黃瓜霜霉病菌侵染黃瓜葉片染色方法的篩選及應(yīng)用

摘" " 要：黃瓜霜霉病是黃瓜生產(chǎn)中常見的真菌病害，其危害嚴(yán)重，為了快速準(zhǔn)確地識別黃瓜葉片中黃瓜霜霉病菌，提高病害診斷的準(zhǔn)確性和及時性，本研究比較了考馬斯亮藍(lán)R-250染液、考馬斯亮藍(lán)G-250染液、臺盼藍(lán)染色液、甲基藍(lán)染色液、乳酸酚棉藍(lán)染色液5種染色方法對黃瓜霜霉病菌不同侵染階段的原位觀察染色效果。結(jié)果顯示，考馬斯亮藍(lán)G-250染液在20 min內(nèi)完成染色，不易給黃瓜組織染色，易洗去浮色，在對黃瓜霜霉病菌的染色觀察中更穩(wěn)定，能較好地觀察到黃瓜霜霉菌各時期形態(tài)特征。綜上，本研究建立了一種著色效果好、試驗方法簡單的黃瓜葉片中黃瓜霜霉病菌的染色方法，為觀察黃瓜霜霉病菌的侵染結(jié)構(gòu)提供了技術(shù)方法，為黃瓜霜霉病的預(yù)測預(yù)報提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃瓜霜霉病菌；染色方法；組織透明；原位觀察

中圖分類號：S432.4" " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " " "DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.11.006

Screening and Application of Stains for Cucumber Leaves Infected by Cucumber Downy Mildew Pathogen

LI Yaqi1， WANG Yong2， YANG Lijuan2， ZENG Wenjia1， LIU Huiqin1， GAO Wei2

（1. College of Horticulture and Landscape， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300381， China; 2. Plant protection research institute， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300384， China）

Abstract：Cucumber downy mildew is a prevalent fungal disease in cucumber production with severe impacts. To rapidly and accurately identify the downy mildew pathogen on cucumber leaves and enhance the precision and timeliness of disease diagnosis， this study compared the in-situ staining effects of five staining methods—Coomassie Brilliant Blue R-250， Coomassie Brilliant Blue G-250， Trypan Blue， Methyl Blue， and Lactophenol Cotton Blue—on different infection stages of the cucumber downy mildew pathogen. The results indicated that Coomassie Brilliant Blue G-250 completed staining within 20 minutes， did not readily stain cucumber tissue， and allowed easy removal of excess dye. It demonstrated greater stability in staining observations of cucumber downy mildew， providing better visualization of morphological characteristics at various stages of the pathogen. In conclusion， this study established a staining method for cucumber downy mildew pathogen in cucumber leaves that offers excellent staining effects and a simplified experimental procedure. It provides a technical approach for observing the infection structures of cucumber downy mildew and theoretical support for forecasting and early warning of the disease.

Key words： cucumber downy mildew pathogen ; staining method ; tissue clearing ; in situ observation

黃瓜霜霉病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的真菌病害，是一種由古巴假霜霉菌（Pseudoperonospora cubensis Berk.amp; Curt.）侵染所引起的世界性病害，黃瓜霜霉病菌是典型的專性寄生菌，只存活于田間或室內(nèi)的活體寄主上[1-3]，屬于單年流行病害[4]。保護(hù)地栽培是我國黃瓜種植的主要方式，其密閉性和黃瓜連茬種植的周期性，為黃瓜霜霉病的發(fā)生、流行等提供了有利條件[5-7]。黃瓜霜霉病菌主要靠氣流傳播，也可通過風(fēng)雨、農(nóng)器具、昆蟲等傳播[8-9]，發(fā)病嚴(yán)重時，1周內(nèi)黃瓜全部枯死，造成絕產(chǎn)。

黃瓜霜霉病主要以化學(xué)防治為主，但該病原菌極易產(chǎn)生抗藥性，病害傳播擴(kuò)散快，一旦發(fā)生難以有效防控，并且大量使用農(nóng)藥極易造成嚴(yán)重的環(huán)境污染及農(nóng)殘超標(biāo)等危害[10]。建立黃瓜霜霉病監(jiān)測預(yù)警系統(tǒng)，在黃瓜霜霉病發(fā)生前及時進(jìn)行有效預(yù)防，是控制黃瓜霜霉病發(fā)生的有效措施[11-12]。依據(jù)黃瓜生長溫濕度條件與病害發(fā)生間的關(guān)系建立的病害發(fā)生預(yù)測模型，因為只單一考慮環(huán)境因素建模，所以在病害的預(yù)測中會有較大誤差[13-14]。而依據(jù)病害癥狀的計算機(jī)視覺識別技術(shù)只能在病害發(fā)生后進(jìn)行判別，不能達(dá)到早期監(jiān)測和提前防治病害的作用[15-16]。因此，明確黃瓜霜霉病菌侵染后，黃瓜葉片組織內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)變化，準(zhǔn)確描述病害侵染時間序列過程，可為建立更精確的黃瓜霜霉病菌監(jiān)測預(yù)警模型奠定基礎(chǔ)。

探索并優(yōu)化真菌染色技術(shù)，對于精確觀察植物組織內(nèi)部真菌的顯微結(jié)構(gòu)特征及其與寄主組織相互作用的侵染動態(tài)具有至關(guān)重要作用[17]。關(guān)于黃瓜霜霉病的研究報道，主要集中在病原菌生物學(xué)特性、基因表達(dá)調(diào)控、防治藥劑篩選等方面，對黃瓜霜霉病菌不同發(fā)病階段的葉片組織染色效果進(jìn)行比較的報道較少。朱書生等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Calcofluor、苯胺藍(lán)、熒光素鈉3種熒光染色方法在合適的染液濃度和pH值條件下，均可對孢子囊、休止孢、芽管、孢囊梗等寄主組織外部菌體進(jìn)行原位染色，曲利苯蘭組織透明染色法能觀察黃瓜霜霉病菌的整個生長發(fā)育階段，但該方法更適用于胞間菌絲及吸器的染色。為了清晰快捷地找出黃瓜霜霉病菌形態(tài)，不同染色方法的選擇和應(yīng)用備受關(guān)注。前人的報道中，通常選用考馬斯亮藍(lán)、臺盼藍(lán)、甲基藍(lán)等染色液進(jìn)行病原菌染色觀察，因此，本研究比較了考馬斯亮藍(lán)R-250染液、考馬斯亮藍(lán)G-250染液、臺盼藍(lán)染色液、甲基藍(lán)染色液、乳酸酚棉藍(lán)染色液5種染色方法應(yīng)用于葉片組織內(nèi)黃瓜霜霉病不同發(fā)病階段的觀察效果，以便篩選出準(zhǔn)確、快速、適合不同發(fā)育階段的染色方法，為黃瓜霜霉病菌的形態(tài)鑒定提供依據(jù)，同時為研究黃瓜霜霉病的發(fā)生規(guī)律和早期監(jiān)測預(yù)警提供理論支持，為開展有效防治及殺菌劑的作用機(jī)理研究提供有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試品種 感病黃瓜品種長春密刺，天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所種苗病害室保存，長春密刺品種特征為抗枯萎病，不抗霜霉病，耐寒性較強(qiáng)，喜肥。

1.1.2 供試黃瓜霜霉病菌 黃瓜霜霉病發(fā)病葉片，采自天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所武清區(qū)創(chuàng)新基地（116.97°E，39.43°N）。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃瓜霜霉病菌孢子懸浮液的制備 采摘發(fā)病的黃瓜霜霉病葉片后，用無菌水沖洗干凈葉片上老熟的孢子囊和浮塵，瀝干水分至拿起葉片不再有水滴落。將處理好的葉片裝入自封袋中，放于25 ℃人工氣候箱中，黑暗高濕的條件下培養(yǎng)24 h，保證有新的黃瓜霜霉病菌孢子囊長出。取出葉片，挑選長出新鮮霉層的葉片，用小毛刷將霉層刷到盛有無菌蒸餾水的燒杯中，配置成孢子囊懸浮液，濃度為40×倍光學(xué)顯微鏡下觀察到20～25個孢子囊。

1.2.2 黃瓜霜霉病病原菌接種 將長春密刺黃瓜種子在水中浸泡4～6 h，置于鋪有1層濾紙和2層紗布的發(fā)芽盒中，將水瀝干，上面再覆1層紗布，遮光處理，置于25 ℃培養(yǎng)箱過夜。發(fā)芽后，播種在育苗盤中，待兩葉一心時，將上述配置好的孢子囊懸浮液均勻噴霧到黃瓜葉片上，放于變溫培養(yǎng)箱中，先在20 ℃條件下培養(yǎng)12 h，再在25 ℃條件下培養(yǎng)12 h，使用加濕器保濕，分別于接種0、4、6、12、24、36、48、60、72 h后取黃瓜葉片，打成6 mm葉盤脫色觀察。

1.2.3 染色劑篩選 在燒杯中將無水乙醇和冰醋酸1∶1混合均勻，分裝于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 mL混合液。將6 mm 葉盤放置在盛有等量的酒精（95 %）和冰醋酸混合液的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中固定24 h ，然后置于飽和的水合三氯乙醛溶液中（1～3 h），待葉片組織透明后取出，用無菌蒸餾水沖洗表面殘留液體，分別放入考馬斯亮藍(lán)R-250染液、考馬斯亮藍(lán)G-250染液、臺盼藍(lán)染色液、甲基藍(lán)染色液、乳酸酚棉藍(lán)染色液5種染色液中進(jìn)行染色處理，觀察黃瓜霜霉病菌染色效果。各處理設(shè)置如下：處理1，將葉盤置于考馬斯亮藍(lán)R-250染液中進(jìn)行染色觀察，染色時間為20 min，染色結(jié)束后，將染色后的葉片置于無菌蒸餾水中漂洗，洗去表面浮色后，以水作為浮載劑，光學(xué)顯微鏡觀察；處理2，將葉盤置于考馬斯亮藍(lán)G-250染液中進(jìn)行染色觀察，染色時間為20 min，染色結(jié)束后，將染色后的葉片置于無菌蒸餾水中漂洗，洗去表面浮色后，以水作為浮載劑，光學(xué)顯微鏡觀察；處理3，將葉盤置于甲基藍(lán)染色液中進(jìn)行染色觀察，染色時間為20 min，染色結(jié)束后，將染色后的葉片置于無菌蒸餾水中漂洗，洗去表面浮色后，以水作為浮載劑，光學(xué)顯微鏡觀察；處理4，將葉盤置于臺盼藍(lán)染色液中進(jìn)行染色觀察，染色時間為1 h，染色結(jié)束后，將染色后的葉片置于無菌蒸餾水中漂洗，洗去表面浮色后，以水作為浮載劑，光學(xué)顯微鏡觀察；處理5，將葉盤置于乳酸酚棉藍(lán)染色液中進(jìn)行染色觀察，染色時間為20 min，染色結(jié)束后，將染色后的葉片置于無菌蒸餾水中漂洗，洗去表面浮色后，以水作為浮載劑，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.4 染色劑不同染色時間效果觀察 選擇考馬斯亮藍(lán)G-250作為最優(yōu)染色劑，設(shè)置染色時長為10、20、30、40 min，染色結(jié)束后，將染色后的葉片置于無菌蒸餾水中漂洗，洗去表面浮色后，以水做浮載劑，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.5 考馬斯亮藍(lán)G-250對黃瓜霜霉病菌發(fā)育過程的觀察 選擇考馬斯亮藍(lán)G-250作為最優(yōu)染色劑，設(shè)置染色時長為 20 min，對黃瓜霜霉病菌侵染葉片的發(fā)育過程進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色劑篩選

2.1.1 考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色觀察 考馬斯亮藍(lán)R-250染液通常用于SDS-PAGE電泳中微量蛋白質(zhì)的染色[19]，本研究將其應(yīng)用于黃瓜霜霉病菌的染色觀察。在對黃瓜霜霉病菌染色中，考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色較快，可在20 min內(nèi)著色，染色后的黃瓜霜霉病菌呈藍(lán)色，0～4 h可觀察到芽管，4～6 h芽管伸長形成侵染菌絲，6～8 h侵染菌絲繼續(xù)生長形成分生孢子梗。各時間均可觀察到被染成藍(lán)色的葉片組織，說明考馬斯亮藍(lán)R-250染液在原位觀察黃瓜霜霉病菌時，易將黃瓜葉片組織染色且不易洗去，在光學(xué)顯微鏡中觀察時，背景色較復(fù)雜但能明顯區(qū)分黃瓜霜霉病菌各階段，芽管、侵染菌絲時期清晰可見，分生孢子梗時期邊緣不易著色（圖1）。

2.1.2 考馬斯亮藍(lán)G-250染液染色觀察 考馬斯亮藍(lán)G-250染液通常用于SDS-PAGE電泳中微量蛋白質(zhì)的染色[19]，本研究將其應(yīng)用于黃瓜霜霉病菌的染色中。考馬斯亮藍(lán)G-250染液可在20 min內(nèi)著色，并且著色效果優(yōu)于考馬斯亮藍(lán)R-250染液。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)G-250染液對黃瓜霜霉病菌染色后，0～4 h觀察到芽管，4～6 h芽管伸長形成侵染菌絲，6～8 h侵染菌絲繼續(xù)生長形成分生孢子梗。染色后的菌絲呈藍(lán)綠色，并且染色后黃瓜葉片組織易洗去浮色幾乎不被染色，染色后能夠清晰地觀察到芽管、侵染菌絲、分生孢子梗等（圖2）。

2.1.3 臺盼藍(lán)染色液染色觀察 臺盼藍(lán)染色液染色時間較長，可在1 h內(nèi)使黃瓜霜霉病菌著色，染色后的菌絲呈藍(lán)色，0～4 h可觀察到芽管，4～6 h芽管伸長形成侵染菌絲，6～8 h侵染菌絲繼續(xù)生長形成分生孢子梗。染色后的黃瓜葉片組織常表現(xiàn)出染色不均，黃瓜葉片組織易被染色且不易洗去浮色，在光學(xué)顯微鏡中觀察時，背景色復(fù)雜不易觀察，黃瓜葉片上的葉毛也易被染色，但使用臺盼藍(lán)染色液染色后黃瓜霜霉病菌各時期均可被染色觀察，但相比于其他染液，染色時間較長，染色效果不理想（圖3）。

2.1.4 甲基藍(lán)染色液染色觀察 甲基藍(lán)染色液也可在20 min內(nèi)著色，染色后的黃瓜霜霉病菌呈深藍(lán)色，在顯微鏡下清晰可見，染色后有助于觀察和分析菌絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)。使用甲基藍(lán)染液染色后，0～4 h可觀察到芽管，4～6 h芽管伸長形成侵染菌絲，6～8 h侵染菌絲繼續(xù)生長形成分生孢子梗。但甲基藍(lán)染色液染色均勻性差，和臺盼藍(lán)染色液類似，染色后黃瓜葉片組織背景顏色復(fù)雜，染色增加，黃瓜葉片組織易被染色且不易洗去浮色，但黃瓜霜霉病菌各時期均可被染色（圖4）。

2.1.5 乳酸酚棉藍(lán)染色液染色觀察 乳酸酚棉藍(lán)染色液染液也可在20 min內(nèi)著色，染色后的菌絲呈藍(lán)色。使用乳酸酚棉藍(lán)染色液染色后，0～4 h可觀察到芽管，4～6 h芽管伸長形成侵染菌絲，6～8 h侵染菌絲繼續(xù)生長形成分生孢子梗。乳酸酚棉藍(lán)染色液可使黃瓜霜霉病菌形態(tài)保持較好，不發(fā)生變形，但黃瓜葉片組織易被染色且不易洗去浮色，黃瓜霜霉病菌菌絲初期可著色，但隨著菌絲生長，出現(xiàn)染色不均勻的現(xiàn)象，隨著染色時間的增長，背景色增加，更不易于觀察（圖5）。

2.2 考馬斯亮藍(lán)G-250不同染色時間觀察

使用考馬斯亮藍(lán)G-250對黃瓜霜霉病發(fā)病葉片進(jìn)行不同染色時間觀察發(fā)現(xiàn)，染色時間為10 min時，葉片表面開始呈現(xiàn)微弱的藍(lán)色，但病菌侵染區(qū)域與正常區(qū)域的對比度不明顯。部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，難以清晰分辨。染色時間為20 min時，葉片整體呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色，病菌侵染區(qū)域與正常區(qū)域的界限清晰可辨。細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，能夠觀察到病菌菌絲和孢子。染色時間為30 min時，染色效果與20 min相似，但藍(lán)色更深，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)因染色過深而顯得模糊。染色時間為40 min時，葉片整體顏色過深，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)難以清晰觀察。病菌侵染區(qū)域與正常區(qū)域的對比度雖然存在，但染色過深，影響了對細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)的觀察（圖6）。

2.3 考馬斯亮藍(lán)G-250在黃瓜霜霉病菌侵染黃瓜葉片上的應(yīng)用

黃瓜霜霉病菌接種到黃瓜葉片上后，相對濕度95 %以上，25 ℃條件下培養(yǎng)2 h，其孢子囊釋放孢子在葉片氣孔上形成休止孢，一段時間后，休止孢進(jìn)入氣孔，開始生長發(fā)育，形成芽管（圖7-A），芽管繼續(xù)生長，形成侵染菌絲（圖7-B），侵染菌絲生長發(fā)育（圖7-C），形成孢囊梗（圖7-D），后期孢囊梗頂端產(chǎn)生雙叉狀分支，產(chǎn)生橢圓形或卵型孢子囊（圖7-E），孢子囊成熟后脫落（圖7-F），形成乳突釋放孢子。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

朱書生等[18]提出，考馬斯亮藍(lán)R-250染液在對黃瓜霜霉病菌進(jìn)行染色觀察時比較模糊，不能使黃瓜葉片底色脫色徹底，稱該脫色方法方法更適用于單子葉植物染色觀察。本試驗中，選擇用冰醋酸與無水乙醇1∶1混合液固定葉片，用飽和水合氯醛對固定好的葉片進(jìn)行透明處理，使用染色液對黃瓜霜霉病菌染色能達(dá)到較好的染色效果。李健強(qiáng)等[20]和李映霞[21]利用考馬斯亮藍(lán)組織染色法對小麥白粉病菌進(jìn)行病原菌在組織內(nèi)侵染過程的染色觀察時，觀察到菌絲體伸入到寄主組織中產(chǎn)生吸器以及小麥寄主組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生乳突和過敏細(xì)胞反應(yīng)。而本試驗使用考馬斯亮藍(lán)對黃瓜霜霉病菌染色時，未觀察到吸器的產(chǎn)生及寄主組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生乳突和過敏細(xì)胞反應(yīng)，這可能與病原菌不同以及寄主材料差異有關(guān)。本研究通過使用無水乙醇和冰醋酸1∶1混合液以及飽和水合氯醛對黃瓜葉片組織透明后，采用考馬斯亮藍(lán)R-250染液、考馬斯亮藍(lán)G-250染液、臺盼藍(lán)染色液、甲基藍(lán)染色液、乳酸酚棉藍(lán)染色液5種染色方法對黃瓜霜霉病菌在黃瓜葉片上的侵染過程進(jìn)行觀察比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以上5種染色方法均可對黃瓜霜霉病菌的芽管、侵染菌絲、分生孢子梗等寄主組織外部菌體進(jìn)行原位染色。從染色時間上看，考馬斯亮藍(lán)R-250染液、考馬斯亮藍(lán)G-250染液、甲基藍(lán)染色液、乳酸酚棉藍(lán)染色液均可在20 min內(nèi)著色，染色時間短，大大節(jié)省了試驗時間。而臺盼藍(lán)染色液需在1 h內(nèi)完成染色，并且染色效果不穩(wěn)定。從染色效果上看，考馬斯亮藍(lán)R-250染液、甲基藍(lán)染色液、臺盼藍(lán)染色液、乳酸酚棉藍(lán)染色液均存在染色后黃瓜葉片組織著色的問題。其中，考馬斯亮藍(lán)R-250染液、甲基藍(lán)染色液、臺盼藍(lán)染色液對黃瓜葉片組織著色較重，在光學(xué)顯微鏡觀察過程中，需要多次調(diào)整，乳酸酚棉藍(lán)染色液則不易對菌絲著色，在對黃瓜霜霉病的染色中常表現(xiàn)出菌絲染色不均勻的現(xiàn)象。而考馬斯亮藍(lán)G-250染液可以在20 min內(nèi)著色，也可洗去浮色，對黃瓜霜霉病菌染色過程中，其染色效果較好，是一種很好的染色劑。因此，本研究選擇考馬斯亮藍(lán)G-250染液進(jìn)行不同染色時間篩選，染色時間為20 min時，可以清晰地觀察到黃瓜霜霉病菌的結(jié)構(gòu)，染色時間過長或過短都不利于顯微觀察。

3.2 結(jié)論

本研究通過對黃瓜霜霉病病原菌在黃瓜葉片上的原位染色觀察，可以較好地觀察到黃瓜霜霉病菌在寄主內(nèi)的生長發(fā)育過程、黃瓜霜霉病菌在寄主內(nèi)的侵染過程。黃瓜霜霉病菌作為一種專性寄生真菌，最好的觀察方法就是葉片原位觀察。通過對不同染色方法的觀察比較，建立了一種著色效果好、簡便易行、經(jīng)濟(jì)有效的黃瓜葉片中黃瓜霜霉病菌的染色方法，進(jìn)一步明確了黃瓜霜霉病菌的侵染結(jié)構(gòu)。考馬斯亮藍(lán)G-250染液可以方便、快捷、準(zhǔn)確地進(jìn)行黃瓜霜霉病菌不同生長發(fā)育階段的特征觀察以及殺菌劑對其不同發(fā)育階段影響的觀察，為研究病害發(fā)生發(fā)展規(guī)律及防治提供有效的手段，對黃瓜霜霉病的組織病理學(xué)及流行病理學(xué)研究具有重要意義，為該病害早期的監(jiān)測預(yù)警提供了科學(xué)方法。

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