消毒劑衛(wèi)可對豬糞污厭氧發(fā)酵過程理化指標(biāo)及微生物群落的影響

摘要：為探究殘留消毒劑對豬糞污厭氧發(fā)酵特性的影響，選取不同濃度（0、0.02％、0.1％、0.5％，分別記為CK、L、M、H組）的消毒劑衛(wèi)可（Virkon），研究其對發(fā)酵體系理化指標(biāo)及微生物群落的影響。結(jié)果表明：（1）化學(xué)需氧量（COD）、氨氮（NH3-N）、總氮（TN）、總磷（TP）濃度在厭氧發(fā)酵過程中均隨消毒劑衛(wèi)可濃度提升而升高，表現(xiàn)出劑量效應(yīng)，至反應(yīng)結(jié)束，H組上述指標(biāo)分別較CK提升124.37％、48.78％、95.16％及192.90％；在厭氧發(fā)酵結(jié)束時，各試驗組pH值均上升并趨于一致；此外，H組的總固體（TS）及揮發(fā)性固體（VSS）降解率均有不同程度降低，分別比CK低6.21％及3.40％。（2）衛(wèi)可會導(dǎo)致發(fā)酵體系微生物群落組成、多樣性和豐富度發(fā)生明顯變化，其中H組的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著低于CK，而Simpson指數(shù)則表現(xiàn)相反；發(fā)酵前門水平的第一優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes），其次是變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（BacteroidoIa）及綠灣菌門（Chloroflexi）等，厭氧發(fā)酵后，厚壁菌門相對豐度降低，其中H組由83.45％下降至75.28％；發(fā)酵前屬水平的優(yōu)勢菌群為嚴格梭屬（Clostridium_sensu_stricto_1）、蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、己酸菌屬（Terrisporobacter）、嗜冷桿菌（Psychrobacter）、棒狀桿菌（Corynebacterium）及鏈球菌（Streptococcus），發(fā)酵結(jié)束后，Clostridium_sensu_stricto-1在CK、L組及M組均下降，而H組卻由28.86％上升至30.33％，此外，Turicibacter等其他優(yōu)勢菌群均出現(xiàn)不同程度的下降。（3）pH值和NH3-N與綠灣菌門、互養(yǎng)菌門（Synergistota）等呈顯著正相關(guān)，TN與厚壁菌門及放線菌門呈顯著正相關(guān)，COD和TN聚為一類，NH3-N和pH值聚類后又與TP聚為一類。該研究結(jié)果可為揭示消毒劑過量使用對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)造成的損傷程度提供理論參考。

關(guān)鍵詞：消毒劑衛(wèi)可；豬糞污；厭氧發(fā)酵；理化指標(biāo)；微生物群落

中圖分類號：S851.2 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）12-0061-09

隨著我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化、集約化水平的提高，高密度的養(yǎng)殖模式使得各類消毒劑的使用也更加頻繁。當(dāng)前，畜禽業(yè)常見消毒劑主要包括醇類、鹵素類、酸堿類、氧化劑類、醛類、酚類和表面活性劑類等，其主要是通過改變微生物的內(nèi)外結(jié)構(gòu)，使其代謝機能出現(xiàn)障礙，從而失去致病力。我國在非洲豬瘟發(fā)生后，新一代過硫酸氫鉀復(fù)合物消毒劑（衛(wèi)可、衛(wèi)士等）由于其低毒高效等優(yōu)點，現(xiàn)已成為豬場防控消毒的常用消毒劑。與此同時，豬場在大量使用消毒劑后會不可避免地殘留在豬糞尿中，最后排放至污水處理系統(tǒng)，不僅導(dǎo)致出水水質(zhì)變差，還會對人體健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生威脅。因此，應(yīng)重視豬糞中殘留消毒劑的積累問題。

由于厭氧發(fā)酵工藝具有高效和經(jīng)濟性等優(yōu)點，目前已成為豬場糞液處理的重要措施。近年來，有關(guān)消毒劑對豬糞厭氧發(fā)酵特性影響的研究逐漸成為熱點；吳園園和王輝等以豬糞與接種物為原料，添加不同濃度的百毒殺等消殺劑，表明不同消殺劑對厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼效能均具有抑制作用，同時指出了消殺劑對pH值及揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）含量的影響，但以上報道均未從微生物角度進行分析；而鄧覓等從微生物角度對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)進行分析，詳細闡述了不同濃度衛(wèi)可消毒劑對化學(xué)需氧量（COD）等理化指標(biāo)的影響，以及高濃度衛(wèi)可會導(dǎo)致厭氧系統(tǒng)內(nèi)的細菌群落、多樣性和豐度產(chǎn)生顯著性變化，但COD等理化指標(biāo)的測定僅圍繞試驗啟動期和結(jié)束期，缺乏中間階段的分析。

基于以上研究，本試驗選取應(yīng)用廣泛的消毒劑——衛(wèi)可（主要成分為KHSO5）作為研究對象，將其添加到豬糞與接種污泥的混合物中，測定分析豬糞污在厭氧發(fā)酵過程中的COD等理化指標(biāo)及微生物多樣性等指標(biāo)，以闡明消毒劑衛(wèi)可對豬糞污厭氧發(fā)酵的影響，為消毒劑在豬場的合理使用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

不含任何消毒劑的鮮豬糞取自南昌某養(yǎng)豬場；不含消毒劑的厭氧發(fā)酵污泥取自南昌某污水處理廠厭氧池。消毒劑衛(wèi)可為英國安德國際有限公司生產(chǎn)，其有效氯不低于10％。原料的總固體（TS）含量與揮發(fā)性固體（VSS）含量如表1。

1.2試驗裝置

試驗裝置為自制的連續(xù)攪拌式厭氧發(fā)酵反應(yīng)器，由磁力攪拌器、厭氧發(fā)酵單元、中間瓶、集氣瓶及儲水瓶組成（圖1）。厭氧發(fā)酵過程中，磁力攪拌器保持室內(nèi)恒溫條件下運行，400 r/min、24 h連續(xù)攪拌。厭氧發(fā)酵單元頂部設(shè)置取樣口與甲烷出口，中間瓶內(nèi)加入氫氧化鈉及少量酚酞，集氣瓶內(nèi)添加超純水，所有反應(yīng)瓶均通過玻璃導(dǎo)管和乳膠管連接。根據(jù)已有報道，設(shè)置厭氧發(fā)酵時間為15 d。取樣前在厭氧發(fā)酵單元充入約10 mL氮氣流，取樣后及時關(guān)閉取樣開關(guān)，保證反應(yīng)器處于嚴格厭氧環(huán)境。

1.3試驗設(shè)計

在室內(nèi)恒溫條件下，將原料豬糞和接種污泥以VSS比2：1混合，并以TS為4％計算豬糞及接種污泥加入量，每組加入15.2 g豬糞和376.2 g接種污泥，然后加入一定量的超純水?dāng)嚢瑁詈髮⑸鲜龌旌衔锛尤肴莘e為500 mL的厭氧發(fā)酵單元進行發(fā)酵試驗。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織公布的《非洲豬瘟：發(fā)現(xiàn)與診斷（中文版）》、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《非洲豬瘟疫情應(yīng)急實施方案（第五版）》及衛(wèi)可廠家推薦的1：200對水濃度，同時綜合考慮使用消毒劑后的稀釋、降解等影響，設(shè)3個衛(wèi)可添加組，即分別在發(fā)酵混合物中添加質(zhì)量濃度為0.02％、0.1％及0.5％的衛(wèi)可，依次簡稱L組、M組和H組，以不添加衛(wèi)可的發(fā)酵混合物為對照（CK）（表2）。每組設(shè)3個重復(fù)。

1.4樣品采集

厭氧發(fā)酵持續(xù)15 d，在試驗啟動期（第0天）和結(jié)束期（第15天）時分別測定厭氧發(fā)酵單元中的pH值。發(fā)酵過程中，每隔3天取厭氧發(fā)酵單元內(nèi)10 mL上清液，4℃、8 000 r/min離心5 min后4℃保存，用以測定常規(guī)理化指標(biāo)。在啟動期和結(jié)束期，取樣品對應(yīng)底泥-80℃冰箱保存，用以測定微生物多樣性。

1.5檢測指標(biāo)及方法

理化指標(biāo)主要為COD、氨氮（NH3-N）、總氮（TN）、總磷（TP）及TS、VSS等，前4個指標(biāo)測定方法依次參照HJ 828-2017、HJ 535-2009、HJ 636-2012、GB 11893-89，TS、VSS采用重量法測定。

微生物多樣性分析則參照Xu等的方法，利用E.Z.N.A.Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，U.S.A.）提取微生物群落DNA，通過NanoDrop2000檢測DNA的濃度和純度，并使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性；檢驗合格后，以338F與806R為引物，對16S rRNA基因的V3-V4區(qū)（338F_806R）進行PCR擴增；擴增后采用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫，并于Miseq PE300平臺測序。

1.6數(shù)據(jù)處理與分析

理化指標(biāo)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計與分析，采用單因素方差分析（ANOVA）進行顯著性檢驗，采用鄧肯氏法進行多重比較，用Origin 2021軟件繪圖。通過美吉生物云平臺進行微生物多樣性數(shù)據(jù)處理與分析。

2結(jié)果與分析

2.1衛(wèi)可對豬糞污理化指標(biāo)的影響

2.1.1COD、NH3-N、TN與TP的變化 由圖2可知，在厭氧發(fā)酵過程中，添加衛(wèi)可后COD等理化指標(biāo)快速上升并在一段時間后趨于穩(wěn)定并保持在低濃度水平。相較于CK，L組與M組釋放效應(yīng)不明顯，而H組COD、NH3-N、TN與TP 4個理化指標(biāo)均顯著上升。由圖2a可知，COD在第3天出現(xiàn)了不同程度的峰值，之后保持穩(wěn)定下降趨勢，實現(xiàn)對COD的持續(xù)去除，啟動期H組比CK高出111.55％（Plt;0.01），結(jié)束期M組與H組分別比CK高出25.08％及124.37％（Plt;0.01）。NH3-N濃度在厭氧發(fā)酵試驗開始后各試驗組濃度逐漸上升，到第9天達到峰值后開始穩(wěn)定降低，H組較CK均呈顯著性上升（圖2b），發(fā)酵啟動期和結(jié)束期分別比CK高出36.90％（Plt;0.05）和48.78％（Plt;0.001），表明添加高濃度衛(wèi)可在厭氧環(huán)境下能夠促進氨氮的大量釋放。如圖2e所示，相較于CK，H組的TN濃度均呈顯著性上升，同時各試驗組均在第3天達到峰值，隨后快速下降。啟動期，L組、M組與H組TN分別比CK高出5.48％、35.89％（Plt;0.05）及50.23％（Plt;0.01），至結(jié)束期，各試驗組TN濃度已低于啟動期，L組、M組與H組分別比CK高出35.27％、40.99％及95.16％（Plt;0.05）。TN濃度先升后降變化趨勢與NH3-N類似，這表明前期高濃度衛(wèi)可會促進氮的大量釋放，后期隨著發(fā)酵時間延長濃度下降。TP濃度則表現(xiàn)出明顯劑量效應(yīng)（圖2d），衛(wèi)可含量越高，其TP濃度值越高，且H組較CK均呈極其顯著性上升，第0天、第6天和第15天H組分別比CK高出398.42％（Plt;0.001）、285.39％（Plt;0.001）及192.90％（Plt;0.001）。在厭氧發(fā)酵過程中，各試驗組對磷產(chǎn)生持續(xù)釋放效應(yīng)，而H組表現(xiàn)出釋放磷能力較強的特征。

2.1.2pH值的變化 如圖3所示，在啟動期，pH值表現(xiàn)出較為明顯的劑量效應(yīng)，除L組外，衛(wèi)可含量越高，其pH值越低。啟動期，CK的pH值為7.55±0.09，M組與H組分別為7.33±0.03和5.88±0.14。結(jié)束期，CK pH值較啟動期并無明顯變化，各試驗組pH值穩(wěn)定上升并與CK趨于一致。

2.1.3TS及VSS的變化 如圖4所示，相較于CK，發(fā)酵后H組TS及VSS質(zhì)量濃度比CK均有所上升，分別提高13.79％及14.30％。對TS、VSS降解率進行分析，發(fā)現(xiàn)H組降解率均有不同程度降低，分別較CK低6.21％及3.40％，表明添加高濃度的衛(wèi)可會導(dǎo)致TS、VSS降解率比對照組更低，且結(jié)束期的TS、VSS質(zhì)量濃度比對照組更高，顯示加入高濃度衛(wèi)可對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)有機物分解具有抑制作用。

2.2衛(wèi)可對豬糞污微生物豐富度和多樣性的影響

2.2.1微生物群落結(jié)構(gòu)特征 通過對24個樣品進行高通量測序，共得到1 982 245條優(yōu)化序列，每個樣品66 435-126 130條，平均82 593條。最終共獲得56個門，163個綱，373個目，607個科，1 181個屬，2 755個種及7 373個OTUs（操作分類單元）。

2.2.2微生物群落的a多樣性分析 厭氧發(fā)酵前后不同處理的微生物多樣性和豐度指數(shù)變化如圖5所示。反映微生物菌群豐度的Ace和Chao指數(shù)，在啟動期各衛(wèi)可添加組均比CK低：結(jié)束期，各組均出現(xiàn)不同程度上升，但H組顯著低于CK。這表明隨著厭氧發(fā)酵的進行菌群豐度在上升，而高濃度衛(wèi)可會抑制物種豐富度的提升。Shannon及Simpson指數(shù)反映微生物群落多樣性，Shannon指數(shù)越高，表示微生物群落越復(fù)雜，Simpson指數(shù)越低，表示微生物群落越高。在啟動期，兩者指數(shù)均表現(xiàn)出明顯劑量關(guān)系，其中Shannon指數(shù)在各衛(wèi)可添加組均低于CK，且隨添加量的升高呈階梯型下降，而Simpson指數(shù)變化趨勢則與之相反：結(jié)束期H組的Shannon指數(shù)較CK顯著下降（Plt;0.01），進一步表明添加高濃度衛(wèi)可消毒劑會抑制物種的豐富度和多樣性。

2.2.3微生物群落結(jié)構(gòu)分析 由圖6可知，厭氧發(fā)酵前在門水平上，高豐度菌門主要為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）及綠灣菌門（Chloroflexi）等。厭氧發(fā)酵后，厚壁菌門的相對豐度雖有下降，但仍是第一優(yōu)勢菌群。發(fā)酵前后H組的厚壁菌門相對豐度均高于CK，在試驗啟動期和結(jié)束期，兩組相對豐度分別為83.45％、69.20％和75.28％、54.78％。變形菌門的相對豐度雖在發(fā)酵后整體降低，但在H組卻有所上升，由啟動期的2.46％上升至結(jié)束期的5.13％，這表明添加高劑量衛(wèi)可會使變形菌門保持較高活性。擬桿菌門與綠灣菌門的相對豐度在CK、L組及M組發(fā)酵后明顯上升，如CK，擬桿菌門與綠灣菌門相對豐度在啟動期分別為1.14％和0.35％，到結(jié)束期上升至13.51％和8.11％，兩者在H組發(fā)酵前后變化不明顯。對于其他菌群，如脫硫桿菌門（Desulfobacterota）及酸桿菌門（Acidobacteriota），發(fā)酵后相對豐度均出現(xiàn)不同程度上升，由0.12％及0.07％（L_1）上升至3.86％及2.92％（L_2），增幅超過30倍；又如互養(yǎng)菌門（Synergistota），在添加高劑量衛(wèi)可后，由0.02％（H-1）上升至2.93％（H_2），增幅超過100倍，表明這些細菌對衛(wèi)可消毒劑更敏感。

由圖7可知，發(fā)酵前在屬水平上，高豐度菌屬主要為嚴格梭屬（Ctostridium_sensu_stricto_1）、蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、己酸菌屬（Terrisporobacter）、嗜冷桿菌（Psychrobacter）、棒狀桿菌（Corynebacterium）及鏈球菌（Streptococcus）。厭氧發(fā)酵后，CK、L組及M組的嚴格梭屬相對豐度均出現(xiàn)不同程度下降，而H組卻有所上升，由28.86％上升至30.33％。此外，H組蘇黎世桿菌屬與己酸菌屬發(fā)酵后相對豐度明顯降低，分別由15.41％和11.94％降至6.50％和10.05％，但始終保持最高的豐度，這表明高濃度衛(wèi)可會使己酸菌屬保持較高活性。同樣地，嗜冷桿菌、棒狀桿菌及鏈球菌的相對豐度明顯降低，厭氧發(fā)酵結(jié)束后，其相對豐度分別為0.82％、1.57％和0.55％。值得注意的是，啟動期各組norank_f_Bacteroidetes_vad-inHA17相對豐度均為零，到結(jié)束期，CK、L組及H組出現(xiàn)快速上升，其中CK由零升至7.70％，而H組僅升至0.15％。

2.2.4微生物群落與環(huán)境因子的相關(guān)性分析 在門水平上，對豐富度排名前15的細菌與不同環(huán)境因子進行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖8）顯示，除變形菌門、厚壁菌門及放線菌門外，pH值及NH2-N與其他菌門（綠灣菌門、互養(yǎng)菌門等）均呈顯著正相關(guān)；TN則與厚壁菌門及放線菌門呈顯著正相關(guān)；COD和TP均與變形菌門呈顯著負相關(guān)。基于Average算法的層級聚類分析顯示，COD與TN聚為一類，NH3-N與pH值聚類后又與TP聚為一類。

3討論

本試驗結(jié)果表明，隨著厭氧發(fā)酵時間的延長，COD、NH3-N、TN、TP 4個理化指標(biāo)均先升高后穩(wěn)步下降，且在H組顯著高于CK，說明高濃度的衛(wèi)可會促進上述理化指標(biāo)的釋放。其中，COD濃度在第3天達到最大值，這與王欣姿等的研究結(jié)果類似。其原因可能是，在厭氧發(fā)酵初始階段，水解和酸化保持增強，有機物料（豬糞+污水）被系統(tǒng)內(nèi)的微生物分解成小分子有機物，導(dǎo)致大部分有機物被釋放出來，使得COD上升，但隨著厭氧發(fā)酵時間的延長，有機物被不斷消耗，造成COD呈穩(wěn)步下降趨勢。在厭氧發(fā)酵初期，一些小分子對難溶性磷有較強的抗溶解能力，導(dǎo)致TP有所上升，但隨著小分子被繼續(xù)分解，析出難溶性的磷使得1P有所下降。而對于NH3-N和TN，厭氧發(fā)酵前期由于含氮有機物的水解生成了氨，從而導(dǎo)致其濃度增加，同時氮作為微生物生長的重要營養(yǎng)元素，發(fā)酵后期微生物生長消耗了較多氮，導(dǎo)致其濃度下降。此外，發(fā)酵單元中的pH值厭氧發(fā)酵后上升，可能是由于隨著厭氧發(fā)酵時間延長，產(chǎn)甲烷菌開始活躍，抑制了產(chǎn)酸菌活性所致。TS和VSS降解率在一定程度可以說明厭氧發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)不溶性有機物的利用情況，結(jié)合該變化，表明高濃度衛(wèi)可對厭氧發(fā)酵有機物分解有抑制作用，這與吳園園的研究結(jié)果類似。其原因可能是高濃度的過硫酸氫鉀在一定程度上會殺滅厭氧發(fā)酵的活性細菌，從而抑制了有機物的分解速率，導(dǎo)致降解率下降。在厭氧發(fā)酵結(jié)束期，H組的COD含量顯著高于CK，說明系統(tǒng)內(nèi)仍有部分有機物未被降解，這與H組TS、VSS降解率顯著低于CK的結(jié)論一致。

微生物物種多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示，發(fā)酵啟動期各衛(wèi)可添加組的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均較CK低；發(fā)酵結(jié)束期，各指數(shù)均有所上升，但在H組顯著低于CK（Plt;0.01）。Simpson指數(shù)則表現(xiàn)出相反的變化趨勢。物種多樣性指數(shù)的變化表明厭氧發(fā)酵會提升發(fā)酵體系中微生物群落的多樣性及豐富度，而添加高劑量衛(wèi)可消毒劑對物種多樣性和豐富度的提升存在明顯抑制作用，這與張心悅等的研究結(jié)果一致。其原因可能是采用含氯消毒劑更能抑制菌群群落的生長與繁殖，降低微生物的多樣性。

通過對微生物群落結(jié)構(gòu)的分析可知，厭氧發(fā)酵后厚壁菌門相對豐度逐漸降低。厚壁菌門作為厭氧發(fā)酵水解酸化階段中的優(yōu)勢菌群，能夠產(chǎn)生降解有機物的酶，在底物降解VFAs生成過程中發(fā)揮重要作用，其豐度降低說明隨著厭氧發(fā)酵的進行產(chǎn)酸逐漸減少，這也與pH值上升相吻合。同時互養(yǎng)菌門相對豐度快速上升，可能也會對乙酸生成菌造成影響，從而導(dǎo)致pH值上升。此外，在添加高濃度衛(wèi)可后互養(yǎng)菌門相對豐度增幅超過100倍的現(xiàn)象，也進一步佐證了NH3-N與pH值上升的原因，而TN與厚壁菌門及放線菌門呈顯著正相關(guān)，解釋了厭氧發(fā)酵結(jié)束時TN與厚壁菌門的相對豐度均呈下降趨勢的現(xiàn)象。在屬水平上，相較于CK，H組的嚴格梭屬豐度有所上升，而norank_f_Bacteroidetes-vadinHA17則快速上升，這與Shao等的研究結(jié)果類似，可能與衛(wèi)可中的氯成分有關(guān)，同時表明norank f Bacteroidetes_vadinHA17對含氯消毒劑更敏感。

4結(jié)論

（1）在厭氧發(fā)酵過程中，添加高濃度衛(wèi)可會導(dǎo)致豬糞厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的功能產(chǎn)生不同程度受損，具體表現(xiàn)為：與CK相比，高濃度衛(wèi)可會導(dǎo)致COD、NH3-N、TN及TP 4個理化指標(biāo)顯著性上升（Plt;0.05），產(chǎn)生大量氮磷等現(xiàn)象并抑制TS和VSS的降解。

（2）高濃度衛(wèi)可會導(dǎo)致厭氧發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)的微生物群落組成、多樣性及豐富度產(chǎn)生顯著性變化，發(fā)酵結(jié)束后，Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均表現(xiàn)為H組顯著低于CK（Plt;0.01），Simpson指數(shù)則表現(xiàn)相反：添加高濃度的衛(wèi)可會導(dǎo)致厚壁菌門相對豐度降低，而變形菌門及擬桿菌門則上升。

（3）在豐富度前15的菌門中，發(fā)現(xiàn)微生物群落與環(huán)境因子存在明顯相關(guān)性，pH值及NH3-N與綠灣菌門及互養(yǎng)菌門呈顯著性正相關(guān)；TN與厚壁菌門及放線菌門呈顯著性正相關(guān)；TP及COD與變形菌門呈顯著性負相關(guān)。