基于轉錄組分析的甘薯貯藏根淀粉含量相關SNPs開發

摘要：甘薯是重要的糧食和經濟作物，貯藏根淀粉含量是甘薯的重要農藝性狀，開發與淀粉含量相關的分子標記對于加快育種進程具有重要意義。但甘薯具有自交不親和特性，基因組是高度雜合的六倍體，增加了開發分子標記的難度。本試驗以高淀粉品種漯徐薯8號和低淀粉品種鄭薯20及其雜交F1代中6個高淀粉株系和6個低淀粉株系為材料，基于轉錄組測序分析并結合表型分析，發現44個高淀粉特異的SNPs位點，從中選取9個進行PCR單克隆分析，篩選到3個與高淀粉含量顯著相關的位點，分別為chr9.27120209、chr9.27120256和chr9.13675504，用上述12個株系和F1群體中的另外16個株系進行驗證，最終得到3個與貯藏根淀粉含量相關的單核苷酸多態性（SNPs）位點。本試驗豐富了甘薯分子標記開發的途徑，為甘薯貯藏根淀粉含量相關育種提供了可選擇的標記。

關鍵詞：甘薯；貯藏根；淀粉含量；單核苷酸多態性標記；轉錄組分析

中圖分類號：S531.01 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）12-0010-06

SNP（singe nucleotide polymorphism，單核苷酸多態性）、SSR（ simple sequence repeat，簡單重復序列）、InDel（insertion and deletion，插入和缺失）等標記是基于染色體序列多態性的分子標記，很多與農藝性狀緊密關聯，可在作物輔助選擇育種方面發揮作用，是基因編輯潛在的位點，目前在水稻、小麥、玉米、糜子、蠶豆、木薯等作物中已有比較深入的研究。

甘薯是重要的糧食和經濟作物，前人也有關于其分子標記開發的研究，例如Xiao等對314個甘薯種質資源進行深度測序，通過全基因組關聯分析發現lbZEP1啟動子變異與果肉顏色顯著相關：Nie等對收集自韓國各地的66份甘薯種質進行全基因組關聯分析，發現了與貯藏根的糖分相關性狀及總淀粉、直鏈淀粉和總類胡蘿卜素含量顯著相關的63個SNPs；Kim等對96個甘薯基因型進行全基因組關聯分析，在3號和4號染色體上分別鑒定出兩個與鐮刀菌根腐病抗性相關的重要SNPs標記。但這些分子標記都是在基因組水平上進行的開發，而甘薯具有自交不親和性且基因組是高度雜合的六倍體，這增加了在基因組水平上開發分子標記的難度。因此，本研究選用高淀粉品種漯徐薯8號與低淀粉品種鄭薯20的雜交F1代群體，基于轉錄組測序分析和貯藏根淀粉含量表型分析，嘗試從雜交群體株系的轉錄組水平開發甘薯貯藏根淀粉含量相關SNPs分子標記，以期為基因編輯提供可選擇的位點，并為甘薯分子標記輔助育種提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試甘薯材料為高淀粉含量品種漯徐薯8號（LXS8）、低淀粉含量品種鄭薯20（ZS20）及其雜交F1代群體240個株系。2015-2017年在山東省濟南市紙坊村（116.97°E，36.42°N）和龐莊村（116.73°E，36.39°N）種植。

1.2貯藏根淀粉含量測定

10月中旬甘薯收獲時，選取中等大小的貯藏根，常溫保存，于一周之內進行淀粉含量測定。淀粉含量的測定采用酶水解的蒽酮比色法，略有修改。

1.3轉錄組測序與分析

將從F1代群體中選出的6個高淀粉株系和6個低淀粉株系以及兩個親本同時育苗移栽，在移栽后第113天收獲，每個品種（系）收集3個中等大小的貯藏根，用純凈水沖洗干凈后，用打孔器從每個貯藏根中部取一個直徑為0.5 cm的圓柱形樣品，立即置于液氮中快速冷凍，儲存在-80℃冰箱中備用。

采用Trizol法從樣品中提取總RNA，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集帶有polyA尾的mRNA。將獲得的RNA樣品用斷裂緩沖液進行片段化處理，用隨機N6引物進行逆轉錄合成cDNA，然后合成雙鏈DNA；將合成的雙鏈DNA末端平末端化，并在5’端磷酸化，在3’端形成一個帶有“A”的黏性末端，并連接一個3’端帶有突出“T”的接頭：連接產物通過特異性引物進行PCR擴增，PCR產物經熱變性形成單鏈，使用橋接引物將單鏈DNA環化，從而獲得用于BGISEQ-500平臺測序的單鏈環狀DNA文庫。計算測序數據的Q20和Q30值以評估測序質量。

將測序得到的轉錄組序列與參考基因組進行比對分析，使用GATK檢測SNPs信息：對于得到的SNPs位點，在親本、6個高淀粉株系和6個低淀粉株系間進行關聯分析，發現在漯徐薯8號和6個高淀粉株系中特有的SNPs位點。

1.4SNPs位點的PCR單克隆驗證分析

基于轉錄組數據，依據SNPs位點兩側序列信息設計引物（表1），用多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）提取親本和F1群體分析的各株系貯藏根基因組，作為PCR模板。配制20 uL PCR反應體系：5×pfu buffer 4 uL，2.5 mmol/L dNTPs l uL，10 mmol/L primer F0.5 uL，10 mmol/L primer R 0.5 uL，50 mmol/LMgSO4 0.5 uL，PfuDNA聚合酶0.2 uL，DNA模板0.5 uL，加水至20 uL。在Bio-Rad PCR儀（580BR）上進行PCR擴增，擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸10 s，32個循環；72℃保溫10 min。PCR產物在Bio-Rad電泳儀上用1％瓊脂糖凝膠進行電泳，切膠回收目的條帶。回收PCR產物構建pEASY-Blunt克隆載體（TRANSGEN公司），連接體系包括PCR回收產物4 uL、pEASY-Blunt 1 uL，連接后室溫靜置5 min。將克隆載體轉化大腸桿菌DH5a，挑取陽性單克隆（10個以上）進行測序，基于測序結果對SNPs位點進行基因分型。

1.5雜交群體中SNPs位點與表型分析

按照基因型（純合體和雜合體）對測序的14個株系和F1代群體中另外16個株系進行歸類，用Microsoft Excel對不同基因型間的淀粉含量進行單因素方差分析。

2結果與分析

2.1F1代雜交群體貯藏根淀粉含量分布

對漯徐薯8號與鄭薯20的雜交F1代群體進行3年2點試驗，結果顯示，F1代群體貯藏根淀粉含量主要集中在19％-lt;31％之間，最高為（33.45±3.34）％，最低為（10.51±0.56）％，呈偏正態分布（圖1），符合后續試驗研究的要求。

2.2轉錄組數據分析

對雜交群體中6個高淀粉和6個低淀粉株系以及兩個親本的貯藏根分別進行轉錄組測序分析（表2），共獲得154.31 GB的有效數據，平均每個樣本11.02 GB；共檢測到85 493個基因，NCBI數據庫序列比對發現其中72 425個為已知基因，13 068個為新基因；與參考基因組比對分析發現1 647 113個SNPs位點，168 775個Indel位點（表3）。

2.3SNPs位點分析及PCR單克隆驗證

結合淀粉含量數據對轉錄組數據進行分析，發現了44個高淀粉特異的SNPs變異位點，從中隨機選擇9個進行PCR單克隆測序驗證，結果（表4）發現，除chr9.27411023位點在高淀粉親本漯徐薯8號中沒有發現胞嘧啶核苷酸（C），與轉錄組數據不一致，其余8個位點的PCR單克隆驗證結果與轉錄組數據均一致。

2.4高淀粉特異SNPs位點的篩選與雜交群體驗證

除轉錄組測序分析選用的12個株系外，又從F1代群體其余株系中隨機選擇16個，以這28個株系及兩親本為材料，利用PCR單克隆測序對上述8個SNPs位點進行分析，按照SNPs位點基因型分為純合體和雜合體兩類，然后結合貯藏根淀粉含量數據（表5），從中篩選到3個與高淀粉含量顯著相關（Plt;0.05）的位點（表6、表7）；chr9.27120209（G-A）位點以及位于其下游47 bp處與其緊密連鎖的chr9.27120256（A-G）位點，即（GA-AG），通過與參考基因組比對，位點所在序列注釋為編碼甘油激酶的基因：還有一個是clu9.13675504（G-C）位點，通過與參考基因組比對，位點所在序列注釋為編碼組蛋白H2B-Iike的基因。

基于轉錄組數據分析發現，這3個SNPs位點所在轉錄本的表達量在高、低淀粉株系間沒有顯著性差異（表8）。按照甘薯遺傳密碼子，將位點所在基因序列翻譯成氨基酸序列，clu9.27120209位點密碼子由AAC變為AAU（互補鏈），都編碼天冬氨酸；chr9.27120256位點密碼子由UUA變為CUA（互補鏈），都編碼亮氨酸：clu：9.13675504位點密碼子由GUG變為GUC，都編碼纈氨酸。可見，SNPs位點的變異沒有引起氨基酸序列的差異。

3討論

貯藏根淀粉含量是甘薯的重要農藝性狀，開發與貯藏根淀粉含量相關的SNPs標記對于甘薯淀粉含量相關分子育種具有重要意義。甘薯貯藏根的淀粉含量受到基因型和環境的影響，變化較大。本試驗選擇的轉錄組測序的高淀粉株系組中最低淀粉含量為（25.38±1.89）％，低淀粉株系組中最高淀粉含量為（15.89±1.03）％，這保證了高、低淀粉含量株系組間淀粉含量的差異主要與基因型相關。對高、低淀粉含量株系組間的轉錄本進行分析，就可以發現與淀粉含量相關的SNPs分子標記。本試驗在驗證的9個SNPs位點中，有3個SNPs位點與淀粉含量顯著相關。

目前已有的甘薯分子標記主要是在染色體水平上開發的，需要有足夠大的群體基因組數據和性狀數據。本試驗方法與其相比，僅需要部分表型極端的個體進行轉錄組測序，在轉錄組測序數據的基礎上結合表型性狀進行分析，依據分析獲得的結果在群體中進行單點驗證，并結合表型性狀進行統計分析，這樣可以在節省成本的情況下針對性地開發相關性狀分子標記。同時基于轉錄組數據開發的分子標記還可以獲得其所在基因的表達信息，這有利于SNPs位點與表型性狀關系的機理解析。

甘油激酶可以將甘油磷酸化形成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油在3-磷酸甘油脫氫酶的催化下又被氧化成磷酸二羥丙酮，參與糖酵解和合成途徑。糖酵解和合成途徑與淀粉合成緊密相關。據此推測甘油激酶中的chr9. 27120209/chr9.27120256位點SNPs與甘薯淀粉含量可能存在一定的關系。轉錄組數據分析發現SNPs位點所在的甘油激酶基因的表達量在高、低淀粉含量的株系間沒有顯著差異，說明這個SNPs位點對淀粉含量的影響與基因的表達量無關。甘油激酶蛋白質序列分析發現SNPs位點的變化沒有引起氨基酸的變化，說明這個SNPs位點對淀粉含量的影響與甘油激酶結構的變化無關，其具體的作用機理有待進一步研究。

組蛋白H2B參與了染色體結構的調節和基因表達的調控。組蛋白H2B的基因表達量和氨基酸序列并沒有因chr9.13675504位點SNP的改變而改變。這個SNP位點與淀粉含量的關系也有待進一步研究。

4結論

本試驗以高淀粉含量的漯徐薯8號和低淀粉含量的鄭薯20及其雜交F1代中6個高淀粉含量株系和6個低淀粉含量株系為材料，進行轉錄組測序，結合表型性狀進行分析，并在雜交群體中另外選擇16個株系進行驗證，發現3個與淀粉含量相關的SNPs位點，分別為chr9.27120209、chr9.27120256和chr9.13675504。本試驗豐富了甘薯分子標記開發的途徑，對甘薯淀粉含量相關育種提供了可選擇的標記。