異葒草素對2型糖尿病肺小動脈的作用及其機制

［摘要］ 目的 探討異葒草素（ISO）對2型糖尿病（T2DM）肺小動脈的保護作用及其機制。

方法 將小鼠隨機分為正常對照組和實驗組，實驗組給予高脂飼料及鏈脲佐菌素干預建立T2DM小鼠模型，喂養2月后將造模成功的小鼠隨機分為模型對照組及低、中、高ISO治療組，各10只。低、中、高ISO治療組小鼠每天分別腹腔注射10、20、40 mg/kg的ISO，正常對照組和模型對照組腹腔注射等量5 g/L羧甲基纖維素鈉，期間觀察各組小鼠的一般情況、體質量、血糖改變。注射8周后處死小鼠，取肺組織，分別應用蘇木精-伊紅染色、Masson染色觀察肺組織及肺小動脈改變，實時熒光定量PCR方法測定肺組織白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、內皮素-1（ET-1）、血管內皮生長因子（VEGF）及血管緊張素受體2（ACE2）mRNA表達，ELISA法檢測晚期糖基化終末產物（AGEs）水平，Western Blot方法檢測c-Jun氨基末端激酶（JNK）、細胞外調節蛋白激酶1/2（ERK1/2）及其磷酸化蛋白水平。

結果 與模型對照組相比，低、中、高ISO治療組小鼠空腹血糖降低（F=30.009，Plt;0.001），體質量增加（F=63.149，Plt;0.001）；肺部炎性細胞浸潤、肺小動脈增厚、膠原纖維增多、小動脈管腔變窄均明顯改善；肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達下降（H=26.791～30.254，Plt;0.001），AGEs含量減少（F=12.482，Plt;0.01）；血管內皮損傷指標VEGF、ET-1 mRNA表達下降，ACE2 mRNA表達升高（F=6.994～37.569，Plt;0.05）；JNK、ERK1/2磷酸化水平下降（F=3.890、6.518，Plt;0.01）。

結論 ISO可以通過降低血糖、抑制炎性反應、減輕氧化應激和血管內皮細胞損傷、抑制JNK和ERK1/2信號轉導通路，對抗T2DM肺小動脈病變。

［關鍵詞］ 異葒草素；糖尿病，2型；肺動脈

［中圖分類號］ R284；R587.1

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2024）06-0791-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.196

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20250107.1910.006;2025-01-08 13：57：10

Protective effect of isoorientin on pulmonary arterioles in type 2 diabetes mellitus and its mechanism

HAN Lin， CHE Kui， CHI Jingwei， WANG Yangang

（Department of Endocrinology and Metabolism， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003，China）

［Abstract］ Objective To investigate the protective effect of isoorientin （ISO） on pulmonary arterioles in type 2 diabetes mellitus （T2DM） and its mechanism.

Methods "Mice were randomly divided into normal group and experimental group. The mice in the experimental group were given high-fat diet and streptozotocin to establish a mouse model of T2DM， and after 2 months of feeding， the mice were randomly divided into model control group and low-， middle-，and high-dose ISO treatment groups， with 10 mice in each group. The mice in the low-， middle-， and high-dose ISO treatment groups were given intraperitoneal injection of ISO at a dose of 10， 20， and 40 mg/kg， respectively， every day， while those in the normal group and the model control group were given intraperitoneal injection of an equal volume of 5 g/L sodium carboxymethyl cellulose， and the mice in all groups were observed in terms of the changes in general status， body weight and blood glucose. The mice were sacrificed after 8 weeks of injection， and lung tissue was collected; HE staining and Masson staining were used to observe the changes in lung tissue and pulmonary arterioles; quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， endothelin-1 （ET-1）， vascular endothelial growth factor （VEGF）， and angiotensin receptor 2 （ACE2） in lung tissue; ELISA was used to measure the levels of advanced glycation end products （AGEs）; Western Blot was used to measure the levels of c-Jun N-terminal kinase （JNK）， extracellular signal-regulated kinase 1/2 （ERK1/2）， and their phosphorylated proteins.

Results "Compared with the model control group， the low-， middle-， and high-dose ISO treatment groups had a significant reduction in fasting blood glucose （F=30.009，Plt;0.001）， a significant increase in body weight （F=63.149，Plt;0.001）， significant increases in pulmonary inflammatory infiltration， thickness of pulmonary arterioles， and collagen fibers， and a significant improvement in the narrowing of arterioles; there were also significant reductions in the mRNA expression levels of IL-1β， IL-6， and TNF-α in lung tissue （H=26.791-30.254，Plt;0.001） and a significant reduction in the content of AGEs （F=12.482，Plt;0.01）; as for the indicators for vascular endothelial injury， there were significant reductions in the mRNA expression levelsof VEGF and ET-1 and a significant increase in the mRNA expres-sion level of ACE2 （F=6.994-37.569，Plt;0.05）， as well as significant reductions in the phosphorylation levels of JNK and ERK1/2 （F=3.890，6.518;Plt;0.01）.

Conclusion ISO can exert a protective effect against pulmonary arteriole lesions by reducing blood glucose， inhibiting inflammatory response， alleviating oxidative stress and vascular endothelial cell damage， and inhi-biting the JNK and ERK1/2 signal transduction pathways.

［Key words］ isoorientin; diabetes mellitus， type 2; pulmonary artery

我國2型糖尿?。═2DM）患病率已經上升至11.2%^[1]，目前對其研究集中于糖尿病腎病、視網膜病變、周圍神經病變等，而對糖尿病靶器官肺的研究較少。2019年全球爆發了新型冠狀病毒肺炎，該病在糖尿病病人中發病率高、易轉為重癥、住院時間長，且死亡風險高^[2]。僅僅將其原因考慮為糖尿病病人容易感染是片面的，探究糖尿病肺組織及血管改變的病理機制并進行有效干預具有重要的意義。異葒草素（ISO）是一種黃酮類化合物，它具有改善糖尿病相關指標、抑制炎性反應、抵抗氧化應激等作用^[3-4]。本研究建立T2DM小鼠模型，給予ISO干預，觀察其對T2DM小鼠肺組織及小動脈病變的影響及作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SPF級4～5周雄性C57BL/6Cnc小鼠50只，體質量（25±3）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。ISO（純度gt;98%），購自北京普天同創生物科技有限公司；c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、細胞外調節蛋白激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化細胞外調節蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）、GAPDH抗體及兔二抗均購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 實驗分組及處理

小鼠隨機分為正常對照組（10只）和實驗組（40只），實驗組小鼠使用高脂飼料喂養4周后，連續腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，30 mg/kg）5次，1周后測隨機血糖，隨機血糖＞16.7 mmol/L為小鼠T2DM模型造模成功^[5]。繼續喂養小鼠2月，將造模成功的糖尿病小鼠隨機分為模型對照組、ISO低劑量組（10 mg/kg）、ISO中劑量組（20 mg/kg）、ISO高劑量組（40 mg/kg），各10只。ISO各劑量組分別腹腔注射相應劑量ISO，正常對照組和模型對照組每天腹腔注射等量5 g/L羧甲基纖維素鈉。給藥8周后，處死小鼠，取出小鼠雙肺備用。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況及體質量 每周觀察各組小鼠精

神是否飽滿，行為活動是否敏捷，飲水、進食、尿量等。各組小鼠排空小便，空腹，應用電子分析天平稱體質量。

1.3.2 空腹血糖（FBG） 應用羅氏血糖儀檢測小鼠FBG。

1.3.3 蘇木精-伊紅（HE）染色 取小鼠右上肺，固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。

1.3.4 Masson染色 肺組織切片，依次行Weigert鐵蘇木素染色液染色、Masson藍化液返藍、麗春紅品紅染色液染色、磷鉬酸溶液弱酸處理、苯胺藍染色液染色，再經乙醇脫水，二甲苯透明，自然晾干，封片，顯微鏡下觀察。

1.3.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測炎性因子及血管內皮損傷指標mRNA的相對表達水平 應用TRIzol法提取肺組織總RNA，逆轉錄成cDNA。用熒光定量PCR儀檢測各組肺組織白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、內皮素-1（ET-1）、血管內皮生長因子（VEGF）及血管緊張素受體2（ACE2）mRNA水平，以管家基因（β-actin）為內參進行標準化，采用2^-△△CT法計算目的基因的相對表達量。引物由華大基因公司合成。qRT-PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，進行50個循環。引物及其序列見表1。

1.3.6 ELISA方法檢測肺組織晚期糖基化終末產物（AGEs） 取新鮮肺組織，超聲破碎，離心取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。應用ELISA試劑盒檢測AGEs濃度，根據說明書方法進行操作。

1.3.7 Western Blot檢測相關蛋白表達 取小鼠肺組織約50 mg，剪碎，與RIPA蛋白裂解液混勻，超聲充分裂解、勻漿。低溫離心，取上清用BCA試劑盒測定蛋白濃度。以每孔30μL上樣，經過SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯色等操作，應用生物分子成像儀成像，以GAPDH蛋白條帶灰度值為參照，應用Image J軟件分析JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達水平。

1.4 統計學處理

采用SPSS 26.0軟件進行統計學處理。計量資料以±s形式表示，若方差齊多組間比較采用單因素ANOVA檢驗，兩兩比較采用LSD法；若方差不齊多組間比較應用Kruskal Wallis H檢驗，兩兩比較采用Bonferroni法。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結" 果

2.1 各組一般情況及FBG、體質量比較正常對照組小鼠飲水、進食正常，精神良好，活動敏捷，體質量呈穩定增長；模型對照組小鼠注射STZ后出現明顯多尿、多飲癥狀，體質量不增或下降，并伴有不同程度的精神萎靡、活動量減少；ISO治療組小鼠一般情況介于正常對照組和模型對照組之間。5組小鼠FBG、體質量比較差異均有統計學意義（F=30.009、63.149，Plt;0.001）。兩兩比較結果顯示：模型對照組小鼠的FBG顯著高于正常對照組（Plt;0.001），ISO低、中、高劑量組小鼠FBG較模型對照組均顯著降低（Plt;0.001）；模型對照組體質量明顯低于正常對照組（Plt;0.001），ISO低、中、高劑量組小鼠體質量均高于模型對照組（Plt;0.01）。見表2。

2.2 各組肺組織及小動脈變化比較

HE染色觀察顯示，正常對照組小鼠肺泡結構正常，肺泡隔較??；模型對照組小鼠肺泡腔縮小，肺泡隔增厚，周圍有大量炎性細胞。Masson染色觀察顯示，模型對照組小鼠血管壁增厚，管腔變窄，藍色的膠原纖維明顯，周圍炎癥細胞浸潤明顯。ISO低、中、高劑量治療組較模型對照組肺部炎性細胞浸潤、肺小動脈增厚、膠原纖維增多、小動脈管腔變窄均明顯改善（圖1、2）。

2.3 各組肺組織炎性因子及血管內皮損傷指標mRNA表達比較

本文5組小鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相對表達量比較差異有統計學意義（H=26.791～30.254，Plt;0.001）。兩兩比較顯示：模型對照組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達顯著高于正常對照組（Plt;0.01）；ISO低、中、高劑量組小鼠的IL-1β、IL-6 mRNA均低于模型對照組（Plt;0.05）；ISO低、中劑量組的TNF-α的mRNA低于模型對照組（Plt;0.05），ISO高劑量組與模型對照組對比差異無統計學意義（P=0.147）。5組小鼠肺組織的血管內皮損傷指標VEGF、ET-1、ACE2 mRNA表達比較差異有統計學意義（F=6.994～37.569，Plt;0.05）。兩兩比較顯示：模型對照組小鼠肺組織中VEGF、ET-1的mRNA表達較正常對照組高（Plt;0.05）；ISO低、中、高劑量組的VEGF、ET-1 mRNA表達低于模型對照組（Plt;0.05）；模型對照組的ACE2 mRNA表達低于正常對照組（Plt;0.05），ISO中劑量組、高劑量組高于模型對照組（Plt;0.05），ISO低劑量組與模型對照組比較差異無統計學意義（P=0.134）。見表3、4。

2.4 各組肺組織AGEs含量比較

正常對照組、模型對照組、ISO低劑量組、ISO中劑量組、ISO高劑量組小鼠肺組織中AGEs的含量分別為（2 570.294±890.348）、（8 139.142±2 449.857）、（4 115.741±2 268.536）、（4 641.408±2 091.336）、（3 707.224±1 176.283）μg/L，各組比較差異有統計學意義（F=12.482，Plt;0.01），其中模型對照組較正常對照組高（Plt;0.01），ISO低、中、高劑量組低于模型對照組（Plt;0.01）。

2.5 各組JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2水平比較

Western Blot檢測結果顯示，各組小鼠肺組織中JNK、ERK1/2蛋白表達差異無統計學意義（Pgt;0.05）；p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2比值差異有統計學意義（F=3.890、6.518，Plt;0.01），其中模型對照組較正常對照組高（Plt;0.05），ISO低、中、高劑量組低于模型對照組（Plt;0.05）。見圖3、表5。

3 討" 論

雖然越來越多的證據表明，糖尿病與肺部病變有關^[6]，但對肺小動脈病變的研究較少。ISO對糖尿病腎病^[7]、糖尿病合并非酒精性脂肪肝^[8]均有改善作用。本實驗構建小鼠T2DM模型，觀察其肺小動脈病變情況；應用ISO干預，檢測FBG、IL-1β、IL-6、TNF-α、AGEs、ET-1、VEGF、ACE2、JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2等指標變化。結果顯示，T2DM小鼠存在肺小動脈病變，ISO通過降低血糖、炎性反應、氧化應激等途徑作用于JNK、ERK1/2信號轉導通路，從而改善肺小動脈病變。

高糖血癥是小動脈病變的危險因素，它可以直接或間接損傷內皮細胞，促使炎癥反應的發生。此外，高糖血癥還會引起氧化應激、AGEs生成增加等，進一步誘發內皮細胞的凋亡^[9]。本實驗結果顯示，T2DM模型小鼠肺小動脈周圍炎性細胞浸潤，FBG和肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達以及AGEs含量較高；ISO干預后，上述指標均有改善。表明ISO可以降低T2DM模型小鼠血糖、減輕炎性反應及氧化應激。

ET-1是體內血管內皮細胞損傷的特異性標志物，VEGF能夠促進新血管形成^[10]，ACE2通過降解Ang Ⅱ來保護血管^[11]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組小鼠VEGF、ET-1表達升高，ACE2表達下降，表明模型對照組小鼠肺小動脈血管內皮細胞受到了損傷；ISO干預后，上述指標有所改善，提示ISO對T2DM小鼠肺小動脈具有保護作用。

《2型糖尿病患者泛血管疾病風險評估與管理中國專家共識（2022版）》指出，糖尿病微血管病變可能與MAPKs通路相關^[12]。JNK和ERK1/2作為MAPKs通路的兩個重要分支，分別在炎癥、細胞凋亡以及細胞生長、分化等過程中發揮重要作用。IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子增加，VEGF與受體結合，AGEs的堆積，均能激活JNK通路，使肺小動脈產生系列應答反應，致使血管內皮受損、重構。AGEs累積及ET-1、VEGF與其受體結合均可激活ERK1/2通路，磷酸化的蛋白介導平滑肌細胞的增殖與遷移，在小動脈病變中起到重要作用^[13]。另外，ACE2不僅可以通過下調ERK1/2的磷酸化水平而抑制平滑肌增殖^[14]，還可以抑制氧化應激及炎性反應而改善血管內皮功能障礙^[15]。所以，高糖環境下炎癥因子、氧化應激、內皮血管損傷等因素并非獨立存在，而是相互影響、共同作用于JNK、ERK1/2信號通路，參與T2DM肺小動脈的病變。

綜上所述，T2DM小鼠存在肺小動脈病變，ISO可以對抗T2DM小鼠肺小動脈病變的發生，其機制為降低血糖、抑制炎性反應、減輕氧化應激、減輕血管內皮細胞損傷以及抑制JNK、ERK1/2信號轉導通路激活等。本文結果為T2DM肺小動脈病變的防治提供了新思路。本實驗中低、中、高劑量ISO對相關指標的作用并不呈劑量依賴性，具體機制還需要進一步研究。

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（本文編輯 黃建鄉）