利用LC-MS/MS和網絡藥理學探討丹黃明目湯對糖尿病視網膜病變的潛在治療作用

〔摘要〕 目的 探討丹黃明目湯對糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy， DR）的潛在治療作用。方法 采用液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）技術檢測丹黃明目湯入血成分。采用網絡藥理學分析丹黃明目湯的藥效成分及其治療DR的關鍵通路及潛在靶點。將60只大鼠隨機分為未造模組（24只）和造模組（36只）。將24只未造模組大鼠分為空白組（等體積生理鹽水）、空白給藥組（等體積生理鹽水+1.25 g/kg丹黃明目湯浸膏），每組12只。造模組腹腔一次性注射40 mg/kg鏈脲佐菌素（streptozocin， STZ）聯合高脂飼養建立DR模型后，分為模型組（40 mg/kg STZ）、陽性對照組（40 mg/kg STZ+羥苯磺酸鈣膠囊0.09 g/kg）、丹黃明目湯樣本組（40 mg/kg STZ+1.25 g/kg丹黃明目湯浸膏），每組12只，連續干預4周。生化試劑盒檢測超氧化物歧化酶（superoxidedismutase， SOD）和過氧化氫酶（catalase， CAT）的活性;ELISA檢測大鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素（interleukin， IL）-6和血清炎癥因子IL-1β的水平;Western blot檢測大鼠視網膜組織p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase， p38 MAPK）和細胞外調節蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2， ERK1/2）的蛋白表達水平。結果 LC-MS/MS結果表明，丹黃明目湯中共檢測到347個入血化合物，其中前7個含量較高的入血代謝物分別為1，7-bis（4-hydroxyphenyl）heptan-3-one、5-hydroxy-2，2-dimethyl-10-（2-methylbut-3-en-2-yl）pyrano[3，2-g]chromen-8-one、5，7，4'-Trimethoxyflavone、Cillin、Deacetylto mentosideI、canescinA CanescinA、VentiloquinoneI。網絡藥理學結果顯示，丹黃明目湯可能通過調節絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信號通路、緊密連接和趨化因子信號通路等關鍵生物通路的多靶點干預DR。與空白組相比，模型組SOD、CAT水平及p38 MAPK、ERK1/2總蛋白表達降低（Plt;0.05，Plt;0.01），TNF-α、IL-6、IL-1β水平及p38 MAPK、ERK1/2磷酸化水平升高（Plt;0.05，Plt;0.01）。與模型組相比，陽性對照組、空白給藥組和丹黃明目湯樣本組的SOD、CAT、TNF-α、IL-6、IL-1β水平及p38 MAPK、ERK1/2磷酸化水平降低（Plt;0.05，Plt;0.01）。結論 丹黃明目湯可通過調節MAPK信號通路抑制p38 MAPK等因子的表達和活性，促進SOD和CAT的表達，從而減輕DR的炎癥反應、氧化應激、血管損傷，最終起到治療DR的作用。

〔關鍵詞〕 糖尿病視網膜病變;丹黃明目湯;液相色譜-串聯質譜;抗炎;抗氧化;p38絲裂原活化蛋白激酶;超氧化物歧化酶;過氧化氫酶

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.12.018

Exploring the potential therapeutic effects of Danhuang Mingmu Decoction on diabetic retinopathy through LC-MS/MS and network pharmacology

GUO Xinyi1， HUANG Longrong1， GUO Yonghong3， CHEN Xiangdong1，2*， FU Meilin1，2*

1. The First Clinical School of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;"2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hengyang Municipal Hospital of Chinese Medicine， Hengyang， Hunan 421000， China

〔Abstract〕 Objective To explore the potential therapeutic effects of Danhuang Mingmu Decoction （DHMMD） on diabetic retinopathy （DR）. Methods Liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） was employed to identify the absorbed components of DHMMD in the blood. The pharmacological components of DHMMD and their key pathways and potential targets for treating DR were analyzed using network pharmacology. Sixty rats were randomized into a non-model group （n=24） and a model induction group （n=36）. The 24 rats in the non-model group were subdivided into blank group （equal volume of normal saline） and blank treatment group （equal volume of normal saline+DHMMD extract 1.25 g/kg）， with 12 rats in each group. After establishing the model by a single intraperitoneal injection of streptozotocin （STZ） 40 mg/kg combined with a high-fat diet， the 36 rats in the model induction group were subdivided into model group （STZ 40 mg/kg）， positive control group （STZ 40 mg/kg+calcium hydroxyl sulfonate capsule 0.09 g/kg）， and DHMMD sample group （STZ 40 mg/kg+DHMMD extract 1.25 g/kg）， with 12 rats in each group. The intervention lasted for four weeks. The activity of superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT） was determined using biochemical kits. The rat serum levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin （IL）-6， and the inflammatory cytokine IL-1β were measured by ELISA. The protein expression levels of p38 mitogen-activated protein kinase （p38 MAPK） and extracellular regulated protein kinases 1/2 （ERK1/2） in rat retinal tissues were examined by Western blot. Results The LC-MS/MS revealed that a total of 347 compounds of DHMMD were examined in the blood after administration， with the first seven metabolites with higher content checked in the blood being 1，7-bis （4-hydroxyphenyl） heptan-3-one， 5-hydroxy-2，2-dimethyl-10-（2-methylbut-3-en-2-yl） pyrano[3，2-g] chromen-8-one， 5，7，4'-Trimethoxyflavone， Cillin， Deacetylto mentosideI， canescinA CanescinA， and VentiloquinoneI. The network pharmacology revealed that DHMMD might intervene in DR through multi-target regulation of key biological pathways such as the mitogen-activated protein kinase （MAPK） signaling pathway， tight junctions， and chemotaxis factor signaling pathway. Compared with the blank group， the levels of SOD and CAT， as well as the total protein expressions of p38 MAPK and ERK1/2 in the model group decreased （Plt;0.05， Plt;0.01）， while the levels of TNF-α， IL-6， and IL-1β， as well as the phosphorylation levels of p38 MAPK and ERK1/2 increased （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the model group， the levels of SOD， CAT， TNF-α， IL-6， and IL-1β， as well as the phosphorylation levels of p38 MAPK and ERK1/2 decreased in the positive control， blank treatment， and DHMMD sample groups （Plt;0.05， Plt;0.01）. Conclusion DHMMD can inhibit the expression and activity of factors such as p38 MAPK by regulating the MAPK signaling pathway， promote the expression of SOD and CAT， thereby reducing the inflammatory response， oxidative stress， and vascular damage in DR， and ultimately play a therapeutic role in DR.

〔Keywords〕 diabetic retinopathy; Danhuang Mingmu Decoction; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; anti-inflammation; anti-oxidation; p38 mitogen-activated protein kinase; superoxide dismutase; catalase

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy， DR）是糖尿病最常見的并發癥之一，早期發現并干預可預防失明的發生[1]。隨著糖尿病病程的延長，幾乎所有1型糖尿病患者和超過60%的2型糖尿病患者在確診后20年內會發展為DR[2]。盡管目前有多種治療方法，但這些方法都存在局限性。激光治療可能會導致視野縮小和夜視問題;抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）治療雖然有效，但需要定期重復注射，且可能引發眼內炎癥或感染;而糖皮質激素的長期使用可能增加患白內障和青光眼的風險;晚期玻璃體手術有眼內感染風險[3-4]。

中醫藥是中國傳統文化和醫學的重要組成部分，在糖尿病等慢性病的治療中有其獨特的優勢[5-7]。中藥的化學成分復雜，成分之間以及藥物與人體之間的相互作用也極為復雜，探究中藥的藥效物質基礎及有效成分變得尤為重要[8-9]。丹黃明目湯是陳向東教授依據養陰清熱、活血利水的治法研制而成的臨床驗方。本課題組成員通過實驗得出，丹黃明目湯可通過降低VEGF表達、保護血-視網膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）和改善氧化應激反應等改善DR，在長期的臨床實踐中也證實了本方對DR具有明顯的療效[10]。

本研究運用代謝組學對丹黃明目湯入血代謝物的變化進行分析，深入了解其在分子水平上的作用機制，闡明丹黃明目湯在緩解DR方面的復雜代謝作用，以期為DR患者制定更有效的治療策略。

1 材料

1.1" 主要試劑

甲醇、乙腈、甲酸（中國Abiowell公司，批號分別為130100-201903、130103-202203、101414-201902）;鏈脲佐菌素（streptozocin， STZ）（北京克爾慧科技有限公司，批號：242-648-8）;p38抗體、ERK1/2抗體、山羊抗兔二抗（中國Abiowell公司，批號分別為20A231106、09G240126、06G240902）;腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin， IL）-6、IL-1β試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號分別為Q19036889、U21036309、U20036308）。

1.2" 主要儀器

臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H1650R）;全自動酶標洗板機、多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發展有限公司，型號：PW-812、MB-530）;電熱恒溫培養箱（北京市永光明醫療儀器有限公司，型號：DHP-500）;電泳儀、電泳槽、轉膜儀（中國北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C、DYCZ-24DN、DYCZ-40D）;超高效液相、高分辨質譜、離心機（Thermo Fisher Scientific公司，型號：Vanquish、Q Exactive Focus、Heraeus Fresco17）;天平（Sartorius公司，型號：BSA124S-CW）;研磨儀（上海凈信科技有限公司，型號：JXFSTPRP-24）;純水儀（Merck Millipore公司，型號：明澈 D24 UV）;超聲儀（深圳市方奧微電子有限公司，型號：YM-080S）。

1.3" 動物準備

本研究于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗室進行，實驗經過湖南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準（批準號：ZYFY20231210-001）。SPF級雄性SD大鼠72只，2月齡，體質量180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限責任公司提供（動物合格證編號：430727241100059528）。飼養環境：飲食符合清潔級動物的衛生質量要求，環境溫度21～27 ℃，濕度45%～50%，每12小時光暗交換，墊料每2天更換一次。

1.4" 藥物制備

丹黃明目湯藥材：生地黃15 g（批號：HY22081502），茯苓15 g（批號：CK22082302），牡丹皮15 g（批號：MG22082302），丹參15 g（批號：TH22082302），黃連10 g（批號：PR22080503），車前子10 g（批號：HQ22080103），麥冬10 g（批號：HQ22082201），白茅根10 g（批號：20210501）。飲片均購于長沙新林制藥有限公司。

取處方量，加10倍水量浸泡1 h，煎煮6 h，紗布過濾，加8倍水量煎煮4 h，合并2次濾液，真空濃縮干燥，得浸膏。稱取適量浸膏，蒸餾水溶解，即得。使用前，用生理鹽水稀釋至適宜濃度，根據人與大鼠體表面積的等效劑量[11]計算得到灌胃浸膏劑量為1.25 g/kg。

2 方法

2.1" 代謝物提取

2.1.1" 血清樣本制備" 將12只大鼠隨機分為空白血清組（6只）和含藥血清組（6只），分別予以等體積蒸餾水、丹黃明目湯（1.25 g/kg）連續灌胃7 d。采用3%戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，腹主動脈采血，30 ℃自然放置2 h。待血液表面有淡黃色液體滲出時，放入低溫離心機中，在4 ℃以5 000 r/min離心5 min（離心半徑：15 cm）后取上清液。取400 μL空白血清組及含藥血清組血漿，分別加入40 μL鹽酸（2 mol/L），混勻后渦旋振蕩4 min，靜置15 min后加入1.6 mL乙腈，以12 000 r/min離心5 min（離心半徑：8.6 cm）。取1 800 μL上清液，揮干溶劑，加入150 μL甲醇復溶殘渣，0.22 μm微孔濾膜過濾，平行3次，將樣品準備好放入-80 ℃冰箱。

2.1.2" 中藥浸膏樣本制備" 將丹黃明目湯浸膏放于冰上解凍，渦旋30 s后，在4 ℃下以12 000 r/min離心15 min（離心半徑：8.6 cm）。取上清液300 μL轉移至新鮮試管中，加入10 μg/mL內標的提取液1 000 μL，冰水浴超聲處理5 min。樣品在-40 ℃下放置1 h后，在4 ℃下以轉速12 000 r/min離心15 min（離心半徑：8.6 cm）。上清液通過0.22 μm微孔膜仔細過濾，保存于-80 ℃，以待超高效液相色譜-質譜聯用（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UHPLC-MS）分析。

2.2" LC-MS/MS檢測與數據處理

2.2.1" 色譜條件" LC-MS/MS分析采用UHPLC系統，色譜柱規格為1.7 μm×2.1 mm×100 mm。樣品進樣量設置為5 μL，流速設定為0.5 mL/min，流動相為0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈溶液（B）。梯度洗脫程序為：0～11 min，85%～25%A;11～12 min，25%～2%A;12～14 min，2%～2%A;14～14.1 min，2%～85%A;14.1～15 min，85%～85%A;15～16 min，85%～85%A。

2.2.2" 質譜條件" 質譜儀在控制軟件Xcalibur 2.2控制下基于FullScan-ddMS2功能進行一級、二級質譜數據采集。詳細參數如下。鞘氣流量：45 Arb，輔助氣流量：15 Arb，毛細管溫度：400 ℃，全掃描質譜分辨率：70 000，串聯質譜分辨率：17 500，碰撞能量：1/30/45（歸一化碰撞能量模式），噴霧電壓：4.0 kV（正離子模式）或-3.6 kV（負離子模式）。

通過XCMS軟件處理質譜數據。將質譜的原始數據導入XCMS軟件中。進行一系列數據處理步驟，包括保留時間的矯正，峰的識別、提取和積分，峰的對齊。通過利用自建的二級質譜數據庫及相應的裂解規律匹配法，對包含MS/MS數據的峰進行物質鑒定。

2.3" 網絡藥理學分析

本研究利用質譜將中藥入血成分進行代謝組學分析，從生物活性分子數據庫（https：//www.ebi.ac.uk/chembl/）和傳統中醫免疫腫瘤學綜合數據庫（http：// http：//tcmio.xielab.net）查詢代謝物的作用靶點，選取口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18的代謝物。從人類基因綜合數據庫（https：//www.genecards.org）以及中醫藥關聯分析數據庫（http：//www.symmap.org）中獲取DR疾病治療靶點。將入血成分作用靶點、疾病治療靶點的結果以韋恩圖表示。將測得的代謝物差異表達基因向Gene Ontology數據庫的各節點映射，并利用GO（http：//www.geneontology.org/）進行功能富集分析。靶點蛋白按照生物學過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3種獨立的方式進行分類展示。通過KEGG對靶點蛋白顯著富集的代謝通路進行分析，以氣泡圖的形式展示靶點蛋白通路富集分析結果。運用STRING數據庫（string-db.org）構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡分析圖。具體操作如下：首先將靶點蛋白輸入STRING數據庫中，然后選擇Homosapiens（human）選項以查詢PPI關系，進而構建出靶點蛋白的PPI圖。針對檢測入血成分匹配作用靶點前50的入血成分與其作用靶點，構建復方藥材-入血成分-作用靶點-通路-疾病網絡圖。

2.4" 實驗動物驗證

2.4.1" 造模及模型驗證" 將60只SD雄性大鼠隨機分為未造模組（24只）和造模組（36只）。未造模組腹腔注射生理鹽水，造模組腹腔一次性注射40 mg/kg STZ。STZ的配制方法如下：將STZ溶解在0.1 mmol新鮮檸檬酸緩沖液中（pH=4.5），使其濃度為1%。注射STZ后72 h，血糖儀監測大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），FBG檢測前1天，大鼠禁食12 h以上，尾靜脈采血1 mL，用血糖儀檢測并記錄。連續3次FBGgt;16.7 mmol/L，即提示糖尿病大鼠造模成功。采用高脂飼料喂養糖尿病大鼠，造模12周后，熒光素血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA）觀察大鼠眼底出現視網膜出血、血管迂曲、微血管瘤等，表明DR大鼠造模成功[10]。

2.4.2" 動物分組及給藥" 將24只未造模組大鼠分為空白組（等體積生理鹽水）、空白給藥組（等體積生理鹽水+1.25 g/kg丹黃明目湯浸膏），36只造模組大鼠分為模型組（40 mg/kg STZ）、陽性對照組（40 mg/kg STZ+羥苯磺酸鈣膠囊0.09 g/kg）、丹黃明目湯樣本組（40 mg/kg STZ+1.25 g/kg丹黃明目湯浸膏），以上5組，每組12只，共干預4周。

2.4.3" 生化及ELISA試劑盒檢測" 腹主動脈取血，室溫自然凝固30 min，3 000 r/min離心15 min（離心半徑：15 cm），取上清液，按照生化及ELISA試劑盒步驟檢測大鼠視網膜組織SOD、CAT、TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

2.4.4" Western blot檢測VEGF、MAPK信號通路蛋白表達" 取-80 ℃保存的6只大鼠左眼球，分離出視網膜組織，裂解、提取總蛋白，經電泳后轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。在4 ℃下加入一抗p38 MARK（1∶1 000）、ERK1/2（1∶500）和GAPDH（1∶3 000）孵育過夜，清洗。在4 ℃下加入山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育2 h。用ECL發光顯影，觀察拍照，用ImageJ軟件處理分析各條帶灰度值。

2.4.5" 統計學分析" 本實驗所有數據均使用GraphPad Prism 8軟件進行分析。結果以“x±s”表示。兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，3組及以上的統計分析則采用單因素方差分析（ANOVA）配合Tukey事后多重比較檢驗。不滿足正態性時，使用非參數檢驗，Plt;0.05被認為差異有統計學意義。

3 結果

3.1" 血清藥物化學分析結果

共檢測到347個入血化合物，其中前7個含量較高的入血代謝物分別為1，7-bis（4-hydroxyphenyl）heptan-3-one、5-hydroxy-2，2-dimethyl-10-（2-methylbut-3- en-2-yl）pyrano[3，2-g]chromen-8-one、5，7，4'-Trimethoxyflavone、Cillin、Deacetylto ment?osideI、canescinA CanescinA、VentiloquinoneI。詳見表1。

3.2" 入血成分分析結果

空白血清組的代謝物總數為2 944，丹黃明目湯浸膏組代謝物總數為3 048，含藥血清組代謝物的總數為3 058。3組的共有代謝物總數為2 545。空白血清組有7個入血成分，含藥血清組有6個入血成分，丹黃明目湯浸膏組有8個入血成分。詳見表2、圖1。

3.3" 網絡藥理學分析結果

測得丹黃明目湯藥物有效靶點為115個，DR疾病靶點為2 583個，共有73個交集靶點。靶點蛋白的PPI網絡構建分析結果提示，丹黃明目湯的主要作用靶點為p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）和細胞外調節蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、VEGF、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）等。靶點蛋白的GO注釋富集分析結果顯示：BP的富集結果主要為對凋亡信號通路、活性氧物種代謝過程、氧化應激反應的調控及蛋白質、肽酰酪氨酸修飾及磷酸化;CC的富集結果表明，靶點主要在核周、跨膜受體、細胞膜筏及核染色質等區域;MF結果顯示，靶點蛋白主要通過生長因子、輔因子結合，催化氧化還原反應，催化磷酸化、去磷酸化反應等功能調控機體。KEGG結果顯示，丹黃明目湯活性成分可能通過多種癌癥相關及細胞結構與信號傳導通路發揮作用。詳見圖2。

代謝物-靶點-GO通路互作網絡圖及代謝物-靶點-KEGG互作網絡圖顯示，丹黃明目湯的主要代謝物有黃芩苷、黃芩素、黃芪苷、葛根素等黃酮類化合物，靶點主要有p38 MAPK、ERK1/2、NF-κB、VEGF、PI3K/AKT等，主要涉及絲裂原活化蛋白激酶信號通路、緊密連接信號通路、趨化因子信號通路等。詳見圖3。

丹黃明目湯活性成分主要包括槲皮素、山柰酚、黃連堿、丹參酸、多糖類等。作用機制主要為抗氧化作用、抗炎作用、調節細胞信號傳導等。通過STRING數據庫構建的PPI網絡識別出丹黃明目湯活性成分作用的關鍵靶點蛋白，包括TNF-α、IL-6、IL-1β、p38 MAPK、ERK1/2、VEGF等，它們與多個其他蛋白相連，在疾病進程中起核心調控作用。詳見圖4。

3.4" 丹黃明目湯對DR大鼠氧化應激和炎癥反應的影響

3.4.1" 抗氧化酶SOD和CAT的活性" 與空白組相比，模型組的SOD和CAT水平降低（Plt;0.05）。與模型組相比，陽性對照組、空白給藥組和丹黃明目湯樣本組的SOD和CAT水平升高（Plt;0.05）。與陽性對照組相比，空白給藥組、丹黃明目湯樣本組的SOD和CAT水平降低（Plt;0.05）。詳見表3。

3.4.2" 炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達水平" 與空白組相比，模型組的TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高（Plt;0.05）。與模型組相比，陽性對照組、空白給藥組和丹黃明目湯樣本組的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均降低（Plt;0.05）。與陽性對照組相比，空白給藥組、丹黃明目湯樣本組的TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高（Plt;0.05）。詳見表3。

3.5" 丹黃明目湯對DR大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2和ERK1/2的蛋白表達水平的影響

與空白組相比，模型組中p-p38 MAPK、p-ERK1/2的蛋白表達水平上調（Plt;0.01），p38 MAPK、ERK1/2的蛋白表達水平下調（Plt;0.01）。與模型組相比，陽性對照組、空白給藥組、丹黃明目湯樣本組的p-p38 MAPK、p-ERK1/2的蛋白表達水平下調（Plt;0.01），p38 MAPK、ERK1/2的蛋白表達水平上調（Plt;0.01）。詳見表4、圖5。

4 討論

本研究利用XCMS軟件處理LC-MS/MS數據，進行代謝物的檢測和定量。XCMS通過高效的數據預處理，包括峰檢測、峰對齊和峰整合，確保了數據的高質量和可重復性。通過網絡藥理學識別了與丹黃明目湯成分相關的關鍵靶點，如MIF、MAPK1、AURKA、CSNK2A1等，這些蛋白在DR中發揮作用[12]。MAPK1參與細胞生長、分化和死亡的調節，其活化與炎癥、細胞凋亡和血管新生密切相關[13]。AURKA的異常表達會導致細胞增殖和血管異常[14]。MIF是巨噬細胞遷移抑制因子，是一種多功能的細胞因子，在免疫調節、炎癥反應、細胞增殖和炎癥等過程中發揮作用[15]。

GO富集分析結果顯示，丹黃明目湯主要靶點包括ERK1/2、NF-κB、VEGF、PI3K/AKT等。這與炎癥反應和氧化應激調節密切相關[16-18]。KEGG通路分析結果提示，MAPK信號通路、緊密連接和趨化因子信號通路為關鍵通路，這些通路在細胞增殖、炎性反應和細胞黏附中發揮作用，是DR的重要調控路徑。

p38 MAPK在調控DR過程中扮演非常重要的角色。DR與氧化應激、炎癥和血管生成密切相關[19-20]。有研究表明，糖尿病引發的視網膜病變常常伴隨氧化應激的產生，導致p38 MAPK信號通路的活化，而p38 MAPK的激活會促進ROS的生成，進一步加重細胞損傷和功能障礙[21]。本研究結果提示，丹黃明目湯能顯著提升SOD、CAT抗氧化酶活性，減輕DR所誘導的氧化應激。這與丹參注射液聯合羥苯磺酸鈣通過上調抗氧化酶CAT和SOD的活性抑制DR所導致氧化應激的研究[22]結果一致。p38 MAPK是炎癥信號通路的重要組成部分，p38 MAPK被激活時，會促進TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達，進一步促進視網膜內的炎癥反應，導致微血管病變和視網膜損傷[21，23]。在本研究中，DR大鼠血清中促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高，丹黃明目湯能有效降低這些促炎細胞因子的表達水平，抑制炎癥反應。這表明丹黃明目湯可能通過抑制p38

MAPK信號通路的激活從而發揮抗炎、抗氧化的作用。研究報道，p38 MAPK可以促進VEGF的表達，進而促進新生血管的形成，而新生血管較為脆弱，容易導致出血和視網膜水腫[21]。丹黃明目湯可以通過抑制DR大鼠視網膜組織p38 MAPK、ERK1/2的表達調控血管新生，這與組胺受體4通過調控p38 MAPK軸緩解糖尿病視網膜色素上皮中促VEGF和抗VEGF之間的不平衡研究[24]結果相類似。這表明丹黃明目湯可通過調節p38 MAPK信號通路，發揮抗炎、抗氧化、保護細胞和調節血管生成的作用。

綜上所述，本研究探究了丹黃明目湯對DR的潛在治療作用。通過質譜檢測分析了丹黃明目湯入血的主要成分。對差異代謝物結果進行GO和KEGG分析，發現丹黃明目湯可以通過調控MAPK信號通路、緊密連接完整性和趨化因子信號等多條信號通路影響DR的進程。動物實驗研究結果發現，丹黃明目湯可以通過抑制p38-MAPK信號通路緩解DR所導致的氧化應激、炎癥以及血管生成增加。但由于選用的數據庫有限，篩選方式及動物實驗存在局限性，無法完全闡明丹黃明目湯的作用機制，在接下來的研究中，本課題組將通過進一步的體外實驗以及臨床實驗深入探究丹黃明目湯發揮藥效的具體分子機制，以期為DR的治療提供新的思路。

參考文獻

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〔基金項目〕國家自然科學基金項目（82374525）;湖南省中醫藥科研計劃項目（C2022003）;湖南省眼科疾病（中醫）臨床醫學研究中心（2023SK4038）;湖南省自然科學基金項目（2021JJ30520）;湖南中醫藥大學校級科研項目（2023CX39）。

〔通信作者〕*陳向東，男，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：564259166@qq.com;付美林，女，碩士，副教授，E-mail：neffy100@126.com。