6株核桃腐爛病菌的分子鑒定及生物學(xué)特性比較

摘要：為探究核桃腐爛病菌的分類地位及生物學(xué)特性，本研究基于分子生物學(xué)方法對(duì)6株菌落形態(tài)有差異的核桃腐爛病菌進(jìn)行多基因聯(lián)合鑒定，并進(jìn)一步探究其致病性及生物學(xué)特性的差異。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，44-9-2B與Cylospora melnikii聚為一支，且自舉支持率為100％；菌株44-1-2C、51-1-3C與C.chrsosperma聚為一支；菌株49-2-IA、49-9-4D、53-1-3F與Valsa sordida聚為一支。致病性檢測(cè)表明，44-9-2B致病性最強(qiáng)，也最先產(chǎn)生分生孢子角，其次為菌株44-1-2C和51-1-3C，最后是菌株53-1-3F。生物學(xué)特性研究表明，6株致病菌最適生長(zhǎng)溫度均為28℃，最適pH值為6，光照對(duì)6株致病菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，各致病菌的最適氮、碳源不同。該研究結(jié)果可為核桃樹腐爛病的防治提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：核桃腐爛病；分子鑒定；生物學(xué)特性；致病性

中圖分類號(hào)：S436.64 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）12-0098-07

核桃是世界上重要的堅(jiān)果和木本油料樹種，面積及產(chǎn)量在各類干果中均居首位。中國(guó)是核桃生產(chǎn)大國(guó)，產(chǎn)量達(dá)365萬(wàn)t，居世界第一。新疆是核桃栽培的發(fā)源地，也是中國(guó)核桃主產(chǎn)區(qū)之一，種植歷史悠久，主要種植在南疆，以阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)、和田地區(qū)為主。核桃作為中國(guó)重要的木本油料產(chǎn)業(yè)之一，在保護(hù)生態(tài)、促進(jìn)貧困地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、實(shí)現(xiàn)我國(guó)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略等方面發(fā)揮著重要作用。

殼囊孢屬（Cytospora）真菌是引起核桃等林木腐爛病的主要病原菌，樹木被侵染后會(huì)出現(xiàn)枝枯、壞死等癥狀，導(dǎo)致樹勢(shì)衰弱，世界各地均有發(fā)生，能夠危害的寄主多達(dá)80余種。Index Fungorum中記載了700余種殼囊孢屬真菌。目前，新疆已記錄殼囊孢屬真菌50余種，其中金黃殼囊孢菌（Cytospora chrsosperma）在新疆的地理分布及寄主范圍最廣。杜琴報(bào)道引起新疆林木腐爛病的病原菌有3種（VaLsa ceratosperma、Vsordida、V.malicola）；郭開發(fā)等鑒定出C.chrysosperma（有性型V.sordida）為主要病原菌：Zhao等報(bào)道了伊犁的腐爛病菌C.niea；劉礎(chǔ)榮等研究發(fā)現(xiàn)新疆核桃樹腐爛病的主要病原菌是V.sordida；李猛等報(bào)道了在阿拉爾鑒定出核桃腐爛病的病原菌為裂褶菌（Schizophyltum commune）。綜上所述，在新疆引起核桃腐爛病的病原菌具有多樣性。

本研究擬對(duì)6株菌落形態(tài)有差異的核桃腐爛病菌進(jìn)行形態(tài)觀察、致病性檢測(cè)以及生物學(xué)特性分析，并通過(guò)多基因聯(lián)合分析確認(rèn)它們的分類地位及進(jìn)化關(guān)系，旨在為新疆核桃樹腐爛病防治提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

6株致病菌菌株分別為：51-1-3C、49-2-1A、44-1-2C、44-9-2B、49-9-4D、53-1-3F，由南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

核桃枝條采集于塔里木大學(xué)園藝試驗(yàn)站，核桃樹品種為新翠豐，選取2年生粗細(xì)一致的健康枝條。

PDA培養(yǎng)基：1 L水中加入馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g。

PSA培養(yǎng)基：1 L水中加入馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂15 g。

OA培養(yǎng)基：1 L水中加入燕麥片30 g。

核桃組織培養(yǎng)基：1 L水中加入核桃枝條韌皮部20 g（煮沸30 min，紗布過(guò)濾）、酵母提取物20 g、瓊脂粉15 g。

水瓊脂培養(yǎng)基：1 L水中加入瓊脂粉10 g。

1.2菌株形態(tài)學(xué)觀察

用直徑5 mm的無(wú)菌打孔器分別取培養(yǎng)3d的供試菌株菌落邊緣菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，26℃條件下暗培養(yǎng)3d，第2天開始每天觀察并記錄菌絲生長(zhǎng)情況（顏色、菌落形狀、表面形態(tài)、有無(wú)子實(shí)體、表面分泌物）。

1.3菌株致病性檢測(cè)

采用核桃枝條打孔接種法進(jìn)行致病性驗(yàn)證。取粗細(xì)均勻的核桃枝條截成10-15 cm段，去除葉和芽，用0.6％的次氯酸鈉溶液浸泡15-20min，用無(wú)菌水沖洗干凈后在超凈工作臺(tái)風(fēng)干。之后用石蠟封住枝條兩端剪口，用打孔器對(duì)枝條打孔。將供試菌株接種于PDA平板上，26℃暗條件下培養(yǎng)3d，在菌落邊緣處打取5 mm的菌餅，帶菌絲的一面緊貼打孔部位接種于打孔的離體枝條上，接種部位用塑料薄膜包裹保濕。以空白PDA為對(duì)照。將接種枝條于26℃、保濕、黑暗條件下培養(yǎng)，隔天觀察并記錄發(fā)病情況。

1.4不同培養(yǎng)基及不同培養(yǎng)條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

設(shè)置PDA、PSA、OA、水瓊脂、核桃組織培養(yǎng)基共5種培養(yǎng)基處理；溫度設(shè)定0、10、15、20、25、28、30、35、40℃共9個(gè)處理；pH值設(shè)定4、5、6、7、8共5個(gè)處理：光照設(shè)定24 h黑暗、24 h光照、12h光照／12 h黑暗交替3種處理。以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉分別代替Czapek培養(yǎng)基的碳源，以酵母提取物、牛肉浸膏、蛋白胨、硫酸銨、甘氨酸分別代替Czapek培養(yǎng)基的氮源，進(jìn)行不同碳源、氮源試驗(yàn)。將6株供試菌株按1.2的方法接種到不同處理中，每個(gè)處理重復(fù)3次，3d后采用十字交叉法測(cè)量并記錄菌落直徑。

1.5多基因聯(lián)合分子鑒定

采用郝海婷等的方法快速提取DNA，以提取的DNA為模板，利用ITS、EFl-a、TUB2和ACT的引物分別對(duì)病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物序列及反應(yīng)程序見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系（25uL）；DNA模板1 uL，2x Es Taq Master Mix 12.5uL，上、下游引物各0.3 uL，ddH20 10.9 uL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。利用ACOPTools V2軟件進(jìn)行序列比對(duì)和基因拼接，使用MEGA11.0軟件以鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用1 000次重復(fù)Bootstrap檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的支持率。

2結(jié)果與分析

2.1菌株形態(tài)學(xué)觀察

6株致病菌在PDA培養(yǎng)基上均能迅速生長(zhǎng)，各菌落正、背面均為白色，但菌落形態(tài)有所不同（表2，圖1）。其中，44-1-2C的菌落呈輻射狀生長(zhǎng)，菌絲稠密，菌落邊緣周圍氣生絲最稠密，培養(yǎng)到第5天菌落表面出現(xiàn)米黃色液體分泌物，第8天變成綠色；44-9-2B的菌落呈輻射狀生長(zhǎng)，菌絲較稀疏，蛛絲狀；51-1-3C的菌落呈輻射狀生長(zhǎng)，菌絲較稠密、雪白色、羽絨狀，在第8天表面產(chǎn)生子實(shí)體；49-2-1A的菌落呈輻射狀生長(zhǎng)，菌絲較稀疏，部分菌落邊緣會(huì)出現(xiàn)桔紅色分泌物，第7天開始產(chǎn)生子實(shí)體；49-9-4D的菌落呈輻射狀生長(zhǎng)，菌絲較稀疏，出現(xiàn)輪紋；53-1-3F的菌落呈圓形生長(zhǎng)，菌絲較稠稀疏且出現(xiàn)輪紋。

2.2菌株致病性測(cè)定

致病性測(cè)定結(jié)果表明，接種6株致病菌均可導(dǎo)致核桃枝條發(fā)生腐爛病。接種后8天，接種部位出現(xiàn)褐色、水浸狀病斑，且隨時(shí)間的推移向四周擴(kuò)散。接種后16天（圖2），接種部位變成黑色，枝條干枯。根據(jù)枝條病斑大小，6株致病菌致病力由強(qiáng)到弱依次為44-9-2B、44-1-2C、51-1-3C、49-2-1A、49-9-4D、53-1-3F。觀察發(fā)現(xiàn)，菌株44-1-2C、44-9-2B在第13天產(chǎn)生分生孢子角，51-1-3C、49-9-4D在第20天產(chǎn)生分生孢子角，49-2-1A在第24天產(chǎn)生，53-1-3F未產(chǎn)生分生孢子角。

2.3菌株生物學(xué)特性比較

2.3.1培養(yǎng)基種類對(duì)茵絲生長(zhǎng)的影響 由表3可知，6株致病菌均能在5種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但菌落直徑存在顯著差異。其中，44-1-2C對(duì)核桃組織培養(yǎng)基利用率較高，其余分離株在核桃組織培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢，利用率基本相同。菌株51-1-3C、44-1-2C、53-1-3F、49-9-4D對(duì)5種培養(yǎng)基的利用情況基本相似，在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好。菌株49-2-1A、44-9-2B則對(duì)PSA培養(yǎng)基利用率較高。

2.3.2溫度對(duì)茵絲生長(zhǎng)的影響 由圖3知，6株致病菌均能在15-35℃條件下生長(zhǎng)，其中菌株44-1-2C、44-9-2B在低溫（10℃）下能夠緩慢生長(zhǎng)，所有菌株在40℃高溫下均不能正常生長(zhǎng)，表明它們對(duì)高溫的適應(yīng)性較差。各菌株最適生長(zhǎng)溫度區(qū)間為25-30℃，最適生長(zhǎng)溫度為28℃。

2.3.3pH值對(duì)茵絲生長(zhǎng)的影響 由圖4可見(jiàn)，6株致病菌均能在5個(gè)pH值處理下生長(zhǎng)，最適pH值區(qū)間值為5-6，最適pH值為6。在中性至弱酸性條件下，菌落生長(zhǎng)好于弱堿性條件。

2.3.4光照對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響 6株致病菌均能在3個(gè)光照處理下生長(zhǎng)，但不同光照處理下菌落直徑存在差異（表4）。光照對(duì)各致病菌的菌落生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。

2.3.5碳、氮源對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響 由表5可知，6株致病菌在不同碳源、氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，但菌落直徑存在差異。其中，44-9-2B在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好；51-1-3C、49-2-1A在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快；44-1-2C、49-9-4D、53-1-3F在以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快。致病菌株在以蛋白胨、牛肉浸膏和酵母提取物為氮源的培養(yǎng)基中菌落直徑較大，硫酸銨、甘氨酸作為氮源不適合各致病菌的生長(zhǎng)。

2.4多基因聯(lián)合分析

選擇ITS、ACT、EFl-a和TUB2的完整序列，以Diaporther vaccinii（CBS 160.32）為外群，構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹。參考菌株序列的GenBank登錄號(hào)如表6所示。結(jié)果（圖5）顯示，菌株44-9-2B與C.elnikii聚于一支，自舉支持率為100％，表明兩者親緣關(guān)系極近：菌株44-1-2C、51-1- 3C與C.chrysosperma聚于一支，自舉支持率為55％；菌株49-2-1A、49-9-4D、53-1-3F與V.sordida聚于一支，自舉支持率為65％。

3討論與結(jié)論

本研究在致病菌形態(tài)觀察過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，6株致病菌在PDA培養(yǎng)基表面形態(tài)有所不同，其中49-2-1A部分菌絲會(huì)變成桔紅色，而44-1-2C產(chǎn)生米黃色液體。致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，6株致病菌均能表現(xiàn)出致病現(xiàn)象，但致病強(qiáng)弱有所區(qū)別，44-9-2B菌株致病性最強(qiáng)，且最先產(chǎn)出分生孢子角，而53-1-3F只表現(xiàn)出致病性，不產(chǎn)生分生孢子角。

為了明確這6株致病菌的分類地位，本研究通過(guò)ITS、EFl-a、TUB2和ACT多基因聯(lián)合建樹，得出44-9-2B與C.metnilm聚為一支且自舉支持率較高，可確定44-9-2B為C.melnikiio Norphanphoun等于2017年通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析及形態(tài)學(xué)鑒定確定了C.melniku是一個(gè)新種，F(xiàn)an等2020年在我國(guó)新疆地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)該菌。44-1-2C、51-1-3C與C.chrysosperma聚為一支，49-2-1A、49-9-4D、53-1-3F與V.sordida聚為一支，上述5株致病菌自舉支持率低。其原因可能是本研究選用的4種引物無(wú)法將5種菌株具體分類，需采用LSU、RPB2等更多的引物進(jìn)行基因聯(lián)合建樹，或采用全基因組測(cè)序進(jìn)行全面分析。本研究中C.melnikii（44-9-2B）為強(qiáng)致病菌，國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，可以進(jìn)一步深入研究其形態(tài)特性和生態(tài)環(huán)境，探索有效的防治方法，其余5種致病菌與劉礎(chǔ)榮等、李春艷、翟亞偉的研究結(jié)果相同。

為了探究病原菌的最適生長(zhǎng)環(huán)境，為防控措施提供理論依據(jù)，對(duì)這6株致病菌進(jìn)行生物學(xué)特性比較。結(jié)果顯示：6株致病菌最適溫度區(qū)間為25-30℃，最適溫度為28℃，與陳曉忍的研究結(jié)果相同；6株致病菌在pH值4-8之間都能正常生長(zhǎng)，最適pH值為6，這與翟亞偉的研究結(jié)果一致；不同光照處理下，6株致病菌均能在連續(xù)黑暗、光暗交替和連續(xù)光照條件下生長(zhǎng)，但光照對(duì)各菌株的菌落生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，與劉應(yīng)敏、劉振亞等的研究結(jié)果一致；6株致病菌均能在Czapek基礎(chǔ)培養(yǎng)基及供試其他碳源、氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中44-9-2B在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基生長(zhǎng)最好，49-2-1A、51-1-3C在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快，49-9-4D、53-1-3F、44-1-2C在以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快。可見(jiàn)，各菌株最適碳源不同，這與趙穎、邢紅亮等的研究結(jié)果相同；以酵母提取物為氮源最有利于各菌株的菌絲生長(zhǎng)，其次是牛肉浸膏和蛋白胨，而硫酸銨和甘氨酸則難以被菌株利用，這與孫朝華、尹永香的研究結(jié)果一致。不同碳、氮源研究結(jié)果表明碳源對(duì)6株致病菌株生長(zhǎng)影響較大。

綜上所述，本研究對(duì)6株致病菌進(jìn)行了形態(tài)觀察、致病性測(cè)定、分子鑒定以及生物學(xué)特性的比較分析。結(jié)果表明，6株致病菌在PDA培養(yǎng)基上表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征，其中49-2-1A和44-1-2C菌株差異最為顯著。致病性測(cè)定顯示所有菌株均具有致病性，44-9-2B為強(qiáng)致病性菌株，且最先產(chǎn)出分生孢子角。通過(guò)多基因聯(lián)合建樹分析，44-9-2B被確定為Cytospora metnikii，而其他5株致病菌的分類需進(jìn)一步研究。生物學(xué)特性比較結(jié)果顯示；6株致病菌最適溫度區(qū)間為25-30℃；最適pH值為6；光照對(duì)6株致病菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；不同菌株對(duì)不同碳源的利用率不同，44-9-2B對(duì)乳糖的利用率高，而其他菌株在葡萄糖或可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快：最佳氮源為酵母提取物。