甘草酸對(duì)卒中相關(guān)性肺炎小鼠肺組織炎性損傷的作用

［摘要］ 目的 探討甘草酸對(duì)腦卒中相關(guān)性肺炎（SAP）模型小鼠肺組織炎性損傷的影響及其機(jī)制。

方法 選用31只C57BL/6J雄性小鼠，隨機(jī)取8只作為假手術(shù)組，模型組與甘草酸組各造模成功8只。模型組和甘草酸組采用光化學(xué)栓塞法建立SAP模型，甘草酸組術(shù)前30 min給予小鼠腹腔注射50 mg/kg甘草酸。術(shù)后第3天，采用蘇木精-伊紅染色觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)改變，用肺濕干質(zhì)量比評(píng)估肺水腫，采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肺組織中高遷移率族蛋白B1（HMGB1）蛋白表達(dá)。

結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠肺組織損傷嚴(yán)重，肺濕干質(zhì)量比和HMGB1陽(yáng)性面積占比均顯著增高（F=20.53、26.30，Plt;0.01）；與模型組相比，甘草酸組小鼠肺組織損傷有所改善，肺濕干質(zhì)量比和HMGB1陽(yáng)性面積占比均顯著降低（Plt;0.05）。

結(jié)論 甘草酸可能通過(guò)抑制HMGB1表達(dá)減輕SAP模型小鼠肺組織的損傷和炎癥反應(yīng)。

［關(guān)鍵詞］ 甘草酸；卒中；肺炎；炎癥；HMGB1蛋白質(zhì)；小鼠

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R563.1；R743.3

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096-5532（2024）06-0879-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.197

［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20250107.1658.002;2025-01-08 10：05：49

Effect of glycyrrhizic acid on inflammatory injury of lung tissue in mice with stroke-associated pneumonia

LIN Shihui， GU Huali， ZHAO Tangmin， SUN Jinping

（Department of Emergency， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 26607 "China）

［Abstract］ Objective To investigate the effect and mechanism of glycyrrhizic acid on inflammatory injury of lung tissue in a mouse model of stroke-associated pneumonia （SAP）.

Methods "A total of 31 male C57BL/6J mice were selected， among which 8 were randomly selected as sham-operation group， and there were 8 mice each in the model group and the glycyrrhizic acid group after successful modeling. The method of photochemical embolization was used to establish a model of SAP， and the mice in the glycyrrhizic acid group were given intraperitoneal injection of 50 mg/kg glycyrrhizic acid at 30 minutes before surgery. On day 3 after surgery， hematoxylin-eosin staining was used to observe the pathological changes of lung tissue， lung wet-dry mass ratio was used to assess pulmonary edema， and immunohistochemical staining was used to measure the expression of high-mobility group box 1 （HMGB1） in lung tissue.

Results "Compared with the sham-operation group， the model group had severe injury of lung tissue and significant increases in lung wet-dry mass ratio and the ratio of HMGB1-positive area （F=20.5 "26.30，Plt;0.01）. Compared with the model group， the glycyrrhizic acid group had a certain improvement in the injury of lung tissue and significant reductions in lung wet-dry mass ratio and the ratio of HMGB1-positive area （Plt;0.05）.

Conclusion Glycyrrhizic acid may alleviate injury and inflammatory response of lung tissue in SAP model mice by inhibiting the expression of HMGB1.

［Key words］ glycyrrhizic acid; stroke; pneumonia; inflammation; HMGB1 protein; mice

腦卒中作為一種常見(jiàn)的腦血管疾病，對(duì)病人的危害較大，可引起腦組織及遠(yuǎn)隔臟器損傷，其中肺損傷較為常見(jiàn)^[1-2]。腦卒中相關(guān)性肺炎（SAP）是急性缺血性腦卒中的常見(jiàn)并發(fā)癥，也是死亡原因之一^[3]。腦卒中可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失衡，致使肺組織過(guò)度分泌炎癥介質(zhì)，造成肺組織受損^[4]。因此，控制肺組織的炎癥反應(yīng)是改善腦卒中誘發(fā)肺部感染的關(guān)鍵。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種非常重要的炎癥因子，與多種疾病有關(guān)^[5]，但HMGB1在SAP中的研究較少。甘草酸能抑制多種疾病的炎癥反應(yīng)，具有抗氧化、抗凋亡和抗炎等作用^[6-7]，但其在SAP中的作用尚不清楚。本研究旨在探討甘草酸對(duì)SAP小鼠肺組織炎性損傷的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠31只，6～8周齡，體質(zhì)量為18～20 g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。小鼠在室溫（23±2） ℃、相對(duì)濕度（45±15）%、12 h/12 h晝夜循環(huán)光照的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，期間可自由獲取食物和飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（AHQU-MAL20230512LSH）。

1.1.2 主要試劑 甘草酸購(gòu)自MedChemExpress公司；免疫組化染色試劑盒及蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉注射液、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑和中性樹(shù)膠封片劑購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)取8只小鼠作為假手術(shù)組，剩余23只小鼠用于模型組和甘草酸組造模。其中模型組12只，造模成功8只，死亡4只；甘草酸組11只，造模成功8只，死亡3只。最終假手術(shù)組、模型組、甘草酸組小鼠各8只。

1.2.2 SAP模型構(gòu)建 小鼠吸入體積分?jǐn)?shù)為0.035的異氟醚麻醉后，以俯臥位固定于立體定位儀上^[8]。以小鼠前鹵門(mén)為基準(zhǔn)點(diǎn)，進(jìn)行皮膚消毒。于矢狀縫附近建1個(gè)2 mm卒中窗口。光照前5 min腹腔注射孟加拉玫瑰紅。將直徑為4 mm光纖放入卒中窗口內(nèi)并固定，小鼠的行程窗口暴露在綠色激發(fā)光下15 min。術(shù)后小鼠縫合皮膚，放回籠內(nèi)，自由攝食和飲水。若造模后48 h內(nèi)小鼠出現(xiàn)進(jìn)食減少、飲水增多、耳緣靜脈突起、毛發(fā)粗糙等癥狀，則判定為造模成功。假手術(shù)組只腹腔注射同等劑量孟加拉玫瑰紅，不給予光照，其他操作同模型組；甘草酸組術(shù)前30 min給予小鼠腹腔注射50 mg/kg甘草酸，其余操作同模型組。

1.2.3 甘草酸預(yù)處理及標(biāo)本采集 在建立SAP模型前30 min，給予小鼠腹腔注射甘草酸50 mg/kg^[9]。術(shù)后第3天，給予各組小鼠腹腔注射過(guò)量戊巴比妥鈉深度麻醉，迅速取出肺組織。先對(duì)右肺進(jìn)行快速洗滌，隨后將其置于40 g/L多聚甲醛中固定，然后進(jìn)行肺組織的病理學(xué)檢查；左肺用于計(jì)算肺濕干質(zhì)量比。

1.2.4 肺組織病理學(xué)觀察 取右肺上葉于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，用石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，按照HE染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色，用光學(xué)顯微鏡在400倍鏡視野下收集圖像，觀察肺組織病理學(xué)的變化。

1.2.5 肺濕干質(zhì)量比計(jì)算 取左肺按照文獻(xiàn)方法記錄濕質(zhì)量及干質(zhì)量，計(jì)算肺濕干質(zhì)量比^[10]。

1.2.6 HMGB1蛋白的免疫組織化學(xué)檢測(cè) 按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行操作^[11]。在光學(xué)顯微鏡下拍照。收集400倍視野下的圖像，用Image J 軟件對(duì)各組小鼠肺組織內(nèi)HMGB1陽(yáng)性面積占比進(jìn)行量化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 10.1.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 各組肺組織病理改變比較

HE染色顯示，假手術(shù)組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)沒(méi)有炎性滲出物。與假手術(shù)組相比，模型組小鼠肺胞腔變窄、塌陷，肺泡壁增厚，部分肺泡受損及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有充血、出血等。與模型組相比，甘草酸組小鼠肺組織病理變化有一定程度的改善，如肺泡結(jié)構(gòu)比較完整、組織結(jié)構(gòu)清晰、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少、紅細(xì)胞滲出減少，表明甘草酸可以減輕SAP肺組織損傷。見(jiàn)圖1。

2.2 各組肺濕干質(zhì)量比的比較

假手術(shù)組、模型組、甘草酸組的肺濕干質(zhì)量比分別為2.61±0.27、6.23±0.60和4.21±1.0 "3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=20.5 Plt;0.01）。兩兩比較結(jié)果顯示，模型組小鼠肺濕干質(zhì)量比較假手術(shù)組顯著增高（Plt;0.01），而甘草酸組小鼠肺濕干質(zhì)量比較模型組顯著降低（Plt;0.05）。

2.3 各組肺組織HMGB1陽(yáng)性面積占比比較

免疫組化染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組HMGB1主要在肺組織細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，模型組HMGB1主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。假手術(shù)組、模型組、甘草酸組小鼠肺組織內(nèi)HMGB1的陽(yáng)性面積占比分別為（1.05±0.40）%、（3.46±0.41）%和（2.35±0.42）% （n=3），3組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.30，Plt;0.01）。兩兩比較結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織內(nèi)HMGB1陽(yáng)性面積占比較假手術(shù)組增高（Plt;0.01），而甘草酸組小鼠肺組織內(nèi)HMGB1陽(yáng)性面積占比較模型組降低（Plt;0.05）。見(jiàn)圖2。

3 討" 論

SAP會(huì)增加急性缺血性腦卒中病人的死亡風(fēng)險(xiǎn)、住院率和治療費(fèi)用等^[12-13]。有研究表明，SAP可使腦卒中病人30 d病死率增加達(dá)3倍^[14]，并增加卒中后1年和3年的死亡風(fēng)險(xiǎn)^[15-16]。目前，SAP的治療主要包括一般治療（化痰及痰液引流、氧療及呼吸支持等）、早期營(yíng)養(yǎng)支持、抗生素抗感染、中醫(yī)中藥治療等^[17]，但治療效果一般，難以達(dá)到令人滿意的程度。目前缺乏良好的靶向治療藥物，這使得SAP的治療面臨著巨大的挑戰(zhàn)。因此，迫切需要探尋有效的治療藥物來(lái)改善SAP病人的預(yù)后。甘草酸在許多疾病中都有研究，但在SAP中的研究相對(duì)較少。因此，本研究主要探討甘草酸對(duì)SAP小鼠肺組織病理學(xué)變化的影響及其可能的作用靶點(diǎn)。

甘草酸是甘草根的主要活性成分，被廣泛用于中醫(yī)臨床，具有很多重要作用，例如抗病毒、降低炎癥反應(yīng)、抗癌、抗氧化等作用^[18-20]。本文研究結(jié)果表明，甘草酸可以改善SAP小鼠肺水腫程度和肺組織病理?yè)p傷，提示甘草酸可以減輕SAP小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)，但其機(jī)制尚不清楚。

HMGB1是許多肺部疾病發(fā)病的生物標(biāo)志物和炎癥介質(zhì)^[21]。HMGB1是一種普遍存在的核蛋白，可調(diào)節(jié)許多肺部疾病發(fā)病相關(guān)基因的表達(dá)，還可調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。HMGB1主要定位于正常細(xì)胞的細(xì)胞核中。當(dāng)細(xì)胞受損或壞死時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的HMGB1會(huì)被激活并從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞外的HMGB1作為一種重要的炎癥介質(zhì)，可激活巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大。HMGB1可以與細(xì)胞表面受體（如晚期糖基化終末產(chǎn)物受體）結(jié)合，啟動(dòng)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)一步加重肺部的炎性損傷^[22]。無(wú)論是主動(dòng)分泌還是被動(dòng)釋放，細(xì)胞外HMGB1都是可以觸發(fā)炎癥反應(yīng)的危險(xiǎn)信號(hào)^{[2 23]}。甘草酸作為HMGB1的抑制劑，可干擾HMGB1與細(xì)胞表面受體的相互作用，減少趨化因子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，降低炎癥因子的水平^[24-25]。在以HMGB1為靶點(diǎn)的抑制劑中，甘草酸的應(yīng)用最為廣泛和有效^[26]，因此，本研究選擇甘草酸作為干預(yù)藥物，探討其對(duì)SAP模型小鼠肺組織炎性損傷的影響及機(jī)制。本文研究結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織中HMGB1陽(yáng)性面積占比高于假手術(shù)組，且模型組小鼠的組織病理學(xué)損傷嚴(yán)重，肺水腫程度也高于假手術(shù)組；甘草酸組小鼠肺組織中HMGB1陽(yáng)性面積占比較模型組降低，組織病理學(xué)損傷和肺水腫程度也較模型組有一定程度的改善。提示甘草酸可能通過(guò)抑制HMGB1的表達(dá)來(lái)減輕SAP模型小鼠肺部的炎癥反應(yīng)。

綜上，甘草酸可以改善SAP小鼠肺組織的炎性損傷，這為SAP的治療提供了新的線索。但本研究仍有許多問(wèn)題需要進(jìn)一步深入探討。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，可以進(jìn)一步檢測(cè)肺組織中炎癥因子及相關(guān)蛋白的表達(dá)，以更全面地了解甘草酸對(duì)SAP的治療作用機(jī)制。同時(shí)，可以深入研究甘草酸抑制HMGB1表達(dá)的具體分子機(jī)制，包括信號(hào)通路的調(diào)節(jié)、基因表達(dá)的調(diào)控等多個(gè)層面。此外，還可以探討甘草酸與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用，以提高治療效果。對(duì)甘草酸在SAP中作用機(jī)制的深入研究，有望為SAP的治療提供更充分的理論依據(jù)。

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（本文編輯 牛兆山）