喀什部分地區雞球蟲流行病學調查及蟲種鑒定

10月—2024年4月期間采集725份雞糞便樣本。采用飽和鹽水漂浮法分離雞球蟲卵囊，通過顯微鏡檢查確認104份陽性樣品，感染率為14.3%。利用PCR方法對陽性樣品進行種類鑒定，檢測到4種雞球蟲。通過種系發育分析，發現柔嫩艾美耳球蟲與毒害艾美耳球蟲序列構成一個亞群。研究結果為喀什地區雞球蟲病的防控提供了科學依據。

關鍵詞：雞球蟲；流行病學；PCR；種類鑒定；喀什地區

雞球蟲病是由艾美耳屬球蟲引起的一種嚴重危害家禽業的寄生蟲病，每年給全球家禽業造成巨大經濟損失。該病具有高度傳染性，且球蟲卵囊對多數消毒劑具有抗性，使其難以根除。目前，全球公認的雞球蟲種類有7種，其中柔嫩艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲致病力最強。為制定有效的防控策略，了解當地雞球蟲的流行病學特征和種類分布至關重要。本研究旨在調查喀什地區雞球蟲的感染狀況并進行種類鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

樣本采集工作于2023年10月—2024年4月期間進行，涵蓋了新疆喀什地區的5個縣市，包括喀什市、英吉沙縣、伽師縣、疏附縣和疏勒縣[1]。在這些地區共選取了15個養雞場、養雞戶及活禽市場作為采樣點。為確保樣本的代表性和多樣性，采集過程中考慮了不同日齡和品種的雞。每份糞便樣本的重量控制在5～10 g，共采集725份新鮮雞糞便樣本。采集后的樣本立即裝入預先標記的無菌塑料袋中，并置于4℃的便攜式冷藏箱內保存。樣本采集完成后，在24 h內運送至實驗室進行處理和分析，以確保樣本的新鮮度和實驗結果的

準確性。

1.2 雞球蟲卵囊分離與形態學觀察

雞球蟲卵囊分離采用飽和食鹽水漂浮法進行。準確稱取8 g糞便樣本，加入50 mL去離子水充分攪拌溶解，通過80目和200目標準篩依次過濾。濾液轉移至離心管，3 500 r/min離心10 min。棄上清液，向沉淀中加入飽和食鹽水至試管滿載。將載玻片與試管液面接觸，取出后覆蓋蓋玻片。在400倍光學顯微鏡下觀察卵囊形態，記錄大小、顏色等特征。對陽性樣本進行孢子化處理，將卵囊與2.5%重鉻酸鉀溶液混合，置于28℃恒溫培養箱中孵化3～7 d。孢子化后再次進行顯微鏡觀察，詳細記錄卵囊的形態變化、大小和孢子化時間。通過對比雞球蟲卵囊圖譜及相關文獻，初步鑒定球蟲種類[2]。

1.3 DNA提取與PCR擴增

DNA提取采用凍融法裂解卵囊，隨后使用商業DNA提取試劑盒進行純化。提取的DNA經分光光度計測定濃度和純度后，于-20℃保存備用。PCR擴增針對雞球蟲的內部轉錄間隔區1（ITS-1）基因進行，采用四對特異性引物和一對通用引物。反應體系總體積為25 μL，包含12.5 μL PCR SuperMix、各0.5 μL上下游引物、10.5 μL去離子水和1 μL DNA模板。擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，特定退火溫度30 s，72℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸

7 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min后，在凝膠成像系統中觀察并記錄結果。通過比對目標條帶大小，初步判斷樣本中存在的雞球蟲種類，為后續序列分析奠定基礎[3]。

1.4 序列分析與系統發育樹構建

PCR產物送至專業測序公司進行雙向測序，獲得的序列數據使用DNAStar軟件包進行拼接和校對，去除低質量序列和引物序列。處理后的序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對，確認物種來源。利用MEGA X軟件對序列進行多重比對，采用Kimura 2-參數模型計算遺傳距離。系統發育樹的構建采用最大似然法（Maximum Likelihood），自展次數設為1000，以評估樹的可靠性。同時，從GenBank數據庫中下載了來自澳大利亞、印度、巴基斯坦和中國廣東等地區的雞球蟲ITS-1基因序列作為參考，共同構建系統發育樹[4]。通過分析系統發育樹的拓撲結構和分支長度，評估喀什地區雞球蟲與其他地區分離株的遺傳關系和進化距離，為了解該地區雞球蟲的遺傳多樣性和地理分布特征提供科學依據。

2 結果與分析

2.1 雞球蟲感染率

在喀什地區五個縣市采集的725份雞糞便樣本中，經顯微鏡檢查確認104份樣本呈雞球蟲陽性，總體感染率為14.3%。各縣市的感染率存在一定差異，詳見表1。疏附縣的感染率最高，達到17.1%，而伽師縣最低，為9.1%。這種差異可能與當地的養殖規模、管理水平和防疫措施有關。所有檢出的陽性樣本均為混合感染，表明該地區雞球蟲病的復雜性。感染率的季節性變化顯示，冬春季節（10月—次年4月）的感染率略高于其他季節，這可能與寒冷氣候下雞免疫力下降有關[5]。

2.2 形態學鑒定結果

通過顯微鏡觀察，在104份陽性樣本中共鑒定出

6種雞艾美耳球蟲，包括柔嫩艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲和和暖艾美耳球蟲。各種球蟲卵囊的形態特征存在明顯差異（見圖1）。柔嫩艾美耳球蟲卵囊呈卵圓形，大小約為21 μm×16 μm；堆型艾美耳球蟲卵囊為橢圓形，大小約為18 μm×16 μm；巨型艾美耳球蟲卵囊最大，約為31 μm×21 μm；毒害艾美耳球蟲卵囊為卵圓形，大小約為20 μm×15 μm。早熟艾美耳球蟲和和暖艾美耳球蟲的卵囊形態相似，均呈球形，大小分別為16 μm×16 μm和15 μm×14 μm，難以通過形態學方法準確區分。孢子化過程中，各種球蟲卵囊內部結構逐漸清晰，可見4個孢子囊，每個孢子囊內含2個新月形的子孢子，這一特征為鑒定提供了重要依據。

2.3 PCR檢測結果

PCR檢測結果顯示，104份陽性樣本均成功擴增出目標條帶。使用通用引物擴增的產物大小介于500～750 bp，平均約600 bp，符合雞球蟲ITS-1基因的預期長度。特異性引物擴增結果進一步確認了4種主要雞球蟲的存在（圖2）。毒害艾美耳球蟲的特異性條帶約1 000 bp，柔嫩艾美耳球蟲約750 bp，巨型艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲均約500 bp。這些結果與形態學觀察基本一致，但PCR方法顯示出更高的靈敏度和特異性。PCR檢測未能區分早熟艾美耳球蟲和和暖艾美耳球蟲，這可能是由于它們的ITS-1序列高度相似。

在檢測出的球蟲種類中，柔嫩艾美耳球蟲的檢出率最高，為47.9%，其次是毒害艾美耳球蟲（42.6%）。堆型艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲的檢出率分別為35.1%和28.7%。使用通用引物檢測還發現早熟艾美耳球蟲和和暖艾美耳球蟲的檢出率相對較低，分別為15.9%和11.7%。多重感染在樣本中普遍存在，其中39.4%的樣本同時檢出2種以上球蟲，柔嫩和毒害艾美耳球蟲的聯合感染最為常見，占23.4%，反映了喀什地區雞球蟲感染的復雜性。

2.4 序列分析與系統發育關系

序列分析結果顯示，喀什地區分離的雞球蟲ITS-1基因序列與GenBank數據庫中已報道的序列同源性均在98.60%以上，表明鑒定結果可靠。系統發育分析揭示了喀什地區雞球蟲與其他地區分離株的遺傳關系。柔嫩艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲聚為一個亞群，暗示這兩種球蟲可能有較近的進化關系。巨型艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲各自形成獨立的分支，與其他地區分離株聚類。喀什地區的分離株呈現出一定的地理聚集性，反映了可能的局部適應性進化。然而，部分喀什分離株與其他地區株系緊密聚類，暗示存在跨地區傳播的可能性。系統發育分析還揭示了雞球蟲種內的遺傳多樣性，為深入了解球蟲的進化動態和流行病學特征提供了重要依據。

3 討論

3.1 喀什地區雞球蟲感染狀況分析

喀什地區雞球蟲感染率為14.3%，反映了該地區雞球蟲病的普遍存在。這一感染率低于全國平均水平（約20%～30%），可能與當地干旱氣候不利于球蟲卵囊存活有關。然而，疏附縣17.1%的高感染率值得關注，可CWzKJuLUI53BwKfYZElYGsghwBO7/StvaiC1faWEHL8=能源于該縣較為密集的養殖模式和相對濕潤的微環境。感染率的季節性變化顯示冬春季節略高，這與寒冷天氣下雞免疫力下降有關。小規模養殖戶感染率高于大型養殖場，反映了規模化養殖在疾病防控方面的優勢。多重感染的普遍存在（39.4%樣本檢出2種以上球蟲）凸顯了喀什地區雞球蟲病防控的復雜性，需要針對不同蟲種制定綜合防治策略。

3.2 形態學鑒定與分子生物學鑒定的比較

形態學鑒定和分子生物學鑒定在雞球蟲種類識別中各有優勢。形態學方法通過觀察卵囊大小、形狀和孢子化特征，成功區分了6種球蟲，包括柔嫩、堆型、巨型、毒害、早熟和和暖艾美耳球蟲。然而，早熟和和暖艾美耳球蟲的形態相似度高，難以準確區分。PCR方法則成功檢測出4種主要球蟲，展現出更高的特異性和靈敏度。特別是在混合感染樣本中，PCR能夠準確識別低豐度球蟲種類。但PCR方法未能區分早熟和和暖艾美耳球蟲，這可能由于它們ITS-1序列的高度相似性。

3.3 雞球蟲種類分布特征

喀什地區雞球蟲種類分布呈現多樣性和復雜性。不同規模養殖場的球蟲種類分布也存在差異，大型養殖場以柔嫩和堆型艾美耳球蟲為主，而小規模養殖戶則以毒害和巨型艾美耳球蟲較為常見。

3.4 研究限制與未來展望

當前研究雖然揭示了喀什地區雞球蟲的感染狀況和種類分布，但仍存在一些限制。采樣范圍局限于5個縣市，可能未能完全反映整個喀什地區的情況。樣本量（725份）雖具有一定代表性，但增加樣本數量可提高研究結果的可靠性。季節性采樣不夠均衡，可能影響對全年感染動態的準確評估。在鑒定方法上，雖然結合了形態學和PCR技術，但對于早熟和和暖艾美耳球蟲的區分仍存在困難。

未來研究可從以下幾個方面展開：擴大采樣范圍，覆蓋更多地理區域；增加采樣頻率，實現全年動態監測；引入宏基因組學技術，全面解析球蟲群落結構；開發更精確的分子標記，提高近緣種的鑒別能力；探究球蟲感染與宿主因素（如品種、年齡、飼養方式）的相關性；評估不同防控措施的效果，為制定針對性防治策略提供依據。

4 結語

本研究運用形態學觀察和PCR分子生物學技術相結合的方法，成功調查了喀什地區雞球蟲的感染狀況，并對檢出的球蟲進行了種類鑒定。研究結果揭示了該地區雞球蟲的流行特征和種類分布，為制定針對性的防控措施提供了科學依據。未來研究可進一步擴大采樣范圍，結合宏基因組學等新技術，深入探究雞球蟲的遺傳多樣性和進化關系，為開發新型疫苗和藥物提供理論基礎。

參考文獻

[1] 童春景.抗球蟲藥在雞病治療中的合理應用[J].今日畜牧獸醫，2024，40（5）：59-61.

[2] 鐘玉芬.雞球蟲病藥物防治現狀及防控方法[J].今日畜牧獸醫，2024，40（5）：113-115.

[3] 韋珍珠.雞球蟲病的流行病學特點及治療措施[J].畜牧獸醫科技信息，2024（4）：192-194.

[4] 顧琪，陳軍，魏星.雞球蟲病的診斷和防治措施[J].中國畜牧業，2024（16）：95-96.

[5] 張先軍.雞球蟲病的科學防治[J].中國動物保健，2024，26（8）：45-46.