lncRNA DLEU2對肝細胞癌細胞行為影響

［摘要］ 目的 探討長鏈非編碼RNA（lncRNA）淋巴細胞白血病缺失基因2（DLEU2）在肝細胞癌（HCC）中的生物學功能及潛在的分子作用機制。

方法 通過檢索GEPIA數據庫，預測lncRNA DLEU2在HCC組織和癌旁組織中的表達情況；利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測標本中lncRNA DLEU2表達情況；采用qRT-PCR確定體外培養人正常肝細胞HL-7702和HCC細胞系（Huh7、HepG2和MHCC97-H）細胞中DLEU2表達。在Huh7和MHCC97-H細胞中分別轉染si-DLEU 通過qRT-PCR實驗檢測轉染效率；采用CCK-8法檢測各組細胞增殖能力；細胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測各組細胞遷移和侵襲能力；小管形成實驗檢測各組細胞的血管生成能力；蛋白免疫印跡（Western blot）檢測血管內皮生長因子A（VEGFA）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）、蘇氨酸蛋白激酶（AKT）及磷酸化蘇氨酸蛋白激酶（p-AKT）蛋白表達。

結果 與癌旁組織相比，DLEU2在HCC組織中高表達（t=17.89 Plt;0.05）。與人正常肝細胞HL-7702相比，DLEU2在HCC細胞系Huh7、HepG2和MHCC97-H中均高表達（t=5.412～8.988，Plt;0.05）。下調lncRNA DLEU2表達可抑制HCC細胞Huh7和MHCC97-H細胞增殖、遷移和侵襲、血管生成（t=4.012～56.51 Plt;0.05），并降低VEGFA、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT水平（t=7.903～24.71 Plt;0.05）。

結論 lncRNA DLEU2在HCC組織和HCC細胞系中高表達，下調lncRNA DLEU2的表達可以降低PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達，從而抑制HCC細胞Huh7和MHCC97-H的增殖、遷移、侵襲以及血管生成。

［關鍵詞］ 癌，肝細胞；RNA，長鏈非編碼；細胞增殖；腫瘤浸潤；新生血管化，病理性；PI3K/AKT信號通路

［中圖分類號］ R730.261;R342.2

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2024）06-0825-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.179

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20241231.1451.008;2025-01-02 13：06：27

Effects of lncRNA DLEU2 on the behavior of hepatocellular carcinoma cells

ZHANG Xinliang， YANG Nanmu

（Department of General Surgery， Henan Veterans Hospital， Xinxiang 453000， China）

［Abstract］ Objective To investigate the biological functions of the long non-coding RNA deleted in lymphocytic leukemia 2 （DLEU2） in hepatocellular carcinoma （HCC） and the potential molecular mechanisms.

Methods "The expression of DLEU2 in HCC and paracancerous tissues was analyzed using Gene Expression Profiling Interactive Analysis. Quantitative real-time polyme-

rase chain reaction （qRT-PCR） was used to measure the expression of DLEU2 in collected samples and in-vitro cultured normal human hepatic cell line HL-7702 and HCC cell lines （Huh7， HepG "and MHCC97-H）. Huh7 and MHCC97-H cells were transfected with si-DLEU2. The transfection efficiency was determined by qRT-PCR. Cell proliferation was determined using Cell Counting Kit-8. Cell migration and invasion were measured by wound healing assay and Transwell assay. The angiogenesis of cells was mea-

sured by tube formation assay. Western blot was used to determine the protein expression levels of vascular endothelial growth factor A （VEGFA）， phosphatidylinositol-3-kinase （PI3K）， phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase （p-PI3K）， threonine protein kinase （AKT）， and phosphorylated threonine protein kinase （p-AKT）.

Results "The expression of DLEU2 in HCC tissues was significantly higher than that in paracancerous tissues （t=17.89 Plt;0.05）. DLEU2 expression was significantly higher in Huh7， HepG "and MHCC97-H cells than in HL-7702 cells （t=5.412-8.988，Plt;0.05）. Down-regulating the expression of DLEU2 significantly inhibited the proliferation， migration， invasion， and angiogenesis of Huh7 and MHCC97-H cells （t=4.012-56.51 Plt;0.05）， and significantly reduced the protein expression of VEGFA， p-PI3K/PI3K， and p-AKT/AKT （t=7.903-24.71 Plt;0.05）.

Conclusion DLEU2 is highly expressed in HCC tissues and HCC cell lines. Down-regulating DLEU2 expression can reduce the expression of PI3K/AKT pathway-related proteins， thereby inhibiting the proliferation， migration， invasion， and angiogenesis of HCC Huh7 and MHCC97-H cells.

［Key words］ carcinoma， hepatocellular; RNA， long non-coding; cell proliferation; neoplasm invasiveness; neovascularization， pathologic; PI3K/AKT signaling pathway

肝癌是第六大最常見的癌癥類型，而肝細胞癌 （HCC）占所有肝癌的90% ^[1-2]。目前，HCC病人的5年生存率不到20%，轉移率和復發率較高^[3]。臨床上受多種因素影響，HCC的靶標分子仍難確定，難以實現早期診斷。因此，迫切需要對HCC的分子異質性及其發病機制進行深入闡釋。長鏈非編碼RNA （lncRNA）是長度超過200個核苷酸的轉錄本，在癌癥發生和發展中具有致癌或抑癌功能^[4-6]。淋巴細胞白血病缺失基因2（DLEU2） 被證實與癌癥的發生發展密切相關^[7-9]，但其在HCC中的分子作用機制仍然不清楚。本研究旨在探討lncRNA DLEU2在HCC中的表達水平及其對HCC發生發展的生物學作用及分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞和試劑 人肝癌細胞系（Huh7、HepG2和MHCC97-H）和人正常肝細胞（HL-7702）均購自美國典型培養物保藏中心（ATCC，美國）；胎牛血清、DMEM高糖培養液均購自美國HyClone公司；10 g/L青霉素-鏈霉素溶液、CCK-8試劑、RIPA蛋白裂解液及BCA蛋白定量試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol試劑、SYBR Green和Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；Transwell小室和Matrigel膠均購自美國Corning公司；增強型化學發光（ECL）和聚偏氟乙烯（PVDF）膜試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白質測定試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；蘇氨酸蛋白激酶（AKT）抗體、磷酸化蘇氨酸蛋白激酶（p-AKT）抗體、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抗體、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）抗體、血管內皮生長因子A（VEGFA）抗體、GAPDH和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠IgG均購自美國Proteintech公司；Prime Script First Strand cDNA Synthesis試劑盒購自日本Takara公司；靶向lncRNA DLEU2（si-DLEU2）及其陰性對照物（si-NC）購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.1.2 標本收集 選取2021年1月—2022年6月在河南省榮軍醫院進行手術治療的15例HCC病人的癌組織及其癌旁正常組織，-80 ℃保存。其中HCC組織標本經本院病理科醫生診斷，并且本研究得到該醫院倫理委員會的批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學分析 通過檢索GEPIA數據庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/），確定HCC組織和癌旁組織中lncRNA DLEU2的表達水平。

1.2.2 細胞培養 所有細胞置于溫度為37 ℃和含體積分數0.05 CO 2的培養箱中培養，應用含體積分數0.10胎牛血清和10 g/L青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養液行常規培養。

1.2.3 細胞轉染 將5×10⁵個處于對數生長期的Huh7和MHCC97-H細胞分別鋪于6孔板中。待細胞貼壁后，按照ZHOU等^[10]的操作方法，將si-DLEU2及si-NC轉染到Huh7和MHCC97-H細胞中。隨后，利用qRT-PCR確定si-DLEU2的試劑用量和收集時間。

1.2.4 CCK-8實驗 將CCK-8試劑分別于0、24、48、72 h加入96孔板（含Huh7或MHCC97-H細胞，每孔2×10³個）中。37 ℃避光孵育60 min后，使用多功能酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）測定450 nm波長處的吸光度。

1.2.5 細胞劃痕實驗與Transwell實驗 將經過轉染處理的Huh7或MHCC97-H細胞以每孔1×10⁶個的密度接種于6孔板中進行劃痕實驗，48 h后，培養至80%匯合率。用10 μL無菌移液器在6孔板中劃直線，使用PBS清洗去除未貼壁細胞。24 h后，使用光學顯微鏡獲取鏡下細胞劃痕。使用Matrigel膠灌注的Transwell小室進行細胞侵襲檢測。Huh7或者MHCC97-H細胞（均為8×10⁴個）培養于無血清培養基的上室，下室則添加含有體積分數0.10 FBS的培養基。孵育48 h后，將膜上的細胞用甲醇25 ℃固定20 min，然后用1 g/L結晶紫孵育15 min。最后，使用光鏡獲取圖像。

1.2.6 小管形成實驗 將Matrigel膠溶解后用緩沖液等量稀釋，于37 ℃下至基質膠成固體狀。利用DMEM完全培養液重懸Huh7或MHCC97-H細胞，調整細胞密度，以每孔1×10⁴個的密度接種于鋪有Matrigel膠的96孔板內，培養12 h后，觀察各組成管效果。采用Image J軟件進行分析。

1.2.7 總蛋白的提取及Western blot實驗 使用RIPA緩沖液從待測細胞中獲得細胞裂解液，20 μg蛋白樣本經100 g/L 的SDS-PAGE分離后轉移至PVDF膜。用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別用anti-GAPDH（1∶3 000）、anti-AKT（1∶500）、anti-p-AKT（1∶1 000）、anti-PI3K（1∶1 000）、anti-p-PI3K（1∶1 000）、anti-VEGFA一抗（1∶100）4 ℃孵育過夜。以PBS清洗3次。用辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠IgG （H+L）二抗室溫孵育2 h，PBS清洗3次后，使用ECL試劑對蛋白質條帶進行可視化分析。

1.2.8 總RNA提取及qRT-PCR實驗 按照說明書方法利用TRIzol試劑分別提取待測細胞和組織樣本中的總RNA。根據Prime Script First Strand cDNA Synthesis試劑盒說明書方法合成cDNA，以GAPDH作為內參照。隨后使用SYBR Green進行lncRNA和mRNA的qRT-PCR實驗。反應條件：95 ℃、10 min，55 ℃、2 min，72 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個循環。用2^-△△Ct法計算lncRNA DLEU2相對表達量。PCR所用引物及其序列見表1。

1.3 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0統計軟件進行數據分析。計量資料以±s形式表示，兩組間比較采用t檢驗。以Plt;0.05為差異具有統計學意義。

2 結" 果

2.1 lncRNA DLEU2在HCC組織和細胞系中的表達

通過檢索GEPIA數據庫預測lncRNA DLEU2在HCC組織和癌旁組織中的相對表達量的結果顯示，與癌旁組織相比，lncRNA DLEU2在HCC組織中高表達（Plt;0.05）。見圖1A。qRT-PCR實驗也驗證了上述預測結果（t=17.89 Plt;0.05）。見圖1B。同時，通過qRT-PCR實驗檢測了lncRNA DLEU2在人正常肝細胞HL-7702和HCC細胞系（Huh7、HepG2和MHCC97-H） 中的表達情況。結果顯示，與人正常肝細胞HL-7702相比，lncRNA DLEU2在HCC細胞系中高表達（t=5.412～8.988，Plt;0.05）。見圖1C。

2.2 下調lncRNA DLEU2表達對肝癌細胞增殖影響

利用轉染si-DLEU2以降低細胞中lncRNA DLEU2表達量驗證其在HCC中的生物學功能；利用qRT-PCR實驗檢測轉染不同用量si-DLEU2（50、100 nmol/L）在不同細胞收集時間（24和48 h）對lncRNA DLEU2相對表達量的影響確定轉染效率。結果顯示，當si-DLEU2用量為100 nmol/L且轉染后48 h時，轉染效率最佳。見圖2A～D。隨后，利用CCK-8實驗檢測不同時間點（0、24、48和72 h）各組細胞的增殖能力。檢測結果顯示，與si-NC組相比較，在72 h時si-DLEU2組中Huh7和MHCC97-H細胞活力均顯著降低，差異有顯著性（t=7.221、9.21 Plt;0.05）。見圖2E、F。

2.3 低表達lncRNA DLEU2對肝癌細胞遷移和侵襲影響

通過細胞劃痕實驗以及Transwell實驗檢測lncRNA DLEU2對細胞遷移和侵襲的影響。細胞的遷移實驗顯示，當Huh7和MHCC97-H細胞轉染si-DLEU2后，細胞遷移能力受到明顯抑制（t=8.276、8.01 Plt;0.05）。見圖3A。與si-NC組相比，si-DLEU2組Huh7和MHCC97-H細胞的侵襲能力顯著下降（t=56.512、9.708，Plt;0.05）。見圖3B。

2.4 下調lncRNA DLEU2表達對肝癌細胞血管生成能力影響

通過小管形成實驗檢測lncRNA DLEU2對HCC細胞Huh7和MHCC97-H血管分支點數的影響。結果顯示，與si-NC組相比較，si-DLEU2組Huh7和MHCC97-H細胞中形成的分支點數顯著減少（t=4.111、4.01 Plt;0.05）。見圖4A。通過Western blot實驗檢測血管內皮生長因子VEGFA的蛋白表達。結果顯示，與si-NC組細胞比較，si-DLEU2組MHCC97-H和Huh7細胞的VEGFA蛋白表達明顯降低（t=8.814、7.90 Plt;0.05）。見圖4B。

2.5 下調lncRNA DLEU2表達對肝癌細胞PI3K/AKT信號通路活性影響

通過Western blot實驗檢測各組細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達情況，確定lncRNA DLEU2對PI3K/AKT信號通路的影響。結果顯示，與si-NC組相比，si-DLEU2組MHCC97-H和Huh7細胞中PI3K/p-PI3K和AKT/p-AKT蛋白表達比值均降低（t=8.134～24.71 Plt;0.05）。見圖5。

3 討" 論

HCC是原發性肝癌中最常見的病理類型，也是全球與癌癥相關死亡的第三大原因，主要與肝硬化和許多其他慢性肝病有關^[11]。我國HCC的發病率約占全球的50%左右。該病的特點是復發率高，手術切除后易轉移，對化療和放療耐受性較強，病人的生存率很低，預后很差。迄今為止，雖然已開發了許多新藥如索拉非尼等靶向藥物用于HCC治療，但HCC的5年總生存率僅為18.1%^[12]。因此，迫切需要深入探索HCC發病機制、尋找新的治療靶點，為HCC的早期發現和診治提供理論依據。

lncRNA具有重要的生物學功能，它們在包括HCC在內的多種惡性腫瘤的發生和發展中發揮重要作用。例如，癌相關成纖維細胞分泌的CXCL11被發現通過介導LINC00152/miR-205-5p信號軸能夠促進HCC細胞增殖和遷移^[13]。有研究結果顯示，lncRNA EWSAT1通過促進肉瘤基因（Src）誘導的Yes相關蛋白（YAP）的磷酸化，進而激活參與癌癥進化的Hippo-YAP信號靶基因的轉錄，從而促進HCC轉移^[14]。本文研究結果顯示，lncRNA DLEU2作為致癌基因與HCC的發生發展密切相關，而下調lncRNA DLEU2能夠有效降低細胞活力，抑制細胞遷移和侵襲。這提示lncRNA DLEU2作為促癌基因參與了HCC的發生發展，可以作為HCC的分子標志物或治療靶點。HCC是一種典型的高血管性實體瘤，這將有助于其生長、進展、侵襲和轉移。在HCC中，抑制血管生成有利于減少腫瘤細胞的生長和轉移^[15]。HCC中的血管生成受到低氧的強烈刺激，由于組織結構致密和腫瘤生長迅速，腫瘤內部經常發生低氧^[16]。低氧誘導因子-1α是低氧誘導的主要轉錄因子，能夠激活一系列以VEGFA為代表的靶基因，它們在低氧條件下參與細胞存活和血管生成^[17]。本研究結果顯示，干擾lncRNA DLEU2的表達后，細胞中形成的分支點數目明顯降低，并且VEGFA的蛋白表達水平明顯降低，提示HCC組織的血管生成能力減弱。PI3K/Akt信號通路在HCC血管生成中發揮重要作用，靶向PI3K/Akt信號通路能夠顯著抑制血管生成和HCC進展^[18]。因此，PI3K/AKT信號通路與HCC細胞的血管新生密切相關。另外，本研究結果也顯示，干擾lncRNA DLEU2的表達后，Huh7細胞中PI3K/p-PI3K和AKT/p-AKT的比值均顯著降低。這些研究結果提示，lncRNA DLEU2表達失調可能通過抑制PIKT/AKT信號通路活性，抑制HCC進展和血管生成能力。

綜上所述，lncRNA DLEU2在HCC中為癌基因，下調其表達可以抑制HCC細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成，作用機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路有關。由此可見，lncRNA DLEU2可能為HCC的診斷和治療提供一些有前景的策略。然而，lncRNA DLEU2在HCC中作用的分子機制仍需進一步探討。

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（本文編輯 牛兆山）