益生菌聯合干預對動脈粥樣硬化影響及其可能機制

［摘要］ 目的 探討鼠李糖乳桿菌（LGG）與嗜酸乳桿菌（LA）聯合干預抑制動脈粥樣硬化的潛在機制。

方法選用C57BL/6J小鼠與APOE^-/-小鼠為實驗對象，益生菌灌胃干預喂養小鼠。將小鼠分為空白對照組、實驗對照組、LGG組、LA組和混合物組，各11只。采用冷凍切片及油紅O染色觀察主動脈粥樣斑塊情況。通過試劑盒檢測各組小鼠血清中總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）含量。采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測主動脈炎癥因子和肝臟膽固醇轉運相關基因的表達水平。

結果 LGG與LA在體外具有良好的耐酸性和耐膽鹽能力。體內實驗結果顯示，5組小鼠的動脈粥樣斑塊面積和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、膽固醇轉運相關基因（CYP7A1、ABCA1和ABCG8）表達比較差異有統計學意義（F=18.04～86.45，Plt;0.001）。兩兩比較結果顯示，與LGG組、LA組相比較，混合物組小鼠的主動脈斑塊面積較少（t LSD=2.642、4.307，Plt;0.05），TNF-α和IL-6表達水平降低（t LSD=3.918～5.53 Plt;0.05），CYP7A1、ABCA1和ABCG8表達水平增高（t LSD=5.271～6.598，Plt;0.05）。

結論 益生菌聯合干預可以抑制動脈粥樣硬化的發生發展，可能是通過抑制炎癥反應或是促進膽固醇代謝等機制發揮作用。

［關鍵詞］ 鼠李糖乳桿菌；嗜酸乳桿菌；動脈粥樣硬化；炎癥；膽固醇

［中圖分類號］ R378.992；R543.5

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2024）06-0818-07

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.207

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20250113.1932.005;2025-01-14 13：00：05

Effect of combined probiotics intervention on atherosclerosis and its possible mechanism

LI Xin， GAO Huijuan， ZHANG Lei， LI Peifeng

（Institude for Translational Medicine， Qingdao University， Qingdao 26602 "China）

［Abstract］ Objective To investigate the potential mechanism of combined intervention with Lactobacillus rhamnosus GG（LGG） and Lactobacillus acidophilus （LA） inhibiting atherosclerosis.

Methods "C57BL/6J mice and APOE^-/- mice were selected for experiment， and the mice were fed with probiotics by gavage. The mice were divided into blank control group， experimental control group， LGG group， LA group， and mixed group. Frozen section and oil red O staining were used to observe atherosclerotic plaque in the aorta; kits were used to measure the content of total cholesterol， high-density lipoprotein， and low-density lipoprotein in serum; RT-qPCR was used to measure the expression levels of inflammatory factors in the aorta and cholesterol transport-related genes in the liver.

Results "Both LGG and LA showed good acid resistance and bile salt tolerance in vitro. The results of in vivo experiment showed that there were significant differences between the five groups in the area of atherosclerotic plaque and the expression levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6）， and the cholesterol transport-related molecules CYP7A "ABCA "and ABCG8 （F=18.04-86.45，Plt;0.001）. Comparison between two groups showed that compared with the LGG group and the LA group， the mixed group had a significantly smaller area of aortic plaque（t LSD=2.64 4.307，Plt;0.05）， significantly lower expression levels of TNF-α and IL-6 （t LSD=3.918-5.53 Plt;0.05）， and significantly higher expression levels of CYP7A "ABCA "and ABCG8 （t LSD=5.271-6.598，Plt;0.05）.

Conclusion Combined intervention with the two probiotics can inhibit the development and progression of atherosclerosis， possibly by suppressing inflammatory response or promoting cholesterol metabolism.

［Key words］ Lactobacillus rhamnosus; Lactobacillus acidophilus; atherosclerosis; inflammation; cholesterol

2021年《中國心血管疾病健康與疾病報告》中指出，心血管疾病是中國居民主要疾病死亡中的首位死因^[1]。動脈粥樣硬化是心血管疾病中的主要病理過程^[2-5]。乳桿菌有益于人體健康，在增強免疫力、促進消化吸收、預防治療腹瀉等方面發揮作用^[6-11]。鼠李糖乳桿菌（LGG）與嗜酸乳桿菌（LA）屬于乳桿菌屬，是公認的益生菌菌株，在維持菌群平衡、促進胃腸道健康、抑制有害菌增殖方面發揮作用^[12]。有研究結果顯示，LGG與LA具有抑制動脈粥樣硬化的作用^[13-15]。本研究經過文獻調研篩選了兩株益生菌LGG與LA，探討其聯合干預對動脈粥

樣硬化的影響是否優于單獨菌株干預，以期為臨床動脈粥樣硬化的預防和治療提供更多的策略。

1 材料與方法

1.1 菌株鑒定與培養

實驗菌株LGG購于北納生物科技有限公司（編號為BNCC 134266），LA購于廣東省微生物菌種保藏中心（編號為GDMCC 1.208）。

1.1.1 革蘭染色、測序 將購買的菌株活化，通過革蘭染色、送樣測序（16s rRNA v3-v4區）等方式鑒定菌株。

1.1.2 菌株培養與灌胃菌液配制 菌株均在37 ℃恒溫厭氧箱中培養。4 ℃條件下，以8 000" r/min離心5 min收集3代菌株，用無菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）重懸洗滌2次，采用平板計數法獲得菌體濃度為25×10¹¹ CFU /L的灌胃菌懸液。

1.1.3 菌株耐酸性質檢測 人胃的pH值一般在2.5～3.0之間，食物經過胃消化時間為1～2 h^[16-17]，因此實驗中設置pH為1.0、2.0、3.0共3個梯度，耐酸性培養時間設置為3 h。收集3代菌株將其接種到pH為1.0、2.0、3.0的培養液中，培養3 h后進行平板稀釋涂布，36～48 h后計數。每組重復3次。

1.1.4 菌株耐膽鹽性質檢測 菌株是否耐膽鹽判斷標準是其在3 g/L膽鹽濃度條件下的存活率^[18]，食物經腸道消化時間為2～3 h，因此設置培養時間為4 h。收集3代菌株，分別接種到膽鹽濃度為2、3、4 g/L的培養液中，培養4 h后進行平板稀釋涂布，36～48 h后計數。每組重復3次。

1.2 動物模型與分組

實驗選用8周齡的55只雄性APOE基因敲除（APOE^-/-）小鼠與11只雄性C57BL/6J小鼠，小鼠購自唯尚立德生物科技有限公司。所有小鼠被隨機分為空白對照組（C57BL/6J小鼠，A組）、實驗對照組（APOE^-/-小鼠，B組）、LGG組（APOE^-/-小鼠，C組）、LA組（APOE^-/-小鼠，D組）和混合物組（APOE^-/-小鼠，E組），每組11只。5組小鼠的初始平均體質量為21 g左右。小鼠飼養在25 ℃、嚴格12 h光/暗循環的條件下。C57BL/6J小鼠喂養普通生長繁殖飼料，APOE^-/-小鼠喂養含質量分數0.150 0脂肪和0.002 5膽固醇的高脂肪高膽固醇飼料。

適應性飼養1周后，每天上午開始灌胃實驗。A組與B組小鼠灌胃無菌PBS，C組灌胃LGG，D組灌胃LA，E組灌胃LGG與LA，均灌胃200 μL。連續灌胃12周，處死小鼠。采用摘眼球取血，并將血清分離保存。同時收集并保存主動脈、肝臟、腸等組織待測。

1.3 主動脈動脈粥樣硬化病理學分析

主動脈固定在40 g/L多聚甲醛中，6～8 h后，轉移到150 g/L的蔗糖溶液里，處理過夜。轉移到300 g/L的蔗糖溶液里，處理過夜。進行OCT包埋，主動脈根部橫截面冷凍切片。主動脈主體直接進行油紅O染色，主動脈根部橫截面冷凍切片后采用油紅O染液進行染色，顯微鏡下觀察拍照并使用Image J軟件對結果進行量化分析。

1.4 小鼠血清血脂含量檢測

小鼠眼球取血，按照檢測試劑盒說明書對小鼠血清總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）水平進行檢測。

1.5 RT-qPCR檢測主動脈炎癥因子與肝臟膽固醇轉運分子的表達水平

利用TRIzol試劑按照說明書分別提取主動脈與肝臟RNA。以GAPDH作為內參照。按照試劑盒說明進行反轉錄和RT-qPCR。PCR所用引物及其序列見表1。

1.6 統計學方法

利用GraphPad prism統計軟件進行數據分析。計量資料使用±s表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA檢驗）進行，采用LSD法進行組間兩兩比較。以Plt;0.05為差異具有統計學意義。

2 結" 果

2.1 菌株鑒定

革蘭染色結果顯示，這兩種菌株均被染為紫色，為革蘭陽性菌，且呈短棒狀，符合乳桿菌的形態結構（圖1a、c）。使用DNASTAR軟件將得到的測序結果序列與標準菌株序列、對照序列進行同源性比對，結果顯示，LGG菌株與LGG標準序列幾乎完全重合，LA菌株與LA標準序列幾乎完全重合，確定LGG和LA菌株（圖1b、d）。

2.2 菌株耐酸性檢測

酸性條件pH=1.0時，LGG與LA菌株的存活率為0；酸性條件pH=2.0時，LGG的存活率為（78.10±2.98）%，LA的存活率為（92.80±3.22）%；酸性條件pH=3.0時，LGG的存活率為（50.77±0.45）%，LA的存活率為（43.67±4.86）%。見圖2a、b。

2.3 菌株耐膽鹽性檢測

在膽鹽濃度為2 g/L時，LGG菌株存活率為（94.63±0.87）%，LA菌株的存活率為（77.30±3.33）%；在膽鹽濃度為3 g/L時，LGG的存活率為（60.63±2.42）%，LA的存活率為（64.03±2.54）%；在膽鹽濃度為4 g/L時，LGG的存活率為（43.57±0.91）%，LA的存活率為（37.23±1.68）%。見圖3a、b。

2.4 菌株聯合干預對動脈粥樣硬化影響

根據前期文獻結果^{[1 19-20]}，確定給藥途徑為灌胃給藥，給藥劑量為5×10⁸CFU。實驗過程中對小鼠體質量進行記錄，結果顯示，20周齡的5組小鼠體質量差異有統計學意義（F=11.7 Plt;0.05）。兩兩比較結果顯示，A組小鼠體質量低于實驗組各組小鼠（t LSD=3.370 ～ 6.379，Plt;0.05），各實驗組APOE^-/-小鼠之間體質量并無差異（Pgt;0.05）。

各組小鼠的肝臟質量、心臟質量之間無明顯差異（Pgt;0.05）。見表2。灌胃12周后處死小鼠，選取主動脈根部橫截面與主體內膜面進行油紅O染色，同時對主動脈根部橫截面和主體內膜面斑塊面積占比進行測定。結果顯示，5組小鼠的主動脈主體內膜面與根部橫截面斑塊面積相比較差異有統計學意義（F=26.29、86.45，Plt;0.001）。A組小鼠的主動脈未出現斑塊病變（圖4A、5A）。兩兩比較結果顯示，B組小鼠的主動脈主體內膜面（圖4B）和根部橫截面（圖5B）斑塊面積與A組小鼠相比明顯增大（t LSD=9.471、16.4 Plt;0.05）。益生菌干預后小鼠主動脈主體內膜面（圖4C～F）和根部橫截面（圖5C～E，圖6）斑塊積累情況得到明顯改善，斑塊面積都明顯減少。兩兩比較結果顯示，E組斑塊面積小于C組、D組（t LSD=2.642～4.307，Plt;0.05）。

2.5 益生菌干預對主動脈炎癥因子的影響

5組小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）表達水平比較差異有統計學意義（F=56.68、23.4 Plt;0.001）。兩兩比較結果顯示，與A組小鼠相比，B組小鼠的TNF-α與IL-6表達水平顯著升高（t LSD=13.310、7.746，Plt;0.01）；采用益生菌聯合干預后，TNF-α、IL-6的表達水平顯著降低。兩兩比較結果顯示，E組的TNF-α與IL-6表達水平低于C組、D組（t LSD=3.918～5.53 Plt;0.05）。見圖7。

2.6 益生菌干預對膽固醇代謝的影響

5組小鼠的TC、HDL和LDL比較差異具有統計學意義（F=32.19～50.4 Plt;0.001）。兩兩比較結果顯示，APOE^-/-小鼠的TC、HDL和LDL含量均高于A組小鼠（t LSD=8.529～12.540，Plt;0.001），但各組APOE^-/-小鼠中各指標含量并無明顯差異（Pgt;0.05）。見圖8。5組小鼠的膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）、ATP-結合盒轉運子A1（ABCA1）和ATP-結合盒轉運子G8（ABCG8）基因的表達水平比較差異具有統計學意義（F=7.975～37.120，Plt;0.01）。兩兩比較結果顯示，B組小鼠的CYP7A1、ABCA1和ABCG8基因的表達水平均低于A組（t LSD=3.185～3.62 Plt;0.05）；E組的CYP7A1、ABCA1和ABCG8表達水平高于C組、D組（t LSD=5.271～6.598，Plt;0.05）。見圖9。

3 討" 論

近年來，心血管疾病死亡率呈上升趨勢，是亟待解決的問題。動脈粥樣硬化是心血管疾病的主要病理過程，是解決心血管疾病的重要切入點。研究發現，部分腸道菌群失調在很大程度上會促進或者抑制動脈粥樣硬化的產生^[21]。因此，找出哪些腸道菌群可以對動脈粥樣硬化產生影響十分重要。為了確定益生菌灌胃后是否會被胃酸和膽鹽在胃腸道中滅活，并影響益生菌在胃腸道中的定植，我們對LGG和LA進行了耐酸性和耐膽鹽實驗，結果顯示兩株菌具有良好的耐酸性與耐膽鹽性。因此，我們進行了后續的動物實驗。本研究發現，益生菌株聯合干預組小鼠的主動脈主體內膜面與橫截面的斑塊面積明顯減小，且效果優于單獨益生菌干預組，提示益生菌聯合干預可抑制動脈粥樣斑塊的形成。

TNF-α與IL-6是炎癥反應過程中釋放的細胞因子，是炎癥的經典標志物。TNF-α與IL-6的高表達均會促進動脈粥樣硬化的發生發展^[22]。本研究結果顯示，實驗對照組的TNF-α與IL-6表達水平比空白對照組顯著升高。益生菌干預后，這一情況得到抑制，且益生菌聯合干預的抑制效果更明顯。因此，我們推測益生菌可能通過抑制炎癥反應來抑制動脈粥樣硬化的發生發展。動脈粥樣硬化的發生發展離不開脂質成分的累積^[23]。本研究結果顯示，APOE^-/-小鼠血清中TC、HDL和LDL含量均顯著高于空白對照組小鼠，但各組APOE^-/-小鼠之間并無明顯差異。推測這可能與菌株差異、灌胃時間較短或小鼠之間的個體差異相關。膽固醇代謝主要通過合成膽汁酸來實現^[24]，而CYP7A1是合成膽汁酸過程中的關鍵酶^[25]，ABCA1和ABCG8是促進膽固醇排出的基因^[26-27]。本研究結果顯示，對照組小鼠的CYP7A1、ABCA1和ABCG8基因的表達水平比空白對照組低，提示膽固醇代謝被抑制，膽固醇含量升高；經益生菌干預后，CYP7A1、ABCA1和ABCG8基因的表達水平顯著升高，兩菌株聯合干預效果最明顯。由此可見，益生菌聯合干預可以顯著抑制動脈粥樣硬化的發生發展，并可能通過抑制炎癥因子的表達以及增強膽固醇轉運分子的表達而發揮抑制作用。

益生菌作為一種有益于人體健康的活菌，具有非常廣泛的應用領域。在食品方面，在酸奶中添加保加利亞桿菌和乳酸菌能促進消化吸收；在疾病治療方面，有治療腹瀉的雙歧桿菌，治療抑郁和焦慮的LGG等^[28-30]。有研究顯示，腸道菌群與動脈粥樣硬化、2型糖尿病、結直腸癌等都有一定的關系^[31-34]，但在疾病的治療方面尚無相關應用。因此，益生菌干預防治疾病需要繼續探索和研究，這些成果為相關保健品的開發和臨床應用提供了理論參考和支持，具有很大的市場應用潛力。

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（本文編輯 牛兆山）