雞marco穩轉巨噬細胞系的構建與鑒定

摘 要： 旨在通過慢病毒表達系統構建穩定表達marco基因的HD11細胞系，為研究marco基因的抗病毒免疫功能提供重要工具。首先，以HD11細胞為模板，通過PCR擴增獲得marco基因編碼區序列，并將其克隆到慢病毒載體上，獲得重組慢病毒質粒pLV3-CMV-MCS-Puro-marco；其次，利用四質粒慢病毒包裝系統將重組質粒pLV3-CMV-MCS-Puro-marco與輔助質粒pLP1、pLP2、pMD2.G共轉染至293T細胞進行慢病毒包裝，構建含雞marco基因的重組慢病毒。最后，用包裝成功的重組慢病毒感染HD11細胞72 h后進行嘌呤霉素（2 μg·mL-1）篩選，通過RT-qPCR檢測marco基因表達后最終確認獲得穩定表達雞marco基因的HD11細胞系。本研究成功構建了穩定表達雞marco基因的HD11細胞系，為后續深入研究marco基因的功能提供了重要基礎。

關鍵詞： marco細胞系；穩定表達；慢病毒

中圖分類號：S831.2

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5310-07

收稿日期：2024-05-13

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金項目（CX（21）1001）；國家自然科學基金（31602032）

作者簡介：郭 旺（1999-），男，河南西平人，碩士生，主要從事家禽遺傳資源的評價與利用，E-mail： 2715857896@qq.con

*通信作者：徐 琪，主要從事家禽遺傳資源的評價與利用，E-mail：xuqi@yzu.edu.cn

Construction and Identification of the Chicken marco-stable Macrophage Cell Line

GUO" Wang， PENG" Guangzhong， HUANG" Hongao， WU" Huixian， HU" Xuming， ZHANG" Yu， ZHANG" Yang， CHEN" Guohong， XU" Qi*

（College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， "China）

Abstract：" The study aimed to establish the HD11 cell line with a stable expression of the marco gene through the lentivirus expression system， providing a crucial tool for investigating the antiviral immune function of the marco gene. Initially， the marco gene coding sequence was amplified by PCR using HD11 cells as a template and cloned into the lentiviral vector to generate the recombinant lentiviral plasmid pLV3-CMV-MCS-Puro-marco. Subsequently， the recombinant plasmid pLV3-CMV-MCS-Puro-marco was co-transfected with helper plasmids pLP1， pLP2， and pMD2.G into 293T cells using a tetra-plasmid lentivirus packaging system， resulting in the construction of recombinant lentivirus carrying the chicken marco gene. The successfully packaged recombinant lentivirus was then used to infect HD11 cells， followed by puromycin （2 μg·mL-1） selection for 72 h. The stable expression of the chicken marco gene in the HD11 cell line was confirmed by RT-qPCR analysis， indicating the successful establishment of a stable cell line expressing the chicken marco gene. This study successfully established a stable HD11 cell line expressing the chicken marco gene， providing a crucial basis for further exploration of the marco gene’s function.

Key words： marco cell line; stable expression; lentivirus

*Corresponding author： XU Qi， E-mail：xuqi@yzu.edu.cn

巨噬細胞（macrophages）具有抵御病原體攻擊、清除代謝廢物以及幫助身體組織進行修復等多種生物學功能，因此在維持宿主生理環境穩態上起到了不可忽視的作用［1-2］。值得注意的是，巨噬細胞能識別并清除對機體有害的內源性及外源性物質，從而充當“清除劑”角色［3-4］。清道夫受體（scavenger receptors， SRs）通常會在巨噬細胞表面大量表達，它們可以直接與革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞壁成分結合產生相互作用［5-6］。根據它們分子構成中不同的結構域，清道夫受體被分成了8個類別，即A到H型。其中，膠原樣結構巨噬細胞受體（macrophage receptor with collagenous structure， marco）屬于A型清道夫受體家族［7］。

巨噬細胞受體marco作為一種在細胞表面表達的清道夫受體A類蛋白，在先天性抗微生物免疫系統中扮演著重要的角色［8］。巨噬細胞作為免疫系統的一部分，能夠吞噬和消化病原體，起到清除感染的作用。而marco作為巨噬細胞上的受體，具有重要的調控作用。marco是巨噬細胞重要的先天性免疫活化標志物，已被證明參與各種細菌病原體的識別。抑制marco介導的先天性免疫增強了對細菌二次感染的易感性［9］。近年來，marco被證明參與病毒識別、感染和復制等過程［10-15］。保持marco的正常功能對于免疫系統的有效響應至關重要。因此，了解并研究marco可以幫助我們深入了解免疫系統的功能和病原微生物的感染機制，為開發新的免疫治療方法提供基礎。

慢病毒（lentivirus）包裝系統可用于構建穩定表達細胞系來研究某種宿主因子的功能及其對病毒增殖的影響［16-17］。本研究使用慢病毒包裝技術構建穩定表達marco的HD11細胞系。本試驗結果可以為深入研究marco在抗病毒免疫中的作用機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、細胞和試劑

慢病毒包裝質粒pLV3-CMV-MCS-Puro載體、輔助質粒pLP1、pLP2、pMD2.G和雞巨噬細胞（HD11）均由本實驗室保存。RNA-easy Isolation Reagent，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix和膠回收試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。大腸桿菌DH5α感受態和質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。MTT試劑盒和嘌呤霉素購自北京索萊寶科技有限公司。SuperKineTM超敏型細胞增殖檢測試劑（CCK8）購自亞科因生物技術有限公司。

1.2 引物設計與合成

在NCBI中查詢marco基因序列（Gene ID：395488），設計特異性引物marco-F：5′-cctccatagaa-gattATGAAAATTAAGGACAGATGCA-3′（小寫字母為XbaI酶切位點）和marco-R：5′-tccttcgcggccgcgTCAGACACACTCCACGCCGGCG-3′（小寫字母為BamHⅠ酶切位點）。上述引物購自南京擎科生物科技有限公司。

1.3 pLV3-CMV-MCS-Puro-marco重組質粒的構建及鑒定

使用RNA-easy Isolation Reagent提取HD11細胞的總RNA，并將其反轉錄為cDNA。以該cDNA為模板，用特異性引物擴增marco的基因片段。將載體pLV3-CMV-MCS-Puro經過雙酶切后進行膠回收，與marco擴增產物通過重組酶Exnase II進行同源重組連接。按照常規方法將連接產物轉化進DH5α感受態細胞中，將菌液PCR陽性菌液挑選出來并送往公司測序，擴大培養測序正確的菌液并提取質粒，將提取的質粒保存于-20℃冰箱。并將測序正確的重組慢病毒質粒命名為pLV3-CMV-MCS-Puro-marco。

1.4 嘌呤霉素最適濃度選擇

通過MTT和CCK-8試驗可以確定嘌呤霉素（0、 0.5、 1、 2 、 4、6、 8、 10 μg·mL-1）的最佳選擇濃度。結合MTT和CCK-8試驗的結果，綜合評估細胞存活率和活力，并確定嘌呤霉素的最適濃度選擇。

1.5 慢病毒包裝

使用轉染試劑將重組慢病毒質粒pLV3-CMV-MCS-Puro-marco及包裝輔助質粒pLP1、pLP2、pMD2.G共轉染至293T細胞。轉染72 h后收集病毒上清液，保存在-80℃。

1.6 HD11-marco穩轉細胞系的篩選

將“1.5”中72 h后收集的慢病毒液感染HD11細胞。感染成功后添加嘌呤霉素篩選。每隔2 d更換一次新鮮的含有嘌呤霉素的培養液，直至細胞不出現死亡后停止篩選。

1.7 嘌呤霉素篩選后的鑒定

將通過嘌呤霉素篩選后的細胞進行RT-qPCR鑒定，在基因水平檢測marco的表達情況，從而證明雞marco穩轉巨噬細胞系的建立。

1.8 統計分析

用SPSS 軟件（version 20.0）對試驗數據進行顯著性統計分析并以“Mean±SEM”表示，然后通過Excel GraphPad （Prism 6）軟件進行作圖。其中，*表示Plt;0.05，差異顯著；**表示Plt;0.01，差異極顯著。

2 結 果

2.1 成功構建pLV3-CMV-MCS-Puro-marco慢病毒載體

以HD11細胞為模板，通過PCR擴增獲得marco基因編碼區序列，擴增結果如圖1A所示，獲得一條1 430 bp大小的條帶，與預期一致。將marco基因的PCR擴增產物回收并與載體質粒pLV3-CMV-MCS-Puro進行重組，重組產物轉化進DH5α感受態細胞。提取質粒，重組質粒pLV3-CMV-MCS-Puro-marco經Xha I、BamH I雙酶切鑒定顯示，可酶切出一條約1 430 bp大小的目的片段和一條約7 354 bp大小的載體片段，如圖1B所示。將構建好的質粒進行測序，測序結果與GenBank報道的marco序列一致，證明質粒構建成功，質粒圖譜如圖1C所示。

2.2 嘌呤霉素最適濃度的選擇

通過MTT和CCK-8試驗，選擇HD11細胞篩選最佳的嘌呤霉素使用濃度。使用含有不同濃度嘌呤霉素（0、0.5、1、2、4、6、8、10 μg·mL-1）的培養基培養HD11細胞，培養48 h后，對培養基顏色和細胞密度進行拍照觀察，結果如圖2A和2B所示，隨著嘌呤霉素濃度的增加，培養基顏色從黃色逐漸變紅，細胞密度逐漸下降，說明細胞增殖和酸性代謝產物逐漸減少。并通過MTT和CCK-8試驗對細胞活性進行測定，結果如圖2C和2D所示。通過MTT和CCK-8試驗可以明顯的觀察到隨著嘌呤霉素的濃度增加，細胞存活率逐漸下降，當嘌呤霉素濃度達到2 μg·mL-1以上時，細胞出現大量死亡。綜上，HD11細胞嘌呤霉素篩選的最佳濃度是2 μg·mL-1。

2.3 慢病毒包裝與鑒定

將重組慢病毒質粒pLV3-CMV-MCS-Puro-marco以及對照組質粒pLV3-EGFP分別與pLP1、pLP2、pMD2.G 三個輔助質粒共轉染進293T細胞。結果如圖3A所示，pLV3-EGFP質粒和慢病毒包裝質粒共轉染48 h后，可以明顯看到對照組的細胞狀態良好且熒光強，說明慢病毒載體和輔助質粒成功轉染進293T細胞中。收集轉染72 h后的慢病毒上清液，將收集的慢病毒上清液再次感染293T細胞，以確定慢病毒包裝是否成功。結果如圖3B所示，pLV3-EGFP慢病毒感染293T細胞24 h后，細胞狀態良好并且出現了弱熒光，證明慢病毒包裝成功。慢病毒感染48 h后，收集細胞，RT-qPCR檢測marco的表達水平，結果如圖3C所示，感染marco慢病毒顆粒的293T細胞中marco基因高表達，再次證明慢病毒包裝成功。

2.4 轉染marco HD11細胞系的篩選及鑒定

將收集的慢病毒上清液感染HD11細胞，在48 h后用熒光顯微鏡拍照，結果如圖4A所示，對照組出現微弱熒光，證明慢病毒轉染成功。通過“2.2”中的MTT和CCK-8的試驗結果，選擇2 μg·mL-1的嘌呤霉素培養基對轉染72 h后的細胞進行篩選。連續用嘌呤霉素篩選1周后，結果如圖4B所示，對照組出現強烈的熒光現象，說明我們成功構建了marco穩轉的HD11細胞。篩選結束后，收集穩轉marco的細胞進行RT-qPCR鑒定，結果如圖4C所示，與對照組相比，雞marco基因在慢病毒穩轉的HD11細胞系中的表達水平顯著增加。結果都證明成功構建了穩定表達marco的HD11細胞系。

3 討 論

慢病毒包裝是目前應用最廣泛的構建穩定表達外源蛋白細胞系的方法，該病毒包裝系統的基本原理是將攜帶目的基因的慢病毒載體整合進宿主細胞基因組中，以實現目的基因在宿主細胞中長久表達。慢病毒屬于逆轉錄病毒的一種，同時也屬于復制缺陷型病毒，具有穩定、高效等特點，是細胞分子生物學上用于篩選穩定細胞系的理想工具［18-20］。近年來，隨著技術的進步，慢病毒系統的設計和應用不斷優化，特別是在提高基因傳遞效率和表達水平方面［21］。例如，改進的第三代慢病毒包裝系統已被廣泛應用于基因治療和細胞治療研究中，其在基因傳遞效率和安全性方面表現優越。這種系統通過改良的包裝質粒和增強型的啟動子，顯著提高了目的基因的轉導效率，為研究和臨床應用提供了強有力的工具［22-23］。

巨噬細胞作為免疫系統的關鍵組成部分，其受體在免疫反應、病原體識別和免疫調控中發揮著重要作用。近年來，對巨噬細胞受體的研究揭示了其復雜的生物學功能和潛在的治療應用。特別是marco作為清道夫受體的一種，其在免疫調節和疾病中的重要作用越來越受到關注。最新研究發現，marco在病原體識別中的功能超出了傳統認識。marco受體不僅在清除細菌和病毒中發揮作用，還涉及到調節免疫應答和炎癥反應。例如，marco能夠識別和結合多種病原體，包括細菌的細胞壁成分和某些病毒的外膜蛋白。這一功能對于免疫系統的初步反應至關重要，尤其是在快速清除侵入病原體的過程中［24］。近年來的研究進一步揭示了marco在慢性炎癥性疾病中的作用。研究發現，marco在動脈粥樣硬化和糖尿病等慢性炎癥疾病中表現出異常高的表達水平。這可能是因為marco在清除細菌或其他病原體時導致了過度的炎癥反應，從而促進了疾病的發生和進展。例如，在動脈粥樣硬化中，marco的過表達可能促進了巨噬細胞的激活和炎癥因子的釋放，進一步加劇了血管內的炎癥［25-26］。此外，marco在腫瘤微環境中的作用也引起了廣泛關注。研究表明，marco的表達水平與腫瘤的進展和免疫逃逸機制密切相關。特別是在某些類型的腫瘤中，marco的高表達與腫瘤細胞的免疫逃逸能力增強相關，可能通過抑制抗腫瘤免疫反應來促進腫瘤的生長和轉移。針對marco的免疫治療研究正在逐步展開，以期通過靶向marco來恢復或增強抗腫瘤免疫反應［27-28］。

本研究通過慢病毒表達系統成功構建了過表達marco的HD11細胞系，并驗證了該細胞系中marco在mRNA水平上的表達情況。穩定表達marco的HD11細胞系的構建對于深入了解marco在免疫反應、病原體感染和免疫調控中的作用機制具有重要的意義。

4 結 論

本研究利用慢病毒包裝技術構建了雞巨噬細胞marco基因過表達方法，篩選獲得了marco基因過表達的雞巨噬細胞細胞株，為marco基因功能的研究提供了細胞模型。

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（編輯 郭云雁）