玉米苗枯病病原鑒定及其對戊唑醇的敏感性

摘要：為明確玉米苗枯病病原菌的種類、致病性及其對戊唑醇的敏感性，本研究以2021年采自山東省淄博市的玉米苗枯病植株為對象，對其進行病原菌分離、鑒定、致病性及對戊唑醇敏感性的測定。結果表明，從玉米苗枯病病株根部共分離到16株菌，經形態觀察、序列比對及系統發育分析，鑒定出7株尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、4株F.incamatum-equiseti復合種、2株假禾谷鐮刀菌（F.pseudograminearum）、2株腐皮鐮刀菌（F.solani）和1株三線鐮刀菌（F.tricinctum）。致病性測定發現，尖孢鐮刀菌、F.incamatum-equiseti復合種和假禾谷鐮刀菌均能引起玉米幼苗根部發病。對戊唑醇敏感性測定結果表明，16株菌株的EC50值最低為0.03 ug/mL，最高為3.18 ug/mL，有2株菌的EC50值高于0.30 ug/mL。綜上，山東省淄博市玉米苗枯病的優勢病原菌為尖孢鐮刀菌和F.incamatum-equiseti復合種。同時，本研究檢測到對戊唑醇敏感性降低的菌株，建議使用與戊唑醇復配的殺菌劑用于防治玉米苗枯病以延長戊唑醇的使用時間。

關鍵詞：玉米苗枯病；植物病原真菌；鐮刀菌；致病性；戊唑醇

中圖分類號：S435.131 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）12-0092-06

玉米苗枯病是玉米苗期重要的病害之一，制約著玉米的高產。玉米苗枯病在我國各玉米種植區均有發生，嚴重地塊發病率高達80％，嚴重影響產量。玉米苗枯病在玉米2～3葉期開始表現癥狀，病株根系發育不良，主根腐爛呈褐色，側根減少，根部吸水能力下降，進而導致基部的葉片逐漸干枯，嚴重時整株枯萎并死亡。玉米苗期溫度、濕度和土壤肥力都影響該病害的發生。玉米苗枯病是由多種病原真菌復合侵染引起的，病原菌種類很多，在我國主要由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和串珠鐮刀菌（F.moniliforme）等鐮刀菌侵染引起，另外，腐霉菌（Pythium spp.）和絲核菌（Rhizoctonia spp.）也可引起該病害。2022年，Jiang等首次在我國報道了由假禾谷鐮刀菌（F.pseudograminearum）引起的玉米苗枯病。玉米苗枯病主要通過土壤和種子傳播。

當前預防玉米苗枯病的有效方法是種子包衣。戊唑醇是一種三唑類內吸型殺菌劑，通過影響麥角甾醇的生物合成抑制植物病原真菌的生長。隨著戊唑醇的大面積使用，目前，已在自然界中分離到對戊唑醇有抗性的禾谷鐮刀菌和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea），其抗藥性主要是由基因CYP51突變引起的。研究發現，禾谷鐮刀菌基因FgCYP51B的突變減弱了戊唑醇與FgCyp51B蛋白之間的親和力，進而導致其對戊唑醇的敏感性降低。

山東省玉米種植面積約占全國的1/10（https：//data.stats.gov.cn/）。有關山東省玉米苗枯病的報道只有1993年的泰安市和1998-2002年的聊城市。山東省作為我國玉米的主產區，近二十年來，缺乏玉米苗枯病相關的研究。不同地區引起玉米苗枯病的病原菌種類存在差異，隨著近年來發病加重，有必要對其進一步加以鑒定。此外，戊唑醇廣泛應用于小麥和玉米，玉米苗枯病病原菌對戊唑醇的敏感性目前尚不清楚。2021年山東省淄博市高青縣玉米苗枯病發生嚴重，本研究對該地區的玉米苗枯病病株進行病原分離鑒定，同時測定分離菌株對戊唑醇的敏感性，旨在明確玉米苗枯病的病原菌種類、致病性及對戊唑醇的敏感性，進而為玉米苗枯病的田間防治及致病菌抗藥性研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

2021年7月，在山東省淄博市高青縣兩塊玉米苗枯病發生嚴重的田塊采集具有典型玉米苗枯病癥狀的病株，帶回實驗室分離發病組織的病原菌。致病性測定所用的玉米品種為鄭單958。戊唑醇（有效成分濃度為97％，品牌為阿拉丁）原藥用丙酮配制成濃度為5 mg/mL的母液，置于4℃冰箱保存備用。

1.2試驗方法

1.2.1發病植株根部真菌的分離 取發病玉米植株根部，用自來水清洗干凈，用剪刀將病健交界處的根組織剪成小塊，依次置于75％酒精中消毒30 s、3％次氯酸鈉溶液中消毒90 s，然后用無菌蒸餾水清洗3次：之后用無菌濾紙將消毒后的病組織表面的水吸干，放置于PDA培養基中，置于25℃的培養箱中培養；3 d后，用無菌牙簽將長出的菌落轉移至新的PDA培養基中，進行單孢分離純化并保存于PDA斜面。

1.2.2真菌鑒定 活化分離的真菌3d后，用直徑5 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，將菌餅接至PDA培養基中央，4d后，觀察菌落形態并拍照。用牙簽刮取所有菌株PDA培養基中的菌絲，利用CTAB法提取菌絲的基因組DNA；用引物EF1/EF2（表1）對所有菌株的TEF-1a序列進行PCR擴增，EasyTaq DNA聚合酶購自北京全式金生物技術股份有限公司。反應體系：ddH2O18.2 uL，EasyTaq Buffer 2.5 uL，dNTP 2 uL，上、下游引物各0.5 uL，EasyTaq DNA Polymerase 0.3uL，DNA模板1 uL。反應程序：95℃ 3min；95℃30 s，54℃40 s，72℃30 s，35個循環；72℃10 min。擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京六合華大基因科技有限公司測序，測序結果在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.ruh.gov/）中比對分析。

1.2.3分離菌株致病性測定 取適量玉米種子（鄭單958），置于3％次氯酸鈉溶液中表面消毒3min，用無菌水清洗3次。在無菌培養皿中鋪三層無菌濾紙，將消毒后的玉米種子放入其中，加適量無菌水（濾紙濕潤，無明顯流動水），置于25℃的培養箱中催芽。3d后，在上述分離純化培養的菌落邊緣打取菌餅，用兩層無菌紗布將菌餅和玉米根纏在一起，放在鋪有三層無菌濾紙的培養皿中，每個菌株重復3次，置于25℃培養箱中培養（12 h光照/12 h黑暗），7d后觀察玉米苗發病情況并拍照。

1.2.4分離菌株對戊唑醇的敏感性測定 以5mg/mL的戊唑醇為母液，用丙酮分別稀釋至1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL共5個濃度，分別加入PDA培養基中，使戊唑醇終濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 ug／mL。所有PDA培養基（包括不加戊唑醇的PDA培養基）中，丙酮濃度均為1 uL/mL。活化分離的真菌3d后，在菌落邊緣打取菌餅，放置于含有不同濃度戊唑醇的PDA培養基中央，每個菌株重復3次，置于25℃培養箱中培養3d后，采用十字交叉法測量菌落直徑。抑制率（％）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）／對照菌落直徑×100。戊唑醇對每株真菌的EC50值（半最大效應濃度）用軟件DPS 19.05計算。顯著性檢驗用SPSS 22.0軟件中的Duncan's法進行分析。

2結果與分析

2.1玉米苗枯病發病植株根部真菌分離

對山東省淄博市高青縣玉米苗枯病病株的根部進行病原菌分離，共得到16株真菌。根據菌落形態特征觀察（圖1），初步鑒定為鐮刀菌屬真菌。其中，菌株SIAI413氣生菌絲呈灰白色，稀疏：菌株SAIA41C氣生菌絲旺盛，呈白色到黃色，產生粉色到紅色色素：菌株SAIA41F氣生菌絲呈白色，致密；菌株SAIA41H氣生菌絲呈白色到粉色，產生紅色到深紅色色素；菌株SAIA41N氣生菌絲呈白色，致密。

2.2分離真菌的鑒定

對分離到的16株真菌TEF-1a序列進行PCR擴增并測序，通過在NCBI數據庫比對分析，發現菌株SAIA411、SAIA417、SAIA41A、SAIA41E、SAIA41J、SAIA41N和SAIA41P的序列與尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）的相似性最高；菌株SAIA413、SAIA41D、SAIA41F和SAIA41Q的序列與F.icarnatum-equiseti復合種的相似性最高；菌株SAIA41B和SAIA41C的序列與假禾谷鐮刀菌（F.pseudograminearum）的相似性最高；菌株SAIA419和SAIA41G的序列與腐皮鐮刀菌（F.solani）的相似性最高；菌株SAIA41H的序列與三線鐮刀菌（F.tricincturn）的相似性最高。

通過構建系統發育樹，將菌株SAIA411、SAIA417、SAIA41A、SAIA41E、SAIA41J、SAIA41N和SAIA41P鑒定為尖孢鐮刀菌：菌株SAIA413、SAIA41D、SAIA41F和SAIA41Q鑒定為F.incamatum-equiseti復合種；菌株SAIA41B和SAIA41C鑒定為假禾谷鐮刀菌：菌株SAIA419和SAIA41G鑒定為腐皮鐮刀菌：菌株SAIA41H鑒定為三線鐮刀菌（表2，圖2）。其中，尖孢鐮刀菌所占的比例最高，為43.75％，F.incamoturn-equiseti復合種次之，為25.00％。

2.3分離菌株的致病性

為明確分離菌株對玉米的致病性，根據菌株鑒定結果和菌落生長速度，我們選取菌株SAIA413、SAIA41C、SAIA41F和SAIA41N，測定其在玉米上的致病性。結果（圖3）表明，這4株菌株都能夠引起玉米苗期根部發病，造成根部變褐、腐爛以及發育不良。其中，菌株SAIA41C的致病力最強，造成玉米根部嚴重發育不良，幾乎喪失了所有須根。對發病根部進行病原菌分離，均得到相對應的接種菌，驗證了科赫氏法則。因此，尖孢鐮刀菌、F.inarnaturn-equiseti復合種和假禾谷鐮刀菌都能夠引起玉米苗枯病。

2.4分離菌株對戊唑醇的敏感性

分離菌株對戊唑醇的敏感性測定結果（表2）表明，16株真菌的EC50值為0.03-3.18 ug/mL，平均EC50值為0.36 ug/mL。其中，三線鐮刀菌的EC50值最高，假禾谷鐮刀菌的EC50值次之，F.incarnatum-equiseti復合種的EC50值最低（圖4）。假禾谷鐮刀菌與尖孢鐮刀菌和F.incamatum-eq-mseti復合種的EC50值之間存在顯著性差異；腐皮鐮刀菌與F.incamatum-equiseti復合種的EC50值之間也存在顯著性差異。

3討論與結論

玉米苗枯病主要是由鐮刀菌屬真菌復合侵染引起的。前期研究發現，在我國浙江省東陽市和天臺縣、山西省昔陽縣以及河西走廊地區，玉米苗枯病的主要病原為串珠鐮刀菌。在山東省泰安市以及東北地區，引起玉米苗枯病的病原主要是串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌。本研究中，引起玉米苗枯病的病原菌主要是尖孢鐮刀菌，這與以往報道不同。這可能有以下幾點原因：一是地理位置不同，此次分離的地點在山東省淄博市，之前未見報道；二是隨著時間的變化，優勢病原菌可能也在變化，已報道的玉米苗枯病病原的研究大多是十年之前的：另外，氣候改變以及病原菌的不斷進化也都有可能造成優勢病原菌的改變。

在防治病害的措施中，化學防治持效期長、便于操作、效果穩定且成本較低，是最有效的手段。但由于化學農藥的大量使用，導致田間出現了耐藥性和抗藥性菌株，因此，將殺菌機理不同、無交互抗性的殺菌劑復配使用，避免連續多年使用同一種殺菌劑，可以延緩病原菌產生抗藥性。目前，在自然環境中已經發現了具有戊唑醇抗性的禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌。另外，在F.incamatum-equiseti復合種中也檢測到對戊唑醇敏感性降低的菌株，但該抗性并非由基因CYP51C突變引起。本研究發現，大部分菌株對戊唑醇的EC50值在0.30 ug/mL以下，但其中一株三線鐮刀菌的EC50值為3.18 ug/mL。由于本研究菌株數量較少，后續研究需測定更多三線鐮刀菌對戊唑醇的敏感性，進而判斷是否所有的三線鐮刀菌對戊唑醇產生了抗藥性。