電針對慢性潰瘍性結腸炎小鼠C3a/C3aR通路相關蛋白的影響

〔摘要〕 目的 觀察電針對慢性潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis， UC）模型小鼠補體C3蛋白3a（complement 3a， C3a）/補體C3蛋白3a受體（complement 3a receptor， C3aR）通路相關蛋白的影響。方法 將48只BALB/c小鼠采用隨機數表法分為空白組（12只）和造模組（36只）。造模組采用3%葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate， DSS）自由飲水（7 d誘導+5 d緩解）為1個周期，共4個周期構建慢性UC模型。造模成功后再二次隨機分為模型組、電針組、柳氮磺胺嘧啶（sulfasalazine， SASP）組，每組12只。空白組不予處理，模型組僅捆綁，電針組針刺關元、天樞、足三里、上巨虛穴，每天20 min，SASP組每天灌胃SASP混懸液[500 mg/（kg·d）]，連續14 d。記錄各組小鼠的疾病活動指數（disease activity index， DAI）、體質量、結腸長度和結腸指數;HE染色觀察結腸黏膜損傷指數（colonic mucosal damage index， CMDI）評分變化;Western blot檢測結腸組織中C3aR蛋白的表達量;免疫組織化學染色檢測半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）和消皮素D（gasdermin D， GSDMD）蛋白水平;ELISA檢測結腸組織中C3a蛋白及血清中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF-α）和白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）等炎性因子的表達情況。結果 與空白組相比，模型組小鼠的體質量顯著下降，DAI評分、結腸縮短、結腸指數和CMDI評分均顯著增加（Plt;0.01）;結腸組織中C3a、C3aR蛋白的表達增加（Plt;0.05）;Caspase-1、GSDMD蛋白的表達水平顯著升高（Plt;0.01）;血清中的IL-1β和TNF-α炎性因子的含量顯著上升（Plt;0.01）。與模型組相比，電針組和SASP組小鼠的體質量增加，DAI和CMDI評分均降低（Plt;0.05），結腸長度恢復、結腸指數評分顯著降低（Plt;0.01）;結腸組織中C3aR蛋白的表達顯著減少（Plt;0.01），C3a蛋白的表達減少（Plt;0.05）;Caspase-1和GSDMD蛋白的表達水平降低（Plt;0.05）;血清中IL-1β和TNF-α炎性因子的含量下降（Plt;0.05）。結論 電針能夠改善UC模型小鼠結腸組織細胞焦亡與慢性炎癥，其機制可能與抑制C3a/C3aR通路蛋白的表達有關。

〔關鍵詞〕 慢性潰瘍性結腸炎;電針;補體;C3a/C3aR通路;焦亡;慢性炎癥

〔中圖分類號〕R245" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.12.013

Effects of electroacupuncture on the C3a/C3aR pathway-related"proteins in mice with chronic ulcerative colitis

HU Xiaomei1，2， TIAN Chuning1， LI Qian1， PAN Yanying1， TANG Yasi1， CHEN Xingyu2，"ZHANG Hong1*， YI Xiqin1*

1. School of Acupuncture-moxibustion， Tuina and Rehabilitation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha，"Hunan 410208， China; 2. College of Medical Imaging Laboratory and Rehabilitation， Xiangnan University，"Chenzhou， Hunan 423000， China

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of electroacupuncture on complement 3a （C3a）/complement 3a receptor （C3aR） pathway-related proteins in a mouse model of chronic ulcerative colitis （UC）. Methods A total of 48 BALB/c mice were divided into a blank group （n=12） and a modeling group （n=36） by a random number table method. With a regimen of 3% dextran sodium sulfate （DSS） administered through free water drinking （seven days of induction+five days of remission） as one cycle， the modeling group underwent a total of four cycles to establish a chronic UC model， and was then randomly subdivided into model， electroacupuntcture， and sulfasalazine （SASP） groups after successful modeling， with 12 mice in each group. The blank group was not treated; the model group was only bundled; the electroacupuntcture group was treated with electroacupuntcture at Guanyuan （CV 4）， Tianshu （ST 25）， Zusanli （ST 36）， and Shangjuxu （ST 37） for 20 minutes daily; the SASP group was given SASP suspension [500 mg/（kg·d）] by gavage daily. All intervention lasted for 14 consecutive days. The disease activity index （DAI）， body weight， colon length， and colon index of each group of mice were recorded; the changes in colonic mucosal damage index （CMDI） were observed through HE staining; the expression of C3aR protein in colon tissues was examined through Western blot; the protein levels of Caspase-1 and gasdermin D （GSDMD） were checked through immunohistochemistry; the expressions of C3a protein in colon tissues and the inflammatory factors such as tumor necrosis factor （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） in serum were determined through ELISA. Results Compared with the blank group， mice in the model group showed significant decreases in body weight and colon length， along with significant increases in DAI score， colon index， and CMDI score （Plt;0.01）; the expression levels of C3a and C3aR proteins in colon tissues increased （Plt;0.05）; the expression levels of Caspase-1 and GSDMD proteins increased significantly （Plt;0.01）; the serum levels of IL-1β and TNF-α increased significantly （Plt;0.01）. Compared with the model group， mice in both electroacupuncture and SASP groups showed an increase in body weight， along with decreases in the DAI and CMDI scores （Plt;0.05）; colon length was partially restored and the colon index score was significantly reduced in these groups （Plt;0.01）; the expression of C3aR protein in colon tissues decreased significantly （Plt;0.01）， and the expression of C3a protein decreased （Plt;0.05）; the expression levels of Caspase-1 and GSDMD proteins decreased （Plt;0.05）; the serum content of IL-1β and TNF-α decreased （Plt;0.05）. Conclusion Electroacupuncture can alleviate pyroptosis and chronic inflammation in colon tissues of UC model mice， and its mechanism may be related to the inhibition of the expressions of C3a/C3aR pathway-related proteins.

〔Keywords〕 chronic ulcerative colitis; electroacupuncture; complement; C3a/C3aR pathway; pyroptosis; chronic inflammation

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis， UC）作為一種慢性自身免疫性腸道疾病，主要表現為腹痛、腹瀉和血便[1]。近年來，UC的發病率逐年增高，因其病程纏綿和易復發的特性，嚴重影響患者的生活質量[2]。UC現有的治療藥物主要有5-氨基糖苷類、硫嘌呤類藥物及生物制劑等[3]，但這些藥物長期使用后常伴有肝臟損傷、腎功能代謝異常等毒副作用，亟須尋找新的治療方式。電針作為臨床上常見的補充替代療法，結合了傳統醫學和現代康復的優點。在臨床試驗與動物實驗中均證實了電針改善UC的優效性：JOOS等[4]研究表明，電針可降低UC患者的疾病活動指數;陳正鑫[5]研究表明，電針可以降低UC患者糞便鈣衛蛋白、紅細胞沉降率等炎癥指標，提高內鏡下黏膜愈合率。但其具體作用機制仍需進一步探索。

補體（complement， C）在UC的發生和發展中起重要作用，補體系統中的C1q、CD46等因子有助于保護腸道屏障，減少腸道炎癥，而C3、C5和C5a則被證實會加劇腸道損傷，促進UC的發展[6]。研究發現，在UC慢性階段，C3通過裂解產生C3a，激活細胞膜上的C3aR受體，從而激活C3a/C3aR通路，促進腸上皮細胞焦亡，進一步加劇腸道炎癥反應[7]。既往研究表明，紫錐菊提取物可通過下調C3a/C3aR信號通路發揮抗炎作用并改善UC癥狀[8]。因此，抑制C3a/C3aR通路可能是治療UC的關鍵分子途徑。然而，電針是否可以通過調節C3a/C3aR通路治療UC尚不明確。因此，本研究以慢性UC模型小鼠為觀察目標，從補體角度探索電針對潰瘍性結腸炎C3a/C3aR通路相關蛋白的影響，為電針治療UC提供理論依據。

1 材料與方法

1.1" 實驗動物

健康SPF級BALB/c小鼠52只[湖南斯萊克景達實驗動物公司，許可證號：XYXK 2019-0009]，雌雄各半，8周齡，體質量（20±2） g。SPF級實驗室適應性分籠飼養7 d，培養溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%，壓力梯度20～50 Pa，換氣15～20次/h。本研究實驗已通過湖南中醫藥大學倫理委員會審核（倫理批號：LL2022112304）。

1.2" 主要儀器和試劑

1.2.1" 主要試劑" 葡聚糖硫酸鈉（美侖生物技術有限公司，批號：MB5535）;柳氮磺吡啶腸溶片（華潤雙鶴藥業股份有限公司，批號：國藥準字H11020818）;異氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，批號：R510-22-16）;HE染色試劑盒、免疫組織化學試劑盒（塞維爾生物科技有限公司，批號：G1076、G1216）;白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、C3a ELISA試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司，批號：E-EL-M0044、E-EL-M3063、E-EL-M0337c）;半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、消皮素D（gasdermin D， GSDMD）抗體（塞維爾生物科技有限公司，批號：GB15383、GB114198）;C3aR抗體（正能生物科技有限公司，批號：822006）。

1.2.2" 主要儀器" 華佗牌電針治療儀（型號：SDZ-V，蘇州醫療用品廠有限公司）;可孚一次性使用無菌平柄針灸針（規格：0.18 mm×13 mm，吳江市云龍器械有限公司）;多功能微孔板讀數儀（型號：Varioskan LUX，美國賽默飛世爾科技公司）;數字切片掃描儀（型號：PannoramicMIDIII，匈牙利3DHISTECH公司）。

1.3" UC模型小鼠的建立與分組干預

本研究參考改良的DSS造模方法進行造模[9]。48只BABL/c小鼠按照隨機數表法分為空白組12只與造模組36只。空白組予以蒸餾水自由飲用;造模組以3% DSS自由飲水（誘導）7 d+蒸餾水（緩解）5 d為1個周期，共4個周期。造模結束后，進行模型檢測，以疾病活動指數（disease activity index， DAI）評分≥2分為成模標準[10]。將造模成功的小鼠再次隨機分為模型組、電針組、柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine，SASP）組，每組12只。

造模結束后，分組進行干預。空白組不予干預;模型組僅捆綁固定;電針組捆綁固定后，參照《實驗針灸學》分別刺入小鼠雙側天樞、上巨虛、關元、足三里穴，直刺5 mm，電針參數選用疏密波（10 Hz/50 Hz），電流為1 mA，強度以肢體輕微抖動為度，每次留針20 min;SASP組參考《實驗動物和動物實驗技術》[11]中的換算方法，小鼠給藥劑量=人體給藥劑量/人體體重×9.1，即等效給藥劑量約為500 mg/（kg·d）。均每天1次，連續治療14 d。

1.4" 檢測指標及方法

1.4.1" DAI評定" 造模結束后，記錄體質量、大便性狀。DAI評分=（體質量下降率積分+大便性狀積分+便血情況積分）/3[12]，具體評分細則詳見表1。

1.4.2" 結腸指數測定" 治療結束后，異氟烷呼吸麻醉并處死小鼠，剖腹取結腸，沖洗結腸內容物，測量結腸袋到肛門口的結腸長度，并稱取結腸重量，以重量/長度比值計算結腸指數，結腸指數數值越大表示炎癥程度越高[1]。

1.4.3" HE染色觀察結腸組織病理變化" 冰0.9%氯化鈉溶液清洗結腸，取病變部位進行固定脫水，石蠟包埋，切片后進行HE染色，然后參照改良的結腸黏膜損傷指數（colonic mucosal damage index，CMDI）評分方法進行評價，CMDI評分=炎癥細胞浸潤評分+組織結構損傷評分[13]。

1.4.4" 免疫組織化學染色檢測Caspase-1、GSDMD蛋白水平" 石蠟切片脫蠟水化，行抗原修復，洗滌后，用山羊血清封閉30 min，分別孵育Caspase-1、GSDMD（1∶500）抗體過夜，陰性對照組用PBS孵育過夜，次日洗滌后孵育羊抗兔二抗（1∶500）1 h，洗滌后復染50 μL著色，避光孵育1 min，最后在顯微鏡下觀察，以灰度值/面積計算平均光密度值。

1.4.5" ELISA檢測結腸組織C3a蛋白及血清IL-1β、TNF-α蛋白的表達" 麻醉小鼠后，取結腸組織研磨，經心臟采血，離心機設置3 000 r/min、半徑8 cm、溫度4 ℃，離心15 min后取上清，按C3a、IL-1β、TNF-α的ELISA檢測試劑盒說明書操作，使用酶標儀于450 nm波長測量光密度。

1.4.6" Western blot檢測結腸組織C3aR蛋白的表達水平" 取100 mg結腸組織，按照1∶100的比例加入RIPA裂解液，組織破碎儀90 Hz、45 s循環5次，以破碎結腸組織。冰上裂解20 min后，12 000 r/min、半徑8 cm、溫度4 ℃離心15 min，取上清。參照BCA試劑盒說明書測量蛋白濃度，隨后在樣品中加入上樣緩沖液，水浴鍋100 ℃、15 min，將樣品煮沸。用12%PAGE膠電泳分離不同分子量的蛋白后，將蛋白轉印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入C3aR抗體、β-actin（1∶1 500），4 ℃封閉過夜。TBST洗膜6次后（5 min/次），加入HRP標記二抗，室溫下孵育60 min。采用化學發光法顯影，以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量，實驗重復3次。

1.5" 統計學分析

所有數據均使用SPSS 26.0軟件進行分析，計量資料以“x±s”表示。計量資料符合正態分布和方差齊性，采用單因素方差分析進行組間比較，并使用LSD檢驗進行后續的兩兩比較;不符合正態分布或方差不齊的數據，采用非參數檢驗進行分析。均以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1" 電針對UC模型小鼠體質量、結腸長度、DAI評分、結腸指數的影響

空白組小鼠毛發柔順、行動敏捷、糞便成形;模型組小鼠出現便血、糞便稀溏、蜷縮等癥狀，結腸長度明顯縮短，結腸重量增加，體質量顯著下降、DAI評分和結腸指數明顯增高（Plt;0.01）;電針組和SASP組干預后，小鼠一般情況改善、便血癥狀好轉，行動能力提高，結腸長度均有所恢復，結腸重量下降，體質量增加、DAI評分降低（Plt;0.05），結腸指數顯著降低（Plt;0.01）;電針組和SASP組的體質量、DAI評分和結腸指數比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。詳見圖1。

2.2" 電針對UC模型小鼠結腸組織病理改變的影響

HE染色結果表明，空白組小鼠腸道絨毛及上皮結構完整，未見中性粒細胞浸潤;模型組小鼠出現潰瘍性結腸炎的典型改變，絨毛嚴重脫落壞死，結腸隱窩-絨毛結構破壞缺失，伴有嚴重中性粒細胞浸潤;電針組與SASP組腸上皮形態基本正常，腺體結構形態改善，黏膜下層可見少量炎癥浸潤與輕微水腫。與空白組相比，模型組CMDI評分顯著升高（Plt;0.01）;與模型組相比，電針組與SASP組的CMDI評分均降低（Plt;0.05）;但電針組和SASP組之間CMDI評分比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。詳見圖2。

2.3" 電針對UC模型小鼠結腸C3a/C3aR通路蛋白的影響

與空白組相比，模型組小鼠C3a、C3aR蛋白水平增加（Plt;0.05）;與模型組相比，電針組與SASP組C3a、C3aR蛋白水平降低（Plt;0.05，Plt;0.01）;電針組和SASP組C3a、C3aR蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。詳見圖3。

2.4" 電針對UC模型小鼠結腸細胞焦亡的影響

免疫組織化學結果表明，與空白組相比，模型組小鼠結腸組織Caspase-1、GSDMD蛋白表達顯著增高（Plt;0.01）。與模型組相比，電針組與SASP組小鼠結腸組織Caspase-1、GSDMD蛋白表達減少（Plt;0.05）;電針組和SASP組小鼠結腸組織Caspase-1、GSDMD蛋白比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。詳見圖4。

2.5" 電針對UC模型小鼠炎性因子的影響

與空白組相比，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量顯著增高（Plt;0.01）;與模型組相比，電針組與SASP組TNF-α、IL-1β的含量均降低（Plt;0.05）;電針組和SASP組TNF-α、IL-1β的含量比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。詳見圖5。

3 討論

UC是一種慢性、進行性和復發性的腸道疾病，據統計，我國UC發病率為11.6/10萬，并有持續增加的趨勢，已成為我國重要的公共衛生問題[14]。臨床治療以水楊酸、類固醇激素等藥物為主，雖有一定療效，但存在毒副作用，限制了其長期應用。而電針作為一種傳統醫學與現代醫學相結合的治療手段，對UC的腹痛、便血等癥候群改善方面具有明顯作用[15]。UC歸屬于中醫學“痢疾”“久痢”“腸澼”等范疇，其病機為脾腎虛弱、痰熱濕瘀等邪氣客于腸道[16]。在電針治療中，天樞、足三里、上巨虛、關元作為UC治療的高頻穴位[17]。其中，天樞為大腸募穴，可厚腸理氣;足三里為胃經合穴和胃腑下合穴，可健脾和胃;上巨虛為大腸下合穴，可通腸化滯。課題組前期研究表明，電針治療可以顯著抑制Th17相關特異性因子，調節異常免疫，從而保護腸黏膜屏障[18]。關元為任脈與足三陰之會、小腸募穴，能培元固本、補益精血、調理沖任。在臨床實踐中，四穴共伍可調和腸腑氣血、厚腸止瀉，緩解病癥。

本實驗采用DSS構建UC模型，模擬UC發作期與緩解期的交替病理特點。造模后，UC模型小鼠表現出體質量下降、大便稀溏、糞便隱血陽性等癥狀，同時慢性炎癥導致結腸縮短、水腫增加、結腸指數升高，均提示該模型制備成功。結果表明，與模型組相比，電針組與SASP組小鼠體質量增加、DAI評分降低、結腸指數降低，提示電針與SASP療效相當，均可顯著改善UC癥狀。此外，HE染色結果表明電針對UC具有保護作用，包括炎性細胞浸潤減少、腸黏膜病理形態損傷修復，與課題組既往的研究結果一致[19]。

C3a是一種過敏毒素，由C3裂解產生，已被證實廣泛表達于肺、腸等損傷的黏膜中，在腸道中C3a與腸上皮細胞上的C3aR受體結合，誘導腸上皮細胞焦亡，在慢性UC發生發展中起關鍵作用[20]。研究表明，其內在機制可能與焦亡因子Caspase-1、GSDMD有關。當C3a/C3aR通路被激活后，首先誘導Caspase-1表達增加，然后將GSDMD蛋白裂解到N端片段發生結構域易位，從而形成細胞膜孔，這一過程最終造成腸道屏障損傷，并伴隨IL-1β、TNF-α等炎性因子釋放[21-22]。而抑制C3aR后，以上損傷過程被逆轉[23]。上述研究表明，C3a/C3aR通路可能是誘導UC結腸組織損傷的關鍵靶點。在本研究中，模型組的C3a/C3aR蛋白表達顯著增加，同時誘導腸道中焦亡因子Caspase-1、GSDMD表達上調以及促進炎性因子IL-1β、TNF-α釋放，表明UC模型小鼠處于焦亡和炎癥激活狀態;與模型組相比，電針組與SASP組均顯著逆轉了上述現象，提示電針可能在慢性UC小鼠中通過抑制C3a/C3aR通路介導的焦亡與炎癥狀態，改善UC腸道損傷，發揮保護作用。

本研究結果驗證了臨床經驗要穴治療UC的療效機制，并豐富了電針改善UC慢性炎癥的補體級聯機制，為臨床治療UC提供了實驗理論依據。但本實驗仍存在不足之處，缺乏激動劑、抑制劑組以更全面地驗證電針對C3a/C3aR通路的機制。此外，補體系統作為免疫的重要組成部分，與適應性免疫相互作用，促進UC的發生發展，電針對補體系統與適應性免疫的交互作用仍有待進一步研究。

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〔基金項目〕湖南省自然科學青年基金項基金項目（2022JJ40316）;湖南中醫藥大學學科建設接榜掛帥項目（22JBZ013）;湖南省研究生科研創新一般項目（CX20230818）;湘南學院校級一流本科專業專項改革項目（2021-11）。

〔通信作者〕*易細芹，女，碩士，講師，E-mail：995010568@qq.com;張" 泓，男，博士，二級教授，博士研究生導師，E-mail：zh5381271@sina.com。