油茶組織培養研究進展

關鍵詞：油茶；組織培養；表面消毒；褐化；培養基成分；培養條件

油茶是山茶科Theaceae山茶屬Camellia一類木本食用油料樹種的總稱。油茶是中國特有的木本油料樹種，在中國已有2300多年的栽培歷史，是世界四大木本油料作物之一[1-3]。由油茶種子（茶籽）榨取的茶油是一種富含不飽和脂肪酸、維生素E和山茶苷等活性物質的優質食用油，有“東方橄欖油”的美稱。除食用和烹調功能外，茶油及其副產品在日用化工、醫藥、農業和工業上都具有重要的用途，油茶是中國極具特色的經濟林樹種之一[4-9]。

植物組織培養技術不僅可被用來對植物進行工廠化快速繁殖，還是生物技術育種（如基因工程、基因編輯、體細胞雜交、突變體誘導與篩選、挽救雜種胚、體外授精等）的技術基礎[10]，因此，研究油茶組織培養有著重要意義。早在1978年，廣西林業科學研究所生理研究室顏慕勤等[11-15]對岑溪軟枝油茶進行了組織培養并獲得成功。與此同時，其他研究者也對油茶幼胚和未成熟子葉的離體培養[16-17]以及花藥培養[18]進行了探索。最近Li等[19]研究了普通油茶愈傷組織誘導、懸浮培養及原生質體分離。為了給研究者提供參考，根據外植體培養類型對油茶組織培養研究進展進行了論述。

1油茶芽和莖段的組織培養

油茶為天然雜合體，通過種子或實生苗繁殖的植株不易保持優良種性。采用油茶芽、莖尖和帶芽莖段進行培養，不但無性系繁殖后代保持了母株的優良性狀，而且由于存在分生組織，未經脫分化階段形成愈傷組織就可以產生叢生芽，從而減少了變異的可能。因此，這類外植體組織培養一般用于油茶種苗快速繁殖。

1.1外植體采集與表面消毒

組織培養中的污染和褐變是影響油茶組織培養的關鍵因素[20-22]，油茶組織培養中外植體污染情況較為復雜，也較難控制[21]。表面消毒的難易程度受品種、生長地區、外植體年齡、采集時間等因素影響。最簡單的表面消毒方法是用乙醇和升汞的常規組合方法。顏慕勤等[13]最早采用岑溪軟枝油茶成年樹的腋芽進行培養，在2—3月份腋芽剛開始萌動、芽苞剛開始膨脹時采集外植體。采回后剝去外面幾層苞片，用75%乙醇浸泡12s，用0.1%升汞消毒12～15min，然后用無菌水沖洗4～5次，在無菌條件下剝離腋芽的最后幾層苞片，將腋芽切成2～3mm長的小段接種。劉海龍等[23]以10月—次年1月岑溪軟枝油茶帶腋芽莖段為外植體，使用毛刷刷洗后用75%乙醇消毒10～15s，然后用0.1%升汞消毒10～15min，污染率最低（24.5%），其中用毛刷蘸洗潔精溶液刷洗莖段對莖段滅菌效果影響較大。1月底—4月新萌枝條不帶腋芽莖段較好的滅菌方法為75％乙醇消毒4～7s，0.1％升汞消毒5～6min，污染率為14.3%。陳勝群等[24]取小果油茶當年生帶芽莖段作為外植體，用清水沖洗后，在超凈工作臺上用75%乙醇消毒10s，然后用1.0g/L的升汞消毒滅菌10min，無菌水沖洗5次。

利用乙醇和升汞的常規組合方法對油茶進行消毒的效果一般較差。流水沖洗對降低污染率有重要影響。吳正凱等[25]取飽滿頂芽用流水沖洗干凈后，用中性洗衣粉溶液輕輕刷洗芽苞，再置于水龍頭下用流水沖洗2～3h，然后用75%乙醇快速進行表面滅菌，用無菌水沖洗3～4次，再用0.1%升汞消毒處理5min，最后用無菌水沖洗8～10次。黃莉雅等[26-28]以油茶品種岑軟2號和岑軟3號的鮮嫩帶芽的莖段和頂芽為外植體，用流水沖洗干凈后，用中性洗衣粉溶液輕洗，再置于流水下沖洗2～3h，接著用75%乙醇快速滅菌30s，用無菌水沖洗3～4次，然后用0.1%升汞消毒6min，在各處理中這種處理的誘導效果最好，成活率分別達71%和73%。劉海英[29]取3—5月份當年生嫩枝，用紗布包裹脫脂棉蘸少許清水輕輕擦洗枝條表面的塵土和絨毛，再用流水沖洗干凈，然后用洗衣粉溶液浸泡10min左右（其間不斷攪拌以使清洗均勻徹底），再用流水洗凈表面洗衣粉溶液并置于流水下沖洗2～5h，濾干水分后用75%的乙醇浸泡約30s，用無菌水沖洗3～5遍，最后用0.1%升汞消毒8min，在各處理中這種處理的腋芽啟動率最高，可達64.0%?？碌て糩30]在用乙醇和升汞組合消毒材料（帶腋芽莖段使用70%乙醇浸洗30s和0.1%升汞消毒7min的效果最好）之前，用自來水沖洗后用洗潔精溶液浸洗15min，然后置于流水下沖洗2～4h。萬珠珠等[31]在用乙醇和升汞組合消毒材料（帶腋芽莖段使用75%乙醇浸洗8s和0.1%升汞消毒8min的效果最好）之前，用自來水沖洗數次后，在洗衣粉溶液中浸泡12～20min，再用自來水沖洗2h。何超銀[32]以當年生帶芽莖段為外植體，用刷子輕輕擦洗表面的塵土和絨毛后，用洗潔精溶液浸泡5min左右，再用自來水沖洗30min，用無菌水沖洗3次后，用75%乙醇處理30s，用無菌水沖洗8～10次后用0.1%升汞處理10min，在各處理中這種處理的效果最好。代忠迪等[33]在2次消毒之前，先將枝條外植體在5℃恒溫箱中低溫處理8h，再將經低溫處理的油茶無性系組培外植體進行修剪，在0.1%的多菌靈溶液中浸泡6min，然后用流水沖洗5h。

為了降低污染率，有研究人員采用重復消毒的方式。李澤等[34]取普通油茶當年生半木質化莖段作為外植體，用自來水沖洗20min左右，再用洗衣粉溶液浸泡15min，用自來水沖洗干凈后，用75%的乙醇浸泡2次（每次30s），用無菌水沖洗3～5遍，然后用0.1%的升汞消毒2次（第1次10min，第2次5min），用無菌水沖洗5遍，最后用濾紙吸干莖段表面水分。唐國濤等[35]將大棚內2年生油茶扦插苗嫩枝剪去葉片后，用洗潔精溶液清洗，再用無菌水反復沖洗后，用0.05%升汞溶液消毒6min，用無菌水沖洗后，再用升汞溶液重復消毒1次。王瑞等[36]將外植體用流水沖洗干凈后，用中性洗衣粉溶液輕洗，將莖段置于流水下沖洗2～3h，先用75%乙醇快速滅菌10s，然后用無菌水沖洗3次，接著用0.1%的升汞消毒2min，用無菌水沖洗3次，再用0.1%的升汞消毒3min，最后用無菌水沖洗5次。賈效成等[37]也采用了類似的方法，取油茶頂芽或腋芽在流水下沖洗1h，先用75%乙醇快速滅菌10s，然后用無菌水沖洗3次，接著用0.1%升汞消毒2min，用無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞消毒3min，最后用無菌水沖洗5次。代忠迪等[33]采用2次消毒來降低污染率：第1次消毒時，將帶芽莖段外植體剝去外層葉鞘，用76％的乙醇消毒，然后用0.2％升汞消毒，再用無菌水漂洗，然后剝去中層葉鞘用0.1％升汞消毒，再用無菌水漂洗若干次；第2次消毒時，用75％的乙醇消毒16s，無菌水沖洗5次。

在傳統的“乙醇+升汞”表面消毒方法的基礎上，輔以超聲和低溫冷處理可更好地清除外植體表面雜質，并有助于洗脫外植體內酚類物質，降低污染率和褐化率。具體做法：取油茶樹當年萌發的春梢（1/3～1/2長度的枝條基部由綠色轉變為褐色）作為外植體，依次用乙醇和升汞進行表面滅菌，然后依次進行超聲處理（外植體浸入無菌水中，在300～500W、10～30℃條件下超聲處理2～4h）和無菌冷處理（外植體浸入無菌水中，置于3～5℃冰箱中4～6d，其間每隔1d更換1次無菌水），得到滅菌外植體，再經升汞滅菌后，修剪成用于組織培養的外植體莖段[38]。

盡管常將乙醇和升汞組合使用進行外植體表面消毒處理，但是有少數研究結果表明，乙醇和升汞處理對外植體的毒害較強，處理時間不易掌握。而以2.5%次氯酸鈉對油茶帶芽莖段和腋芽消毒20min的效果最好[39-40]。

為了增強消毒效果，有研究人員采用次氯酸鈉和升汞復合消毒處理。侯辛辛[41]取當年生半硬油茶枝條的頂芽或帶腋芽的莖段作為外植體，先用軟毛刷蘸淡硫磺皂0.1%稀釋液刷洗，流水漂洗10min，用70%乙醇浸泡漂洗45s后，再用3種試劑進行組合消毒。結果表明：單獨使用0.1%升汞和2%次氯酸鈉消毒均不能起到滅菌的效果，外植體污染率達到100%；采用2%次氯酸鈉與0.1%升汞復合消毒的方法后，污染率降至10%以下，在此基礎上將0.4%多菌靈添加在培養基中，污染率與誘導率均降低，但未達到顯著水平。2%次氯酸鈉溶液（消毒15min）與0.1%升汞（消毒12min）聯合使用為最適消毒方法。

在油茶組織培養過程中，即使進行了嚴格消毒，也會遇到嚴重的污染問題。因此有研究者使用抗生素、殺菌劑及防腐劑來進行抑菌。王瑞等[42]在繼代培養基中分別添加不同種類和質量濃度的抗生素和防腐劑，結果表明添加鏈霉素20mg/L的抑菌效果最佳，污染率為0，增殖系數為3.69，其次為青霉素G鈉鹽、青霉素G鈉鹽+四環素、四環素，添加多黏菌素B的抑菌效果最差，采用苯甲酸鈉、山梨酸鉀作為抑菌劑，污染率均在92%以上。張騏飛等[43]試驗了多種消毒方法，發現如下方法效果最佳：取當年生半硬枝條在流水下沖洗10min，用0.1%硫磺皂稀釋液浸泡并用軟毛刷蘸刷嫩枝條，用流水漂洗干凈后，剪成帶單個腋芽或頂芽的莖段，先用75%乙醇浸泡45s后，用0.1%升汞處理12min和2%次氯酸鈉處理15min進行復合消毒，然后接種在添加0.1g/L的殺菌劑清菌易芽的萌動培養基上。

然而在培養基中添加抗生素、殺菌劑及防腐劑來抑菌，可能會影響到外植體的培養[10]。由于野外采集的外植體不易消毒，有研究者取室內或溫室內萌發的新芽作為外植體。楊育紅[44]先將明月山紅花油茶多年生硬枝插入盛有濕潤河沙的紙箱內，以其新萌發的側芽為材料進行試驗。將芽于流水下沖洗1h后，用無菌水浸泡10min，用70%乙醇浸泡15s左右，然后用0.1%的升汞溶液（加少許吐溫80）滅菌4～8min，再用無菌水清洗4～5次。唐國濤等[35]將扦插成活且健壯的油茶苗種植在塑料大棚內的花盆里，2月下旬—3月中旬取2年生扦插苗帶側芽的嫩枝，剪去葉片后用洗潔精溶液清洗，再用無菌水反復沖洗，然后切成帶1～2個側芽的莖段，用0.05%升汞溶液消毒6min，用無菌水沖洗后，再用升汞溶液重復消毒1次。龔崢等[45]為了降低污染率，先將植株移栽上盆，待生長穩定后移入大棚管護；采集外植體前給植株的地上部分套上透明薄膜袋，每天對全株枝葉噴1次多菌靈，連續噴7d；剪取枝條后用洗衣粉溶液刷洗枝條表面，用流水沖洗0.5h，然后浸入0.025%的升汞液中20min，同時用小毛刷仔細刷洗枝條表面，流水沖洗0.5h；在超凈工作臺上用70%乙醇浸泡1min，用0.1%升汞溶液消毒6min，用無菌蒸餾水沖洗6次。陳春[46]采取預培養的方式來降低污染率：取油茶優良無性系閩43的帶腋芽莖段，用自來水沖洗1～2h，用無菌水沖洗2遍，用70%乙醇溶液處理30s后立刻浸入0.1%升汞溶液中消毒10～12min，或浸入0.15%升汞溶液中消毒8～10min，用無菌水沖洗5遍后瀝干，以莖尖為中心，切成2cm左右莖段，接種于未添加生長調節劑的MS培養基上，培養20d，確定無菌后轉入初代培養基上。經這樣處理的外植體的存活率可達45%以上。陳博雯等[47]將在4—5月或9—10月采集的半木質化莖段，用75%乙醇消毒5s和0.1%升汞消毒10min后，接種在含有改良MS液體培養基的河沙基質中，將新萌發的嫩芽接種至MS固體培養基上培養7d，可將未被污染的無菌芽用于下一步的組織培養。采用該方法不僅可降低污染率，還能有效避免褐化，有效萌芽率最高可達90.91%。劉虹[48]將去殼油茶種子置于河沙中萌發，然后取1月生實生苗帶腋芽的莖段來培養。雖然實生苗容易消毒，但這種組織培養快速繁殖體系本質上與實生苗繁育無差別，即繁殖的植株與親本存在變異。

除消毒方法外，采集月份（即使在連續晴天時采集）可能是影響外植體表面消毒效果的重要因素。通常春季（2—3月）和秋冬季采摘的腋芽在培養基上容易萌發，且污染現象不明顯，而夏季采摘的腋芽不易萌發且易被污染，這可能與外植體的季節性帶菌情況有關[21]。王以紅等[49]以7齡‘岑軟3號’油茶母樹的健壯嫩梢為外植體，研究不同月份采摘的樣本的消毒難易程度，利用70%乙醇預處理15s和0.1%的升汞消毒（頂芽6min，莖段芽15min），結果表明無菌活外植體得率不同，2個高峰期分別為4月和10月，無菌活外植體得率最低的是8月，其次是7月。無菌活外植體得率與氣候特點相關聯，因為高溫高濕環境有利于外植體表面的微生物繁殖。張偉寧[50]采用與劉海英[29]類似的方法進行試驗，發現在4—6月、7—9月、10—12月3個時間段采集的半木質化帶腋芽莖段中，以4—6月所采集材料的萌發效果最佳，用0.1%升汞處理8min的消毒效果最好，污染率為7.33%，褐化率為5.87%，萌發率為83.11%。陳博雯等[47]的研究結果表明，帶腋芽的枝條經消毒處理后，秋冬季節污染率較低，1月份污染率最低（26.00%），2月份起隨著當地氣溫回升和濕度加大，污染率逐漸升高，至4月份達最高（66.00%），8月份以后逐漸降低。11月—次年2月的消毒效果較好。以無木質化、半木質化、木質化莖段為材料，消毒效果差異不大?？碌て糩30]的研究結果表明，帶腋芽莖段最佳取材時期為4—6月，此時期的材料污染率、褐化率及死亡率均較低，而腋芽萌發率最高，培養20d后達75.55%。

1.2外植體和培養物的褐化

除污染問題外，由于油茶等山茶科植物中酚類物質含量較高，酚類的糖苷化合物是木質素、單寧和色素合成的前體，所以在油茶組織培養過程中極易發生褐變，嚴重褐變會導致外植體和培養物的死亡[20-21]。闕生全等[51]經研究發現油茶外植體褐化程度與培養溫度、培養基中生長調節劑種類（如2，4-D、KT和NAA）及其濃度、無機鹽含量等因素有關。較高的培養溫度、培養基中較高濃度的無機鹽、較高濃度的生長調節劑及木質化程度高的外植體均會促進褐化的發生，在培養基中加入吸附劑能有效抑制褐化的發生。吸附劑活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及抗壞血酸（維生素C）、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）和檸檬酸3種抗氧化劑對褐化的影響存在差異，以吸附劑的抗褐化效果最好，維生素C效果次之，Na2S2O3和檸檬酸效果較差。接種后進行暗處理，可在一定程度上減輕褐化反應。戴小英等[52]發現在增殖過程中，以H改良培養基作為基本培養基可有效防止油茶外植體褐化，比在培養基中添加活性炭的效果好。蔡玲等[53]發現在岑軟2號油茶繼代增殖培養基中添加20～25mg/L的維生素C，能有效減少油茶繼代芽的褐化，褐化率從73%降低到4%。

1.3培養基成分和培養條件

油茶組織培養快速繁殖研究始于20世紀70年代末—80年代初。顏慕勤等[11]最早對10年生以上的老齡油茶的嫩莖及莖尖進行培養，發現用SH或H作基本培養基，并添加不同NAA和BAP組合，較難培養出愈傷組織，經7～8周培養，僅60%～70%的外植體長出愈傷組織，且無瘤狀物及綠芽出現，但根發育良好。顏慕勤[14]采用添加有不同種類及濃度植物生長調節物質的改良ER固體培養基，培養在2—3月采集的岑溪軟枝油茶成年樹腋芽。30d后腋芽生長點開始分化叢生小苗，且芽基部能不斷分化叢生苗。此后，關于油茶組織培養快速繁殖的研究報道持續出現。以油茶芽和莖段為外植體的組織培養研究大多采用MS、WPM、H改良、1/2MS作為基本培養基，再添加不同類型和不同濃度的細胞分裂素（6-BA或BA、ZT、TDZ）和生長素（NAA、IBA、IAA），有時會添加GA31.0～6.0mg/L或有機附加物如水解酪蛋白（CH）500～600mg/L，達到改善培養效果的目的（表1）。

目前主要采用頂芽、腋芽和帶芽莖段進行油茶組織培養與快速繁殖研究。莖尖分生組織可用于脫除植物病毒和種苗快速繁殖，但由于外植體體積小，培養起來相對較困難，鮮見報道，目前僅見張桂琴等[63]采用改良1/2MS培養基對大果紅花油茶芽尖組織進行培養的報道。油茶組織培養快速繁殖以芽生芽途徑（如叢生芽途徑）為主，這種方式是以促進芽原基上腋芽的不斷提早萌發來實現數量增殖。培養階段主要分為芽誘導或萌發培養、增殖培養、壯苗培養和生根培養幾個階段，一般不涉及誘導愈傷組織及愈傷組織分化。有研究者以油茶芽和帶芽莖段為外植體來誘導愈傷組織[26-28，37，64]，但一般認為利用帶芽的莖段和頂芽為外植體，經愈傷組織途徑對油茶快繁的意義有限。不過，在其他外植體難以再生的情況下，或可將該方法與轉基因技術結合使用[65]。油茶組織培養中較為重要的2個階段分別是增殖培養和生根培養。實現苗芽良好增殖是組織培養的基礎，生根則關系到得到完整的再生植株及油茶組織培養快速繁殖真正進入生產實踐。

在油茶增殖培養研究方面，戴小英等[52]發現，以MS、WPM為基本培養基時，褐化嚴重，葉片易出現卷曲、脫落，以H改良為基本培養基可明顯減少褐化現象，有較多有效芽產生，以H改良+BA2.0mg/L+IAA1.0mg/L的增殖效果為最佳。王瑞等[36]以‘湘林1號’組培無菌苗為材料，研究了基本培養基（WPM、MS和B5）、生長調節物質類型及濃度對油茶組培苗增殖體系的影響，發現以WPM+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+生物素1.0mg/L為培養基時增殖系數最高，以MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.01mg/L+生物素0.5mg/L為培養基時新梢生長效果最好。蔡玲等[53]以‘岑軟2號’組培繼代芽為材料，研究了幾種影響油茶組培芽增殖與生長的因素，發現在繼代培養基（改良MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L）中添加CH200或300mg/L，不僅能有效地提高繼代芽增殖系數，還能促進芽生長，縮短培養時間8～10d。同時添加20mg/L維生素C能有效減少油茶繼代芽褐化的發生。油茶組培繼代芽培養最適宜的光照條件是在自然散射光（2000～3000lx）下培養10d，后期移至3000～5000lx光照條件下再培養20d，每瓶的有效芽可達23株。He等[66]研究了光質對普通油茶不定芽增殖的影響，發現在紅藍組合光（4∶1）條件下增殖系數最高，葉片也最厚。曾艷玲等[62]發現，在芽誘導階段采用白光（誘導培養基為1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.01mg/L），在增殖、壯苗和生根階段采用紅藍光（紅、藍為4∶1，增殖培養基為MS+6-BA1.0～4.0mg/L+IBA0.01～0.20mg/L，壯苗培養基為1/2MS+GA35.0mg/L+IAA0.01mg/L，生根培養基為1/2MS），可促進油茶帶芽莖段植株再生。

油茶生根培養方面，顏慕勤等[13]最早進行了探索，采用不同濃度的吲哚丁酸、吲哚乙酸及萘乙酸等生長素，及固體培養基、液體培養基、蛭石及濾紙紙橋等培養基進行生根試驗。在參試的3種生長素中，添加NAA處理的生根率最高（100%），其根系粗壯，須根多，出根快，僅培養7～8d即開始出根。添加IBA處理的生根率明顯低于添加NAA處理，添加IAA處理中組培苗雖有一定的生根能力，但切口處易生愈傷組織，移栽后愈傷組織易發黑壞死，影響小苗的成活率。最佳誘導生根的NAA質量濃度為8mg/L。在4種培養基中，濾紙紙橋培養的生根效果最佳，在瓊脂培養基上組培苗易生愈傷組織，在液體培養基上組培苗不但生根量少，而且多數植株僅在液面以上部分生根，液面以下部分生根量較少，呈明顯的倒塔形。在其后的研究報道中，大多采用附加較高濃度的生長素（或者同時附加較低濃度的細胞分裂素）的低鹽基本培養基（如1/2MS和WPM等）（表1）。吳幼媚等[67]采用1/2MS、1/2WPM、1/2ER基本培養基對油茶‘岑軟2號’無性系組培苗生根培養進行了研究，結果表明基本培養基是影響油茶組培苗生根的重要因素，其次是培養溫度，植物生長調節劑是影響較小的因素。1/2ER為油茶組織培養最適基本培養基，ABT60.5mg/L+IAA2.0mg/L+NAA0.8mg/L為最優的生長調節劑濃度組合，室溫（28±2）℃、光強2500～3500lx有利于油茶組培苗生根。

油茶組培苗生根存在較大的難度，采用含NAA和IBA的常規生根培養基進行培養時，生根苗大多僅1條主根，須根較少[20，40]。唐國濤等[35]以1/4MS、1/2MS、MS、B5等基本培養基配以NAA、IBA、IAA、GA3、2，4-D進行生根試驗，經過多次多組合試驗均未能篩選出適合油茶生根的培養基。龔崢等[45]發現采用常規的培養方法無法誘導廣寧紅花油茶植株生根，但采用針對調節極性表現的程序系列培養，可促進不定根分化，提高生根率，但作者未提供技術細節。譚曉風等[58]發現在1/2MS+IBA0.5mg/L的瓊脂培養基中加入珍珠巖，使油茶根系能夠充分呼吸，大大提高了油茶生根率和移栽成活率。制備方法：配制1/2MS+IBA0.5mg/L瓊脂培養基（瓊脂為7～10g/L，pH5.0～5.5），然后用網兜包好粉碎的珍珠巖，置于融化的培養基中，使珍珠巖充分吸收培養基，稍瀝干后滅菌即可。

鑒于在常規生根培養基上組培苗生根存在困難，研究者多采用兩步法促進組培苗生根，即首先在高濃度的生長素培養基上誘導生根，然后轉接到無任何生長素的培養基上進行根的發育，或者首先用高濃度的生長素溶液浸泡處理苗芽基部，然后進行扦插（即瓶外生根法）[68]。范曉明[54]采用1000mg/L的IBA處理芽苗基部5s，然后轉入1/2MS空白培養基進行培養。陳永忠等[55]采用1000mg/L的IBA溶液浸泡苗基部10s，然后接種在1/4MS+AC200培養基。張偉寧[50]發現瓶內生根最佳培養基為1/2MS+NAA2.0mg/L+蔗糖20g/L，將小苗莖段基部在1000mg/L的NAA溶液中蘸20s，然后在1/2MS培養基中培養的效果最佳。袁德義等[57]發現試管苗經1g/L的IBA處理5s后，轉入1/2MS空白培養基培養，50d后生根率高達88.3%。陳永忠等[56]采用瓶外生根方法（將生根和移栽步驟合二為一）可提高組培苗的生根率和成活率。具體方法：將組培苗從培養瓶中取出后，在0.1%瑞毒霉-錳鋅溶液中浸泡2～4min進行消毒，之后將組培苗基部在500～8000mg/LKIBA溶液中浸泡3～4s，然后扦插在由黃心土、炭化谷殼灰、細沙按體積比1∶2～3∶1配制而成的基質上，最后用透光薄膜封口。劉虹[48]通過對比瓶內生根和瓶外生根方法，發現瓶內生根處理的生根率較低，根系脆弱，移栽成活率也較低，瓶外生根（100mg/LNAA浸泡幼苗45min后扦插移栽）處理的生根率較高，且根系粗壯，移栽成活率高。唐國濤等[35]以細沙作基質（將濕潤的細沙裝入玻璃瓶中，厚度2.5～3.0cm，然后經高壓滅菌處理），將培養60d以上、長5cm的木質化油茶莖段（切去基部2cm以內的葉片）基部在0.1mg/L、深度約2cm的GGR（6號生根粉）溶液中浸泡12h，然后進行扦插，生根率達95%。唐國濤等[35]認為油茶組培苗生根較為困難，可能與誘導和增殖培養過程中6-BA和外源植物生長調節劑在油茶組培苗中的累積有關，將繼代培養的叢生芽轉接到無6-BA和外源植物生長調節劑的MS培養基中培養，可有效降低6-BA和外源植物生長調節劑累積效應對苗木產生的影響。戴小英等[59]比較了油茶組培苗的根系質量及移栽成活率，發現試管外生根方法更具優勢。傳統試管內誘導根系需40d以上，且生根率和根數量不理想，而采用高濃度生長調節劑進行短期誘導（在1/2H改良+NAA3.0mg/L培養基中培養10d）后，蘸取生長調節劑GGR200mg/L，直接扦插到黃心土和草木灰（6∶1）基質上，30d后組培苗可在基質中產生根系。閆曉芳等[61]采用1.5～3.0g/LIBA誘導處理芽苗3～30min后，接種到1/2MS+多效唑2～6mg/L培養基上進行生根培養，可促進油茶組培苗生根。為了繞過油茶組培苗生根困難環節，有研究者對增殖芽進行壯芽和煉芽后，將其作為接穗，以種子萌發的胚芽為砧木，進行芽苗砧嫁接[33，43]。

此外，為探明油茶組培苗生根機制，王瑞等[69]研究了油茶組培苗生根過程中生理生化指標的變化，陳曉明等[70]研究了油茶組培苗生根過程中過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）等的活性變化。

2油茶胚、子葉、葉片等的組織培養

采用油茶胚、子葉、葉片等外植體進行培養，可以經直接體細胞胚胎發生或直接器官發生途徑實現植株再生（即不經過愈傷組織階段），也可經愈傷組織階段通過間接體細胞胚胎或間接器官發生途徑實現植株再生。特別是間接體細胞胚胎或器官發生途徑需要首先誘導產生胚性愈傷組織，再經體細胞胚胎或器官發生途徑產生完整植株，最有利于進行遺傳轉化和基因編輯，因此受到許多研究者的重視[10]。此外，采用幼胚培養產生完整植株，可以在遠緣雜交中挽救雜種胚，對于油茶遠緣雜交育種具有重要意義[10]。以油茶胚、子葉、葉片為外植體進行培養時，大多以MS為基本培養基，采用不同比例的細胞分裂素（6-BA或BA、KT、ZT、TDZ）和生長素（NAA、IBA、IAA）組合。與培養芽和帶芽莖段不同，有研究者采用生長素2，4-D來誘導胚、子葉、葉片產生愈傷組織（表2）。

2.1油茶胚和子葉的組織培養

油茶胚和子葉培養有2種情況，一種是取成熟胚和子葉進行培養，另一種是取未成熟胚和子葉進行培養。由于油茶種子十分堅硬，難以從成熟種子中分離胚和子葉，因此，一般先將種子表面消毒后進行無菌萌發，然后取子葉和胚軸進行培養。從正在發育的種子中切割分離未成熟胚（幼胚）和子葉相對容易，因此，通常取幼果或幼嫩種子進行表面消毒，然后取胚、子葉和胚軸進行培養。與大田植株的葉片相比，合子胚（包括子葉和胚軸）的表面消毒較為容易，而且培養反應能力更強，更易培養。但是油茶通常為異株授粉，合子胚來源于母株的有性雜交后代，與母株在遺傳上是異質的。

顏慕勤[12]首先報道在油茶種子的子葉基部可誘導體細胞胚狀體發生。其采用1～2月齡無菌實生苗的節間及下胚軸作為外植體，可誘導出愈傷組織和小瘤狀物。用SH或H作為基本培養基，附加NAA0.5mg/L和BAP0.5mg/L最有利于小瘤狀物的產生；再加入10mL油茶子葉浸出液可以把瘤狀物的產生率從1%增加至10%。將外植體轉移到無任何生長調節劑的SHO培養基上，會進一步長出不定芽及小苗[11]。其后，彭秋發等[72]、蔡玲等[74]采取油茶種子無菌萌發后的子葉等外植體進行培養，林青[76]、Li等[77]將成熟種子的種仁進行表面消毒，然后切取油茶成熟種胚（帶有胚乳組織）接種在1/2MS培養基中獲得無菌苗，然后取無菌苗的子葉、下胚軸進行不定芽誘導。

隆振雄[16]最早對油茶幼胚進行培養，將油茶幼果進行常規表面消毒（先用70%的乙醇消毒30s，再放入0.1%的升汞中消毒30min，然后用無菌水反復沖洗3～4次）后，用無菌刀切割并剝出幼果種胚，再割成長2～3mm的組織塊接種。隆振雄[16]采用N6、White和MS基本培養基進行試驗，結果表明在White培養基上誘導效果良好，其次是MS培養基。White+BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L或White+2，4-D0.02mg/L+NAA0.05mg/L+BA0.5mg/L培養基對油茶幼胚愈傷組織及胚狀體的誘導效果較好。在同一誘導培養基上，油茶幼胚組織的胚狀體誘導率與加入鉬酸銨量呈現正相關，在誘導培養基中加入10mg/L鉬酸銨，誘導率約提高1.6%。幼胚發育時期從3月油茶幼果開始膨大時起，至9月中旬茶果即將成熟時止。在幼胚尚未形成時取樣培養，難以獲得成功；只有在幼胚長2～3mm時取樣培養，才能誘導出愈傷組織，并產生胚狀體。油茶幼胚胚狀體的最佳芽分化培養基為N6+IAA0.5mg/L+BA2.0mg/L+LH（水解乳蛋白）500mg/L。N6培養基的分化效果較好，其次是MS培養基。分化植株的頻率在較大程度上取決于生長調節劑種類和比值，如在N6分化培養基中，細胞分裂素與生長素的比值為4的條件下，添加BA比添加KT的分化效果好，分化植株的頻率高。為了保持優良組合的雜交優勢并擴大再繁殖，盧天玲[17]對油茶未成熟子葉和幼胚進行了離體培養，采用附加2mg/LNAA和4mg/LBA的MS基本培養基誘導愈傷組織，然后轉入減少或無生長素及提高細胞分裂素的培養基上分化叢生苗，也可以在再分化培養基上直接誘導叢生苗。生長素NAA、IAA對愈傷組織的誘導與分化均有良好效果，BA、ZT、NAA的適當配比是誘導叢生小苗的重要因素。只有綠色或黃綠色的愈傷組織才能分化。培養基含2，4-D或5%以上的蔗糖均不利于愈傷組織綠化，也不利于分化。6月之后，油茶種子的胚乳已完全消失，以此時的子葉和幼胚作為外植體較易誘導成苗。韓春霞[88]以六倍體‘華碩’自然授粉后7—8月份的幼胚為外植體，發現在WPM+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L+NAA1.5mg/L+6-BA2.0mg/L培養基上，幼胚成苗效果最佳。畢方鋮等[40]采用普通油茶優良無性系‘湘林4號’油茶幼果為材料，進行表面消毒后，直接剝去外層種皮，取出幼胚，將子葉基部切成0.3～0.5cm3的組織塊接種。此后，范曉明[54]、范曉明等[73]、胡玉玲等[75]、侯辛辛[41]、王江英等[80]、龐芳芹等[81]采取類似方法對果實進行滅菌，然后取出種子，分離幼胚和子葉進行培養。張智俊[39]、張智俊等[71]將油茶未成熟果實進行表面消毒后，剝去外種皮，置于無生長調節劑的MS培養基上進行萌發培養，然后將子葉切成小塊作為外植體，結果表明附加適量的2，4-D和KT有利于胚性愈傷組織的形成，油茶胚狀體起源于單細胞原胚或者多細胞團，多從表皮細胞的胚性愈傷組織誘導產生[89]。

2.2油茶葉片的組織培養

與合子胚（包括子葉和胚軸）相比，以在無性繁殖植株上采集的葉片進行組織培養，其再生植株理論上與母株在遺傳上是同質的，且油茶葉片來源豐富，容易取材。但是葉片隨其生長部位和發育年齡不同，表達細胞全能性的能力是不同的，培養反應性比合子胚差，從大田采集的葉片還存在難消毒和容易褐化的問題。為了解決表面消毒難的問題，有研究者取組培苗的葉片[90]，或實生苗的葉片培養[48，83]，但后者會帶來遺傳上的異質性問題。

王瑞等[82]取油茶優良無性系‘湘林1號’和‘湘林4號’當年生枝條上完全展開的嫩葉進行愈傷組織誘導，發現2個品種愈傷組織的萌發時間以及誘導率差別較大?！媪?號’以MS+IBA0.01mg/L+KT0.5mg/L+2，4-D0.5mg/L+NAA2.0mg/L為培養基最佳，‘湘林4號’以IBA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L+KT1.0mg/L+NAA2.0mg/L為培養基最佳，對于‘湘林4號’來說，在4種基本培養基（MS、WPM、N6、改良ER4）中，以改良ER4為佳。此外，低溫預處理5～10d有助于愈傷組織的誘導，光照條件（暗培養較好）和葉片部位（葉柄較差）均對愈傷組織的誘導有影響。袁德義等[57]通過直接器官發生途徑使葉片外植體產生不定芽，蔡冬元[84-85]則以間接器官發生途徑使外植體產生不定芽。黃武[86]以幼嫩枝條頂端嫩葉為外植體，用MS+毒莠定16mg/L+CuSO42μmol/L誘導出白色松脆的愈傷組織，用WPM+NAA1mg/L+6-BA1mg/L誘導出綠色致密的愈傷組織，用WPM+KT0.5mg/L+NAA0.5mg/L誘導出結節性愈傷組織。對培養基進行優化后，可獲得4種類型的愈傷組織。在MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L+ZT0.5mg/L+TDZ1mg/L上可獲得結構松脆的白色愈傷組織，轉接到WPM+NAA2mg/L+ZT2mg/L培養基上6周后可形成黃色胚性愈傷組織，再轉接到MS+NAA0.5mg/L+2，4-D2mg/L培養基上8周后可分化出體細胞胚，體細胞胚在MS+6-BA1mg/L+NAA0.5mg/L培養基上4周后可產生綠色子葉。子葉在MS+6-BA1mg/L培養基上可直接分化成芽，將子葉切碎后轉接到MS+6-BA1mg/L+NAA0.5mg/L培養基上可脫分化形成愈傷組織；剝離出胚性愈傷和體細胞胚，在MS+NAA0.5mg/L+2，4-D2mg/L培養基上繼代增殖，可實現體細胞胚循環培養。王瑞等[90]以油茶優良無性系‘湘林1號’的無菌組培苗葉片為外植體，比較分析了蔗糖、果糖、葡萄糖、白糖和麥芽糖5種碳源以及不同蔗糖濃度對油茶愈傷組織誘導的影響。結果顯示在碳源中蔗糖（30mg/L）處理的誘導率最高（100%），以白糖為碳源誘導率達到93.3%，其可作為替代碳源。

以葉片為外植體進行培養時，酚類物質會從葉片切口處釋放到周圍的培養基上，導致葉片褐化死亡，愈傷組織的誘導率降低。劉海英[29]發現低溫預處理7d能較好地抑制葉片愈傷組織褐化，張偉寧[50]、柯丹萍[30]的研究結果表明消毒后暗培養7d能有效抑制褐化現象。黃國文等[91]以油茶葉片為外植體，研究了誘導愈傷組織過程中降低外植體褐化率和提高誘導率的方法，發現在水中弱光培養枝條1～2d，0.3g/L的維生素C溶液漂洗外植體2～3min，在培養基中添加1.0g/L活性炭和0.3g/L維生素C等方法均可以顯著減少外植體的褐化。優化的培養基WPM+6-BA1.0mg/L+2，4-D1.5mg/L+蔗糖15.0g/L+葡萄糖15.0g/L+瓊脂6.5g/L+活性炭1.0g/L+維生素C0.3g/L可提高外植體的愈傷組織誘導率，減少外植體褐化。黃武[86]消除越南油茶外植體褐化的辦法是采用在無生長調節劑的MS基本培養基上預培養7d，以釋放酚類物質，再轉移到添加生長調節劑的培養基上暗培養進行脫分化。

3油茶花藥的組織培養

花藥培養是獲得單倍體植株的有效手段，是植物單倍體育種和倍性操作的重要方法[10]?；ㄋ幣囵B的表面消毒相對容易，采集適宜花粉發育時期的未開放花苞，經低溫預處理后除去表面幾層花瓣，經常規消毒即可。如隆振雄[18]用70%乙醇消毒0.5min，然后用0.1%升汞中滅菌10min，無菌水漂洗3～4次。

3.1適宜的花粉發育時期

隆振雄[18]最早報道對油茶花藥進行培養，他發現在不同花粉發育時期進行取樣，花藥愈傷組織的誘導率存在明顯差異，以四分體期花藥愈傷組織誘導率最高（46.43%），單核晚期次之（21.67%），雙核初期花藥則較少產生愈傷組織（4%）。聞麗[92]取大部分小孢子處于單核時期發育階段的花蕾作為外植體來源，對8個油茶物種的花藥進行了培養，發現盛花初期所采樣品的愈傷組織誘導率高于盛花末期所采樣品的誘導率。丁植磊[93]取小孢子發育處于減數分裂單核靠邊期的材料，對12個油茶物種的花藥進行培養，結果表明在幼壯齡油茶植株背陰面、枝條下部以及始花期采摘花蕾，可獲得較高的油茶愈傷組織誘導率和繼代培養增殖效果。范曉明等[94]以攸縣油茶花藥為外植體進行組織培養，發現花粉四分體時期為油茶花藥愈傷組織誘導的最佳時期，取幼壯齡油茶植株背陰面、枝條下部以及始花期花蕾較為適合。侯辛辛[41]認為處于單核靠邊期的花藥為誘導油茶胚性愈傷組織的合適外植體（花蕾橫縱長度比在0.53左右）。

3.2低溫預處理

對于大多數植物花藥培養而言，低溫預處理有助于提高花藥愈傷組織的誘導率。低溫預處理同樣可提高油茶花藥愈傷組織的誘導率。李建安等[95]的小果油茶花藥培養結果表明，不同低溫（4℃）預處理時長對愈傷組織誘導率有一定的影響，預處理12、6、0d，愈傷組織誘導率分別為2.99%、2.68%和0.83%。說明經過一定時間的低溫預處理可提高小果油茶的花藥愈傷組織誘導率。聞麗[92]于10月上中旬—1月下旬摘取普通油茶、小果油茶、攸縣油茶、浙江紅花油茶、廣寧紅花油茶、騰沖紅花油茶、越南油茶、宛田紅花油茶8個品種的花蕾作為材料進行花藥培養，發現不同物種、低溫（4℃）預處理時長，油茶花藥的愈傷組織誘導效果不同。低溫預處理有利于油茶花藥愈傷組織的誘導，但不同油茶物種最適宜的預處理時間不同，普通油茶為10d左右，攸縣油茶為5～10d，越南油茶為15d左右，浙江紅花油茶為10d左右，廣寧紅花油茶為15d左右，騰沖紅花油茶為10d左右，宛田紅花油茶為15d，小果油茶花藥經過低溫預處理其誘導率未明顯提高，而普通油茶和小果油茶的花藥愈傷組織誘導效率均達到了70%以上[96]。范曉明等[94]發現攸縣油茶花藥低溫預處理時長應在10d以內。

3.3培養基和培養條件

隆振雄[18]研究了N6、MS、B5、MB、Miller和White等基本培養基對油茶花藥培養效果的影響，并在培養基中添加了2，4-D0.5mg/L、NAA0.2mg/L、BA0.2mg/L、KT1.5mg/L，結果表明MB、N6和White較為適宜用于油茶花藥培養，誘導率高，而且所誘導的愈傷組織結構緊密，呈圓形瘤狀物，乳白色，質量較好。以蔗糖為碳源較好。采用器官分化培養基N6+BA2mg/L+IAA0.5mg/L+5BR0.5mg/L+核黃素1mg/L+蔗糖3%進行分化培養時，愈傷組織僅出現綠色芽點，未能再生完整植株。進行花藥愈傷組織誘導時不加人工光照，但培養室內有自然散射光；在進行愈傷組織器官分化時，置于2000lx光照條件下進行，每日補照明10～12h。

李建安等[95]在對小果油茶和廣寧紅花油茶的花藥進行離體培養時，發現廣寧紅花油茶花藥具有較強的愈傷組織誘導能力，而小果油茶花藥褐化嚴重，誘導率較低。在最佳愈傷組織誘導培養基MS+2，4-D0.6mg/L+NAA0.4mg/L和B5+2，4-D1.2mg/L+6-BA0.4mg/L上，廣寧紅花油茶愈傷組織誘導率高達94.67%和91.00%，小果油茶則分別為8.00%和3.34%。MS培養基有利于愈傷組織生長增殖。

聞麗等[97]在進行油茶花藥愈傷組織誘導時，發現在MS、B5、N6、Miller基本培養基中，MS的誘導效果最好。2，4-D0.5mg/L和6-BA0.2mg/L為較佳的生長調節劑組合。3%～4%蔗糖溶液的愈傷組織誘導效果較好。在黑暗條件下培養可以提高油茶花藥愈傷組織的誘導率[85]。

丁植磊等[98]發現在油茶12個物種花藥中，基因型不同，愈傷組織誘導率也不同。以小果油茶、普通油茶、短柱油茶、浙江紅花油茶、茶陵紅花油茶、多齒紅花油茶的愈傷組織誘導率較高（40%～70%），小果油茶、普通油茶的愈傷組織誘導率甚至高達70％。但紅皮糙果油茶、廣西糙果油茶、茶陵紅花油茶、多齒紅花油茶、攸縣油茶的花藥褐化較嚴重。在繼代培養中6-BA和KT均有較好的促進作用，小果油茶、普通油茶、短柱油茶、浙江紅花油茶、茶陵紅花油茶、多齒紅花油茶的愈傷組織均增殖較好。MS培養基適合油茶不同物種愈傷組織的誘導；在MS、N6培養基上能獲得較好的愈傷組織繼代增殖效果（均附加蔗糖35g/L，瓊脂7g/L，pH值5.8）。NAA0.5mg/L+2，4-D0.6mg/L及6-BA0.2mg/L+2，4-D0.5mg/L適合用于不同物種白花油茶與紅花油茶花藥愈傷組織的誘導；MS培養基附加NAA0.5mg/L+ZT0.5mg/L、NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L或6-BA1.5mg/L+NAA1.0mg/L均能獲得較好的愈傷組織增殖效果。添加0.2%～0.8%活性炭對于油茶花藥愈傷組織有抑制增殖作用；在愈傷組織繼代培養和增殖培養中，當添加BA0.4mg/L、NAA1.0mg/L時，活性炭能起到較好的防止褐化和促進生長的作用。暗培養5～10d改善愈傷組織繼代增殖的效果較好。顏色嫩綠純正、質地致密稍硬的愈傷組織的增殖效果最好。繼代時間以（30±5）d為宜，繼代6次后愈傷組織增殖效果較差[93]。

葉思誠等[99]對浙江紅山茶花藥進行離體培養時，發現2，4-D、KT（6-BA）、TDZ之間存在協同作用，通過特定組合能夠更容易誘導愈傷組織產生，提高愈傷組織誘導率。適當增加蔗糖的質量濃度（30～80g/L），提高滲透壓，能夠提高愈傷組織的誘導率。此外，CH、LH、脯氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺的添加也可以促進愈傷組織的誘導、體細胞胚的形成和生長。

范曉明等[94]將接種的攸縣油茶花藥置于（25±3）℃條件下暗培養25d后，再移至自控光照培養架上培養，光照時間12h/d，光照強度2000lx，發現培養基添加物以AgNO3效果最優，誘導率最高為81.02%，繼代增殖培養基配以MS+6-BA2.00mg/L+NAA0.05mg/L為最佳。

侯辛辛[41]的研究結果表明適宜海南油茶花藥胚性愈傷組織誘導的初代培養基為改良MS+2，4-D2.0mg/L+ZT2.0mg/L，胚性愈傷組織在1/2改良MS+6-BA2.0mg/L+ZT1.0mg/L+NAA0.5mg/L培養基中暗培養可有效增殖，并分化出體細胞胚，體細胞胚在1/2改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L培養基上可誘導成熟和萌發形成再生植株，但誘導率較低，培養基配比仍有待進一步優化。其花藥培養條件為暗培養，溫度為（25±2）℃。在暗培養條件下愈傷組織快速增殖，在光照培養下愈傷組織增殖緩慢，且大部分呈現褐色或壞死狀態，僅少部分為胚性愈傷組織狀態。暗培養條件對胚性愈傷組織維持和增殖更有利。

韓春霞等[100]發現普通油茶品種‘華金’‘華碩’‘華鑫’的花藥愈傷組織誘導最佳培養基分別為MS（去NH4+）+NAA0.5mg/L+KT2mg/L、MS（去NH4+）+NAA2mg/L+KT0.5mg/L、MS（去NH4+）+NAA1mg/L+KT2mg/L，花藥愈傷組織誘導率分別達到94.80%、47.78%和75.00%；誘導胚性愈傷組織最佳配方為MS（去NH4+）+3%蔗糖+0.8%瓊脂+2，4-D5μmol/L+KT5μmol/L+谷氨酰胺800mg/L+絲氨酸200mg/L，‘華金’‘華碩’‘華鑫’花藥胚性愈傷組織的誘導率分別是36.00%、56.33%、8.25%。

此外，靳皓然[101]探索了采用油茶未授粉子房和胚珠誘導單倍體，發現誘導子房愈傷組織的最適培養基為MS+蔗糖60g/L+瓊脂7g/L+NAA0.3mg/L+TDZ2.0mg/L，未授粉胚珠誘導愈傷組織的最適培養基為MS+蔗糖40g/L+瓊脂7g/L+NAA1.0mg/L+TDZ2.0mg/L。

3.4褐變問題

油茶花藥組織培養同樣存在褐變問題，因此，有效控制褐變成為油茶花藥培養的關鍵[102]。李建安等[95]發現小果油茶和廣寧紅花油茶的花藥愈傷組織誘導能力差異十分明顯，廣寧紅花油茶花藥愈傷組織容易誘導，而小果油茶誘導困難。小果油茶花藥在接種后第3天出現明顯褐化，10d后所有花藥均呈黑褐色，而廣寧紅花油茶花藥接種后未出現褐化現象，因此花藥褐化是小果油茶花藥愈傷組織發生的限制因素。聞麗[92]的研究結果也表明，不同油茶物種花藥的褐化程度不同。愈傷組織誘導率較高的普通油茶和小果油茶的花藥褐化程度較低，越南油茶花藥褐化程度也相對較低，其次是廣寧紅花油茶、騰沖紅花油茶、宛田紅花油茶、浙江紅花油茶，最高是攸縣油茶。一般褐化情況越嚴重，愈傷組織誘導率越低。預處理時長對組織褐化基本上無影響。油茶花藥褐化愈傷組織的組織化學分析結果表明：無褐化愈傷組織的細胞含淀粉、脂滴相對較多，這些物質在褐化愈傷組織細胞的含量相對較少；褐化愈傷組織細胞中單寧類物質、過氧化物酶含量相對較多，而在無褐化愈傷組織細胞中含量相對較少[103]。

4展望

油茶種苗繁育方法包括實生繁育、扦插繁育、嫁接繁育和組織培養繁育[104-107]。雖然研究結果表明經組織培養產生的再生植株能夠保持原無性系的優良特性[15，71，108]，但由于油茶外植體表面消毒困難、褐化嚴重及生根困難等，還未能實現利用組織培養技術進行工廠化快繁。消毒困難和褐化問題相對容易解決，而生根困難則主要是由于木本植物本身的生理狀態，外植體培養反應性差。在采集外植體時，盡量采集樹體下部的萌條（更接近幼態），或采取措施促進主莖基部萌芽，然后再取主莖基部產生的萌條來培養[68]。

由于油茶組織培養和植株再生比較困難，在利用組織培養技術進行油茶生物育種方面，目前僅見Li等[109]報道普通油茶葉肉原生質體分離和PEG介導的瞬時轉化方法和Lin等[110]報道普通油茶花瓣原生質體分離和PEG介導的瞬時轉化方法，尚未見油茶穩定轉化方法的報道。目前，有關油茶基因組組裝和測序、重要性狀的關鍵基因克隆方面的研究取得不少進展[111-114]。未來油茶基因工程與基因編輯的應用仍將有賴于油茶組織培養和植株再生技術的突破，因此應進一步加強油茶組織培養研究。