低溫脅迫下茶樹葉片細胞壁結構變化及光合特性

摘要：為探討茶樹響應低溫脅迫的分子機制，通過模擬“倒春寒”溫度模式，以低溫處理下的福鼎大白茶為研究材料進行轉錄組測序。利用GO和KEGG數據庫對差異基因代謝通路進行富集分析，發現差異基因主要富集在與植物細胞壁和光合作用相關的代謝通路。選取13個差異基因進行實時熒光定量PCR驗證，結果與轉錄組測序結果趨勢一致，證明轉錄組數據可靠。以福鼎大白茶和舒茶早為試驗材料，對茶樹葉片組織結構、細胞壁組分含量、葉綠素含量及葉綠素熒光參數等生理指標進行測定。結果顯示，低溫脅迫后福鼎大白茶和舒茶早葉片各組織結構均有不同程度的增厚，葉片纖維素、半纖維含量變化顯著，果膠含量變化不明顯；葉綠素含量、光化學猝滅系數、最大光化學效率和相對電子傳遞速率呈下降趨勢，非光化學猝滅系數呈上升趨勢。結果表明，茶樹葉片細胞壁組分變化尤其是半纖維素和光合相關參數的改變在響應低溫的過程中發揮著重要作用。

關鍵詞：茶樹；低溫脅迫；轉錄組；細胞壁；光合作用

中圖分類號：S571.1；S326 " " " " " " " " 文獻標識碼：A " " " " " " " 文章編號：1000-369X（2024）06-917-11

Changes in Cell Wall Structure and Photosynthetic Characteristics of Tea Leaves under

Low Temperature Stress

LIU Xiaolu1， ZHU Yalan2， YU Min1， GAI Xinyue1， FAN Yangen1， SUN Ping1*， HUANG Xiaoqin1*

1. College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Tai'an 271018， China;

2. Agricultural Technical Service Center of Lanshan District， Rizhao 276808， China

Abstract： To investigate the molecular mechanisms of tea plants in response to low temperature stress， this study simulated the spring chill temperature pattern， using ‘Fuding Dabaicha’ as the experimental material for transcriptome sequencing， and subjected it to varying low temperature treatments. Differentially expressed genes （DEGs） were analyzed using the GO and KEGG pathway databases for metabolic pathway enrichment analysis， which revealed that these genes were mainly enriched in plant cell wall and metabolic pathways related to photosynthesis. Subsequently， thirteen DEGs were selected for validation via real-time quantitative PCR （qPCR）， confirming the consistency of the qPCR results with the transcriptome sequencing data， thereby validating the reliability of the transcriptome data. In a subsequent study， two tea cultivars， ‘Fuding Dabaicha’ and ‘Shuchazao’， were used to evaluate various physiological indices， including leaf tissue structure， the contents of various cell wall components （cellulose， hemicellulose， and pectin）， chlorophyll content， and chlorophyll fluorescence parameters. The results indicate that the leaf tissue structures of both tea cultivars underwent different degrees of thickening in response to low-temperature stress. Notably， significant differences were observed in the contents of cellulose and hemicellulose between the two cultivars， whereas the pectin content change was less pronounced. Furthermore， the chlorophyll content， photochemical quenching coefficient， maximum photochemical efficiency， and relative electron transport rate all exhibited a downward trend. Conversely， the non-photochemical quenching coefficient showed an upward trend. These observations highlight the key role of changes in cell wall components， particularly hemicellulose， and changes in photosynthesis-related parameters in the tea plants’ response to low temperature.

Keywords： tea plant， low-temperature stress， transcriptome， cell wall， photosynthetic characteristics

茶樹[Camellia sinensis （L.） O. Kuntze]是一種重要的木本經濟作物，目前已在我國廣泛種植。在我國許多茶葉產區，三月下旬至四月上旬“倒春寒”頻繁發生，此時茶芽正處萌發期，抗凍能力較弱[1]。低溫脅迫會導致茶樹生長嚴重受損，降低茶葉產量和品質[2-3]。此外，“倒春寒”還會延緩茶樹葉片生長，推遲春季名優茶的采摘時間。

細胞壁是植物在面對逆境脅迫時的第一道屏障，植物通過細胞壁重塑、細胞壁結構和組成的改變等策略應對環境的動態變化[4-6]。細胞壁的主要組分包括纖維素、半纖維素、果膠和結構蛋白等，各組分的代謝過程和細胞壁結構的變化影響著植株對低溫的耐受性[7-9]。當植物受到各種環境信號的影響時，細胞壁的組分在含量和結構上發生變化，進而影響其機械性能[10]。這種對逆境環境的適應調整可能涉及提高細胞壁的保水能力、增強機械強度以及調節細胞壁與酶之間的相互作用。光合作用能在植物進行生命活動時提供物質基礎，是判斷植物生長和抗逆性強弱的重要指標。植物吸收的光能主要轉化為化學能，未能轉化利用的激發能則以熱量和熒光的形式耗散。光合作用的利用效率是影響茶樹生長發育的重要因子[11]，低溫脅迫會造成光合速率降低，影響茶樹的光合作用和葉綠素生物合成，從而影響植株的正常生長和發育[12-13]。通過對不同低溫處理下的茶樹葉片進行測序分析，發現差異基因主要富集在谷胱甘肽代謝、葉綠體及膜相關、氧化還原過程、碳代謝等途徑[14-15]。低溫脅迫通過抑制酶的活性、損傷膜系統、破壞細胞結構等方式極大地限制了植物的生長發育。不同溫度處理下，福鼎大白茶茶樹的光合特性及產量受到影響，低溫脅迫會損傷茶樹葉片的光系統Ⅱ反應中心，導致過剩的激發能積累；而葉綠素作為光合作用的主要色素，其含量也會隨著溫度的降低和持續時間的增加而下降[16]。然而，關于低溫脅迫下茶樹細胞壁結構、各組分含量變化，以及光合作用特性的系統研究還較為缺乏。

本研究模擬“倒春寒”的溫度模式，以山東省引種面積較大的福鼎大白茶為研究材料進行轉錄組測序，探究低溫脅迫下茶樹葉片解剖結構、細胞壁組分含量、葉綠素含量及葉綠素熒光參數等指標的變化，以期為茶樹響應低溫脅迫的機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試茶樹品種為福鼎大白茶與舒茶早（福鼎大白茶抗寒性弱于舒茶早[17-18]），各選取50株一年生無性系、長勢一致的茶樹幼苗（高11 cm）栽于穴盤中，采用人工基質培養。在冷光源培養箱內進行預培養，培養條件為溫度25 ℃，光周期12 h/12 h，光照強度125 μmol·m-2·s-1，空氣濕度80%，培養21 d后取樣作為預培養組（CKF）。將預培養后的茶苗進行試驗處理，15 ℃培養21 d設置為對照組（DKF），隨后將溫度降至4 ℃處理12 h設置為處理組（NKF）。分別取福鼎大白茶第二功能葉，液氮固定后保存于﹣80 ℃超低溫冰箱，用于轉錄組測序和實時熒光定量PCR（RT-qPCR）驗證；另取福鼎大白茶和舒茶早第二功能葉用于葉片組織結構觀察和相關參數測定，每個處理分別選取3個不同植株葉片。通過常規石蠟切片法制備切片標本，用于后續葉片組織結構觀察。

1.2 差異基因富集和表達分析

使用SAM/BAM文件和舒茶早茶樹參考基因組[19]的結構注釋GTF文件，通過HTseq軟件的聯合方案對每個轉錄本的reads數目進行統計，使用FPKM對轉錄本的表達量進行標準化。使用DEGseq軟件進行差異基因篩選，篩選條件為表達差異倍數|log2FoldChange|＞1，顯著性P值＜0.05。利用基因本體（Gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫，以整個基因組為背景，利用超幾何分布計算差異基因顯著富集的GO功能類別和KEGG代謝途徑，以確定差異基因顯著富集的GO功能條目及主要參與的代謝途徑和信號通路。

1.3 RT-qPCR驗證

為確保轉錄組數據的可靠性，同時驗證與細胞壁及光合作用相關基因在低溫條件下的表達模式，選取6個與細胞壁相關（CSS0021714、CSS0033400、CSS0045044、CSS0037361、CSS0010581、CSS0003045）以及5個與光合作用相關（CSS0028326、CSS0047578、CSS0030453、CSS0002306、CSS0037274）的

差異表達基因進行RT-qPCR驗證。通過Primer Premier 5軟件設計RT-qPCR引物（表1），引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用Trizol試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）提取各樣本的總RNA，通過HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）將RNA逆轉錄成cDNA，并將cDNA質量濃度統一稀釋至10 ng·μL-1。采用相對定量的方法，以β-actin為內參基因，RT-qRCR的反應體系為2×Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，加ddH2O至終體積20 μL。反應程序為95 ℃預變性30 s；94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環；3次技術重復，采用 法計算基因的相對表達量。

1.4 葉片組織結構觀察

將茶樹葉片樣品用蒸餾水沖洗干凈并吸干表面水分，用標準固定液FAA（70%酒精∶冰醋酸∶甲醛=90∶5∶5）固定，常規石蠟切片法制備。采用Image pro plus 6.0（Media Cybernetics）軟件測量茶樹葉片厚度（Thickness of leaf，TL）、柵欄組織厚度（Thickness of palisade tissue，TP）、海綿組織厚度（Thickness of spongy tissue，TS）等指標。計算柵海比（Palisade/Spongy，P/S）、葉片組織細胞結構緊密度（Cell structure compactness ratio，CTR）、葉片組織細胞結構疏松度（Cell structure looseness ratio，SR）。

1.5 細胞壁組分含量測定

將茶樹葉片樣品置于80 ℃烘箱中烘干至恒重后，進行細胞壁組分含量測定，重復3次取平均值。纖維素、半纖維素及果膠含量采用蘇州格銳思生物科技有限公司相應試劑盒進行測定。

1.6 葉綠素相對含量及葉綠素熒光參數測定

利用便攜式葉綠素分析儀SPAD測定茶樹第二功能葉（每個處理分別選取3個不同植株葉片）的葉綠素相對含量，每個葉片重復6次，取平均值。利用FMS-2型脈沖調試熒光儀（Hanstrch，UK）測量葉綠素熒光參數。測量前將茶苗置于黑暗中預處理30 min，在125 μmol·m-2·s-1光照強度下測量暗適應葉片的最小和最大熒光值。在自然光下測量初始、最大和發光熒光值。計算葉片的最大光系統Ⅱ（PSⅡ）效率（Fv/Fm）、非光化學猝滅系數（NPQ）、光化學猝滅系數（qP）和相對PSⅡ電子傳遞速率（ETR）。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序統計分析

NKF VS DKF處理組之間差異基因的基本分布如圖1所示，溫度從15 ℃降至4 ℃的過程中引起1 301個基因差異表達，其中631個基因上調表達，670個基因下調表達。

2.2 差異基因GO和KEGG功能富集分析

在NKF VS DKF組中共得到1 052個GO功能富集，以校正之后的P值≤0.05為閾值，篩選顯著富集的GO功能類別有289條。根據其功能可分為細胞組分、分子功能和生物過程三大類，分別取前10條顯著富集的GO功能類別進行分析（圖2）。結果發現，細胞葡聚糖代謝過程（GO：0006073）、植物型細胞壁（GO：0009505）、質外體（GO：0048046）、細胞壁（GO：0005618）、木葡聚糖：木葡糖基轉移酶活性（GO：0016762）等多個途徑與細胞壁多糖的修飾和合成相關；過氧化氫跨膜運輸（GO：0080170）、水運輸（GO：0006833）、趨光性（GO：0009638）、線粒體內膜（GO：0005743）、膜的錨定成分（GO：0031225）、水通道活性（GO：0015250）等途徑與植物的光合作用密切相關。

NKF VS DKF組顯著富集的前20條KEGG代謝通路中（圖3），淀粉和蔗糖代謝（ko00500）、苯丙素生物合成（ko00940）、氨基糖和核苷酸糖代謝（ko00520）等代謝通路與細胞壁合成密切相關，萜類骨架生物合成（ko00900）、MAPK信號通路（ko04010）、鈣信號通路（ko04020）、類黃酮生物合成（ko00941）等代謝通路在調控植物光合作用的過程中發揮重要作用。

2.3 低溫脅迫下茶樹細胞壁合成途徑的響應

2.3.1 低溫脅迫對茶樹葉片組織結構的影響

福鼎大白茶和舒茶早葉片組織結構觀察如圖4所示，與DKF組相比，NKF組福鼎大白茶的葉片厚度、上表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、柵海比分別增加了12.10%、5.13%、19.90%、16.17%、3.22%。舒茶早的葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、角質層厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度分別增加了13.77%、5.03%、7.69%、36.36%、16.62%、

18.19%，而柵海比下降了1.33%。表明低溫脅迫對茶樹葉片的組織結構產生了顯著影響。

2.3.2 低溫對茶樹葉片細胞壁組分的影響

將25 ℃預培養茶苗的培養溫度降至15 ℃，培養21 d，再在4 ℃處理12 h，對低溫脅迫后抗寒性不同的福鼎大白茶和舒茶早進行細胞壁組分含量測定。結果顯示，纖維素含量在兩個品種中變化趨勢基本一致，而半纖維素和果膠含量在兩個茶樹品種中變化有所不同，福鼎大白茶半纖維素和果膠含量隨著溫度的降低持續下降；舒茶早的半纖維素與果膠含量在15 ℃處理后升高，溫度降至4 ℃后下降（圖5）。表明半纖維素與果膠可能在茶樹應對低溫脅迫時發揮重要作用。

2.4 低溫脅迫下茶樹葉綠素合成途徑的響應

低溫脅迫會影響茶樹葉綠素生物合成和光合作用，從而影響植株的正常生長和發育[20-21]。與15 ℃對照處理相比，4 ℃處理下福鼎大白茶和舒茶早的葉綠素相對含量（SPAD）分別下

降39.8%、36.0%（圖6A）。隨著溫度的降低，各類葉綠素熒光參數，如最大光系統Ⅱ效率（圖6B）、相對電子傳遞速率（圖6C）、光化學猝滅系數（圖6D）不斷下降，而非光化學猝滅系數隨著溫度的降低呈現上升趨勢（圖6E）。

2.5 低溫脅迫下相關基因表達模式分析

將NKF VS DKF比較組中DEGs富集到具體的GO途徑和KEGG代謝通路中，發現多個與細胞壁和光合相關的途徑，選擇顯著富集的木葡聚糖：木葡糖基轉移酶活性（GO：0016762）的DEGs（CSS0021714、CSS0033400、CSS0045044、CSS0037361、CSS0010581、CSS0003045）和與光合相關DEGs（CSS0028326、CSS0047578、CSS0030453、CSS0002306、CSS0037274）進行RT-qPCR。如圖7所示，RT-qPCR結果與轉錄組測序的FPKM值的趨勢基本一致。

3 討論

3.1 低溫脅迫下細胞壁組分含量變化

細胞壁作為植物抵御逆境的第一道屏障，在植物抗寒過程中發揮著重要作用。研究表明，植物依靠細胞壁感知環境變化，通過質膜將信號傳遞到細胞質，繼而引發信號級聯，最終反饋到質外體，導致細胞壁組成和性質的變化[22]。低溫脅迫下，植物采用多種策略應對動態的環境變化，包括葉片組織結構的適應性變化[23]、細胞壁結構和組成的改變、調控與防御相關的信號傳導、蛋白質修飾以及基因表達，對植物的結構支撐、物質運輸及逆境抵御能力至關重要[24]。本研究在轉錄水平上鑒定到大量與細胞壁相關的差異基因，在細胞葡聚糖代謝過程（GO：0006073）、植物型細胞壁（GO：0009505）、細胞壁（GO：0005618）、木葡聚糖：木葡糖基轉移酶活性（GO：0016762）、

淀粉和蔗糖代謝（ko00500）、苯丙素生物合成（ko00940）等代謝途徑中顯著富集。已有研究表明，低溫處理會影響植物細胞壁的組成，如茶苗由4 ℃降至0 ℃以下，抗寒品種的半纖維素和果膠含量提高，纖維素含量下降；而抗寒性較弱品種的纖維素和果膠含量下降，半纖維素含量上升[24]。枇杷、柑橘等果實在低溫處理后，果皮細胞壁中纖維素和半纖維素含量增加[25-26]。本研究聚焦于抗寒性不同的兩個茶樹品種（福鼎大白茶與舒茶早），在低溫脅迫下對其葉片組織結構變化及葉片中細胞壁組分含量等生理指標進行分析。結果顯示，低溫脅迫下茶樹葉片增厚，植株的抗寒性和對環境的適應能力提升。福鼎大白茶與舒茶早的柵欄組織、海綿組織厚度均有增加，福鼎大白茶柵欄組織的增長更為顯著，柵海比顯著增加，有利于植株在低溫下保持較高的光合作用效率；而舒茶早的海綿組織增長更為顯著，植株的保溫能力和水分儲存能力更強。細胞壁組分含量方面，纖維素含量在兩個茶樹品種中的變化趨勢相似；果膠含量在不同溫度處理下變化趨勢不同，但差異不顯著；而半纖維素含量的變化則顯著不同，表明其在不同抗寒性茶樹品種中可能具有特異性作用，這一發現與劉靜[27]研究結果相似。細胞壁中的半纖維素-纖維素微纖絲網絡通過氫鍵和交聯形成，賦予細胞壁機械強度，福鼎大白茶在低溫下半纖維素含量顯著降低，可能削弱了其細胞壁的機械支撐能力和耐寒性，從而更易受到低溫損害。

3.2 低溫脅迫對光合作用的影響

低溫不僅會直接損傷植物的光合機構，也對光合傳遞及光合作用的整個過程產生抑制，進而影響植物的生長發育。光合作用作為茶樹生長發育不可或缺的生理過程，為茶樹提供了生命活動所必需的各類營養物質，并直接影響茶葉的產量與品質，優化光合作用是實現茶葉優質高產的關鍵研究方向[28-29]。本研究通過轉錄組測序分析發現，表達差異顯著的基因大量富集在過氧化氫跨膜運輸（GO：0080170）、趨光性（GO：0009638）、線粒體內膜（GO：0005743）、萜類骨架生物合成（ko00900）、MAPK信號通路（ko04010）、類黃酮生物合成（ko00941）等多條與葉綠體和光合作用相關的代謝通路中。葉綠素熒光參數能夠在一定程度上反映植物的光合能力和對生長環境的適應能力[30]。低溫脅迫對茶樹光合作用影響研究結果顯示，隨著溫度的降低，葉綠素相對含量持續下降，Fv/Fm、ETR及qP等葉綠素熒光參數也呈現下降趨勢，這表明茶樹在低溫脅迫下用于光合作用的量子產能和能量轉化效率降低，光合作用受到抑制，并將吸收的光能更多用于熱耗散[31]。非光化學猝滅系數可用來衡量植物對光系統損害的抵御程度，本研究中，低溫脅迫處理下，茶樹葉片的非光化學猝滅系數顯著升高，說明茶樹在受到低溫脅迫時可能開啟了自我保護機制，通過非光化學途徑減少光系統的過度損傷，然而，這種保護機制的實施也伴隨著光合作用效率的明顯下降，對茶樹的正常生長與發育構成了威脅。已有研究表明，茶樹葉綠體對低溫極為敏感[32]，短暫低溫處理即可破壞光系統中光能吸收、轉運和消耗的動態平衡，導致過剩光能對光反應中心的不可逆失活，并積累氧自由基進一步損傷葉綠體內部膜組織和其他細胞器，從而抑制葉綠體色素代謝及光合作用等生物過程[33-34]。本研究的結果與這些文獻相吻合，進一步證實了低溫脅迫對茶樹光合作用的負面影響。

春季茶樹新梢萌發，細胞壁薄，生長代謝旺盛，山東春季的“倒春寒”極易導致芽葉細胞內部組織結構損傷、代謝紊亂，造成新梢的褐化和死亡。目前對于低溫脅迫下茶樹細胞壁和光合作用相關的生理及分子機制的研究仍較為淺顯，還需深入研究。此外，應進一步驗證其相關基因的功能、研究代謝途徑，全面揭示茶樹乃至其他植物應對環境脅迫的復雜機制，為茶樹乃至其他作物抗逆性改良提供更為深入的理論依據和實踐指導。

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