：FQD-96A），DNA序列分析電泳儀（上海艾研生物科技有限公司，型號：Mini-SUB Cell），凝膠成像系統（美國伯樂生物科技有限公司，型號：ChemiDoc MP），倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯株式會社，型號：IX73），化學發光凝膠成像系統[孚約生物科技（上海）有限公司，型號：ChemiDoc]等。

主要試劑：100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基和DMEM培養基，10%胎牛血清（上海勁馬生物科技有限公司）；高容量cDNA反轉錄試劑盒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]等。

1.3 絕經后OAB大鼠模型構建與分組 選擇30只C57BL/6J雌性大鼠，隨機選取其中10只健康、體質量相似的大鼠作為假手術組，接受與實驗組相同的手術操作，但未切除目標器官；另外20只切割卵巢構建絕經后OAB大鼠模型，建模成功后隨機分為兩組，每組10只，分別是補腎活血方組和生理鹽水組，確保3組大鼠在術后體質量和活動能力正常，無術后異常反應表明建模成功，常規飼喂1周。術后1周，補腎活血方組灌胃補腎活血方，根據1 mL/（100 g·d）體質量給予補腎活血方（熟地黃、肉蓯蓉各20 g，補骨脂、菟絲子、山茱萸各15 g，杜仲、枸杞、歸尾、沒藥、獨活各10 g組成，冷水煎煮藥材，取汁100 mL，含生藥量1.35 g/mL）灌胃，控制時間在3 min；而生理鹽水組于術后1周給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續干預12周。

1.4 研究方法

1.4.1 排尿活動測定 采用代謝籠法，即在簡易代謝籠內放入大鼠，通過籠底部的大小便分離漏斗分開糞便與尿液，對尿液進行采集，并且記錄每天的排尿量、排尿間隔時間及排尿次數，持續30 d，計算平均值。

1.4.2 lncRNA00667基因表達水平檢測 干預12周后，通過切尾采血的方法進行全血采集，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑，然后放入離心管中，以3 000 r/min轉速進行10 min離心處理后取上層血漿。膀胱平滑肌標本制備：在無菌條件下，通過手術解剖取大鼠膀胱組織，運用磷酸鹽緩沖液對膀胱組織進行清洗后，將雜質和血液去除，然后在低溫條件下，運用解剖刀對膀胱平滑肌層進行分離，操作時盡量避免對組織造成損傷，完成操作后，在液氮中冷凍組織。采用高容量cDNA反轉錄試劑盒將核糖核酸（RNA）逆轉錄為互補cDNA，將20 μL RNA應用于整個反應體系中。具體條件：95 °C條件下進行30 s變性后，56 °C條件下進行45 s退火，72 °C條件下進行45 s延伸，再根據熒光定量PCR檢測系統針對PCR反應循環35個，運用生物系統TaqMan微小RNA檢測試劑盒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司提供]方案進行逆轉錄后檢測lncRNA00667水平，其中lncRNA00667的正向引物序列為5’-CGACCCCAACACCTTCTTTG-3’，反向引物序列為5’-CTCACCCTAAGTTCGCTGG-3’。

1.4.3 體質量、膀胱稱重及臟器指數 在結束實驗后對大鼠進行稱重，然后通過頸椎脫臼法處死后取膀胱，分別稱取總量；對膀胱臟器指數進行計算，即膀胱臟器指數=膀胱臟器質量（mg）/大鼠體質量（mg）×1 000，計算出每只實驗動物的膀胱臟器指數，并記錄各組數據。

1.5 觀察指標 ⑴比較3組大鼠的體質量、膀胱稱重及臟器指數；⑵比較3組大鼠的排尿活動，包括每次尿量、排尿次數、排尿間隔時間；⑶比較3組大鼠血漿和膀胱平滑肌組織中lncRNA00667基因表達水平。

1.6 統計學方法 運用SPSS 20.0統計學軟件分析數據，計量資料均使用S-W法檢驗證實服從正態分布，以（ x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠體質量、膀胱稱重及臟器指數比較 假手術組大鼠體質量和膀胱稱重均高于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組的體質量高于生理鹽水組，差異均有統計學意義（均P<0.05），生理鹽水和補腎活血方組大鼠膀胱稱重，以及3組大鼠間膀胱臟器指數比較，差異均無統計學意義（均P>0.05），見表1。

2.2 3組大鼠的排尿活動情況比較 假手術組大鼠每次尿量、排尿次數均少于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組每次尿量少于生理鹽水組；假手術組排尿間隔時間長于生理鹽水組，差異均有統計學意義（均P<0.05），生理鹽水組和補腎活血方組排尿次數和排尿間隔時間比較，以及補腎活血方組和假手術組排尿間隔時間比較，差異均無統計學意義（均P>0.05），見表2。

2.3 3組大鼠血漿和膀胱平滑肌lncRNA00667水平比較 假手術組大鼠血漿和膀胱平滑肌的lncRNA00667表達量均高于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組大鼠血漿lncRNA00667表達量均高于生理鹽水組，差異均有統計學意義（均P<0.05），而補腎活血方組和生理鹽水組小數膀胱平滑肌中lncRNA00667表達量比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

3 討論

目前，關于OAB的發生機制，當前學說較多如肌源性、神經激肽、神經源性及膀胱上皮屏障等，其是多種因素相互作用的結果。因此，深入探究OAB的發生機制，且對具有特異性和不良反應較小的藥物進行開發是OAB治療的一個重要方向。

OAB基本病機包括膀胱氣化功能失常、腎虛、濕熱蘊結，作為一種本虛標實之證，以膀胱濕熱和腎虛為主，所以治療原則是“虛則補之，實則瀉之”。《傷科大成》為補腎活血方的主要出處，方中杜仲、熟地黃、山茱萸、枸杞子、肉蓯蓉、補骨脂及菟絲子等可以強筋壯骨、溫補腎陽；輔以沒藥、獨活、歸尾可以溫腎補陽、填補精血、止痛通絡、祛瘀活血，全方共奏止痛、活血養血、壯筋補腎的功效。

由于女性泌尿生殖系統來源于胚胎原始生殖竇，共為雌激素依賴的器官，在生長發育中受雌激素影響，因此雌激素不足必然會對下尿路結構產生影響。絕經期女性卵巢功能逐漸減退，內分泌功能失調，減少體內雌激素分泌，使下丘腦功能和自主神經系統失調，再加上雌激素水平下降，促使平滑肌對神經刺激應答性下降，引起膀胱平滑肌收縮無力，同時引起膀胱尿道黏膜血流供應減少，導致黏膜萎縮，彈性纖維變薄，從而誘發膀胱上皮萎縮性改變，出現尿頻、尿急等尿路功能障礙癥狀。本次研究結果顯示，假手術組大鼠每次尿量、排尿次數均少于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組每次尿量少于生理鹽水組，假手術組排尿間隔時間長于生理鹽水組，這表明補腎活血方能夠改善OAB大鼠臨床癥狀。經現代藥理學研究表明，山茱萸中環烯醚萜苷可以抗血小板聚集，使血漿黏稠度下降，對膀胱尿道黏膜血流供應血液循環起到一定的促進作用，使組織器官的生理功能維持正常，從而改善尿路功能障礙癥狀[6]；肉蓯蓉中的肉蓯蓉總苷、苯丙醇糖等能夠改善下丘腦 - 垂體 - 性腺軸平衡失調，以促性腺激素釋放激素、性激素、促性腺激素釋放，從而促進陰道和尿道上皮細胞成熟，增加尿道平滑肌α腎上腺素能受體的敏感性，使尿道平滑肌收縮，從而增強大鼠排尿控制能力，可使尿液的不自主排泄減少，改善排尿功能[7]。

在本次研究中，為了更全面分析補腎活血方的作用，各組大鼠結束實驗后稱重，結果顯示，假手術組大鼠體質量和膀胱稱重均高于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組的體質量高于生理鹽水組，這提示采取補腎活血方治療能夠促進切割卵巢大鼠的體質量恢復。分析其原因為，補腎活血方中含有的沒藥、歸尾等中藥成分能活血養血，對切割卵巢的大鼠切口抗炎和促進血液循環，并增強體質和免疫功能，從而促進身體恢復，進而促進體質量恢復[8]。

lncRNA是一類轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，其序列元件處于高度保守狀態，空間二級結構比較特殊，亞細胞定位明確，還有細胞或者組織表達特異性，說明在細胞總轉錄物種，這些所占比例較高。lncRNA雖然缺乏蛋白質編碼能力，但其生物學功能比較重要，在基因表達調控中發揮著重要作用。研究發現，在絕經后OAB患者中，lncRNA00667表達上升后，可增強細胞間興奮傳遞功能，并且OAB患者膀胱逼尿肌lncRNA00667表達和功能明顯增加[9]。本次研究顯示，采用補腎活血方治療后，其血漿和膀胱平滑肌中的lncRNA00667水平均升高，說明補腎活血方能夠使OAB大鼠血漿中的lncRNA00667水平升高，從而達到對OAB進行抑制的效果。分析其原因為，方中杜仲、熟地黃、山茱萸、補骨脂及菟絲子等合用，能夠利用抗氧化應激功效，將自由基清除，抑制細胞凋亡，使細胞免疫功能增強，對激素平衡進行調節，并且還能增強下丘腦 - 垂體 - 性腺軸功能，升高lncRNA00667水平，使雌激素水平增加，改善內分泌，使肌肉收縮力下降，對逼尿肌收縮進行抑制，從而達到治療目的[10]。

綜上，采用補腎活血方對絕經后OAB大鼠模型進行干預，可提高lncRNA00667表達水平，改善大鼠排尿活動，促進體質量的恢復，從而獲得較好的效果。但是方中是何種成分在治療中起到主導作用，未來還需進一步探索。

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