組學與基因編輯技術在植物線蟲互作研究中的應用與進展

摘要

植物寄生線蟲系農業生產中一類重要的植物病原生物。基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、RNA干擾（RNAi）和CRISPR/Cas基因編輯等前沿科學技術的應用加深了對線蟲入侵策略及植物防御響應的理解，推動了對植物線蟲互作機制的認識。本文著重介紹了組學和基因編輯技術在揭示植物線蟲基因互作中的應用，以及培育新型抗線蟲作物品種的新途徑。未來在植物寄生線蟲的研究與管理方面應聚焦于多組學數據的綜合利用、基因編輯技術的創新、生物信息學及人工智能在機理解析中的運用，以及精準農業技術在病害管理中的應用，為我國農業生產的持續健康發展提供保障。

關鍵詞

植物寄生線蟲;"RNA干擾（RNAi）;"CRISPR/Cas技術;"抗線蟲作物品種

中圖分類號：

S"43245

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2024197

Applications"and"prospects"of"technologies"such"as"omics"and"gene"editing"in"plantnematode"gene"interactions

CHEN"Luying，"ZHENG"Jingwu，"HAN"Shaojie*

（Institute"of"Biotechnology，"College"of"Agriculture"amp;"Biotechnology，"Zhejiang"University，"Hangzhou"310058，"China）

Abstract

Plantparasitic"nematodes"pose"a"significant"threat"to"our"agriculture."Advances"in"genomics，"transcriptomics，"proteomics，"RNAi，"and"CRISPR/Cas"gene"editing"technology"have"significantly"improved"our"ability"to"control"these"pests，"enhancing"our"understanding"of"their"invasion"tactics"and"the"defense"mechanisms"of"plants."This"review"highlights"the"applications"of"these"scientific"tools"in"revealing"plantnematode"gene"interactions"and"the"new"approaches"to"breeding"resistant"crops."Future"research"will"harness"multiomics，"gene"editing"innovations，"bioinformatics，"AI，"and"precision"agriculture"to"advance"nematode"research"and"management，"supporting"the"continued"growth"of"sustainable"agriculture.

Key"words

plant"parasitic"nematodes;"RNA"interference"（RNAi）;"CRISPR/Cas"technology;"nematoderesistant"crop"varieties

線蟲，這類兩側對稱且具有三胚層假體腔的無脊椎動物，在全球種類繁多，超過一百萬種［1］。其中，被廣泛認定為植物寄生線蟲的種類超過4"100種，這些寄生性線蟲

可感染超過3"000個不同屬的作物，每年造成大量經濟損失，使全球農業面臨巨大的挑戰［2］。目前研究主要集中在對農業生產具有嚴重威脅的孢囊線蟲Heterodera、球孢囊線蟲Globodera、莖線蟲Ditylenchus、粒線蟲Anguina、根結線蟲Meloidogyne和傘滑刃線蟲Bursaphelenchus等類群［3］。對線蟲的防治包括農業防治、物理、化學和生物防治等，但有些方法還可能會對生態環境造成不利影響［45］。在此背景下，分子育種和基因工程技術提供了新的解決方案［6］。

為更好地了解線蟲對植物的危害及其防治策略，科學家們利用了先進的組學技術和基因編輯等方法。其中，組學技術（包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等）在揭示植物與線蟲基因互作機制方面取得了顯著進展。例如，通過基因組測序技術，研究人員能夠深入了解植物寄生線蟲的遺傳特性及其與寄主植物的互作機制。轉錄組學分析則揭示了線蟲在不同發育階段和環境條件下的基因表達模式，為研究線蟲的致病機制和植物的防御反應提供了寶貴數據。蛋白質組學和代謝組學進一步解析了線蟲和寄主植物在相互作用過程中的生理和生化變化。基因編輯技術，如CRISPR/Cas9和RNA干擾（RNAi），在植物抗線蟲育種中的應用日益廣泛。CRISPR/Cas9技術通過精確編輯植物基因組，增強了植物對線蟲侵染的抵抗力，揭示了許多關鍵抗性基因的功能。通過RNAi技術沉默特定基因，顯著減少了線蟲對植物的侵害。這些技術不僅提高了育種效率，還克服了傳統育種周期長、抗性基因應用范圍窄等限制。本文將對組學、基因編輯和RNA干擾技術在植物與線蟲基因互作研究中的應用進行簡要介紹，闡述其在抗線蟲作物育種中的潛力和前景，并探討未來的研究方向和應用前景。

1"植物寄生線蟲組學（omics）研究進展

1.1"植物寄生線蟲基因組學

得益于高通量測序技術的進步，研究人員已完成多種植物寄生線蟲的基因組測序，促進了對這些線蟲遺傳特征和生物學行為的深入理解。其中，秀麗隱桿線蟲Caenorhabditisnbsp;elegans標志性地成為首個完成基因組測序的線蟲［7］;緊隨其后的是南方根結線蟲Meloidogyne"incognita和北方根結線蟲M.hapla，它們是最早被測序的植物寄生線蟲［89］;松材線蟲Bursaphelenchus"xylophilus是第一個應用下一代測序（nextgeneration"sequencing，"NGS）技術完成測序的植物寄生線蟲［10］。到目前為止，已經測序的植物寄生線蟲主要包括孢囊線蟲Heterodera、球孢囊線蟲Globodera、根結線蟲Meloidogyne、穿孔線蟲Radopholus和莖線蟲Ditylenchus等屬的種群［11］。這些線蟲的基因組大小及基因數量的顯著差異揭示了它們各自獨特的生物學特性和適應機制。與自由生活的秀麗隱桿線蟲相比，大多數植物寄生線蟲和動物寄生線蟲的基因組較小，這種縮小主要是由于重復區域減少、內含子和基因拷貝數的減少。基因數量的減少可能反映了線蟲在進化過程中向寄生生活方式轉變的趨勢［11］。通過基因組學分析，揭示了異源多倍體根結線蟲染色體廣泛融合的重要機制［12］。相關研究不僅揭示了線蟲基因組結構及其復雜性，還發現了多個關鍵基因，這些基因在寄主侵染、逃避寄主免疫反應等生命活動中起到了至關重要的作用。

當前基因組學數據揭示了水平基因轉移、串聯重復序列、基因家族擴張或收縮等在植物寄生線蟲適應寄生生活方式中扮演的關鍵角色［13］。許多植物寄生線蟲的細胞壁降解酶基因是通過水平基因轉移從細菌或真菌中獲得的，其與細菌和真菌中的同源基因具有高度相似性，而在非植物寄生線蟲中這類基因幾乎不存在［1416］。此外，串聯重復序列是植物寄生線蟲基因組進化的重要特征之一［17］。Masonbrink等使用RedTandem軟件分析，發現大豆孢囊線蟲H.glycines基因組中存在高達34%的重復序列，這些區域的基因密度甚至超過非重復區［18］。Noon等的研究也發現，大豆孢囊線蟲的效應子基因GLAND18的每個外顯子都包含1個重復結構域，整個序列為串聯重復序列［19］。這種重復序列的存在和變異可能對基因功能和基因組水平的變異具有重要作用［20］。在植物寄生線蟲中，與秀麗隱桿線蟲同源的大多數G蛋白偶聯受體（GPCRs）、核類固醇激素受體以及具有幾丁質降解活性的CAZyme酶基因的數量明顯減少，這一現象與它們寄生于植物體內這一特定生活方式密切相關［89，"21］。

此外，通過基因組學，研究人員深入解析了植物寄生線蟲與寄主互作的關鍵問題。例如，通過基因組學分析，發現孢囊線蟲效應蛋白基因啟動子區域含有DOGbox（dorsal"gland"box），這一發現顯著促進了效應蛋白的篩選和鑒定［18］。此外，組學研究還揭示了首個擬禾本科根結線蟲M.graminicola的抗性基因MG1，這一發現為培育抗性更強的水稻品種提供了重要基因資源［22］。同樣，通過組學分析，發現了潛在的抗大豆孢囊線蟲關鍵基因，包括抗病蛋白（PR）基因，與脅迫相關的轉錄因子基因（如ERFs），一般脅迫響應基因（如谷胱甘肽"S轉移酶和滲透蛋白基因），病害抗性響應蛋白基因，

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonaseinhibiting"protein，

PGIPs）和超敏反應（HR）相關基因的同源基因（如harpin誘導基因1，Hin1）等［23］，這些基因在植物防御線蟲侵染過程中發揮了重要作用。這些研究成果加深了我們對植物寄生線蟲在與寄主互作過程中的適應與進化機制的理解，揭示了塑造其基因特性的過程及關鍵基因的功能。雖然在植物寄生線蟲基因組學領域的研究已取得一系列重要成就，但仍面臨不少挑戰，如基因組內部的高度復雜多樣性的解析以及特定基因具體功能的驗證。未來研究可利用已獲得的基因組數據尋找寄主響應侵染的關鍵基因和植物免疫反應的信號分子，并使其成為開發新型生物防治方法或轉基因作物的重要靶點。

1.2"植物寄生線蟲轉錄組學

隨著轉錄組學技術的不斷進步，研究人員能夠更加全面地解析植物寄生線蟲的侵染機制及其與寄主植物的互作過程。在植物寄生線蟲的研究中，轉錄組學常用于線蟲不同發育階段、不同環境條件下與寄主的互作，以及一些特定互作過程的研究和植物寄生線蟲轉錄組動態的全面分析。相關研究已揭示了許多有關線蟲侵染、遷移和應對寄主防御的至關重要的基因和信號通路［2426］以及調節寄主植物應激反應的效應子［19，"27］。轉錄組學技術已被廣泛應用于植物寄生線蟲效應子的預測和發掘［28］。例如，在大豆孢囊線蟲的效應子研究中，從線蟲食道腺細胞中提取mRNA，隨后構建cDNA文庫以鑒定候選效應子［2930］，通過單克隆測序和生物信息學分析，篩選出N端具有信號肽且缺乏跨膜區域的候選效應子［31］。此外，通過mRNA原位雜交技術評估了這些候選效應子在食道腺的特異性表達情況［32］，進一步研究發現，其中約有50種候選效應子在大豆孢囊線蟲食道腺中特異性表達，且其中大約75%的候選效應子在當時的數據庫中未找到相似序列［29］。Noon等在此基礎上繼續優化并發現了18種新的大豆孢囊線蟲候選效應子［19］。這些進展不僅證明了轉錄組學在揭示植物寄生線蟲的效應子在調控寄主細胞過程中的關鍵作用，也為未來研發針對這些病原物的防控策略提供了重要的分子靶標。

由于植物寄生線蟲特有的生物學特性，其組織空間差異明顯，更適合應用單細胞和空間轉錄組測序技術獲取高分辨率數據。這些技術可以在單細胞水平上解析例如合胞體、巨型細胞等特異性組織內部基因表達的動態變化，并在保持組織結構的基礎上揭示基因表達的空間異質性;也能夠詳細分析線蟲不同發育階段和在寄主植物不同組織中的基因表達模式，從而更精準地揭示植物與線蟲互作的分子機制。這些技術為研究線蟲致病機制和植物防御反應提供了新的視角和更豐富的數據支持，也有助于深入理解寄主和病原物之間復雜的互作網絡，包括由植物寄生線蟲侵染引發的寄主轉錄重編程、細胞死亡以及免疫反應的激活等過程。目前，在植物寄生線蟲的研究中，單細胞和空間轉錄組測序技術的應用還比較少，值得進一步投入和發展。

1.3"植物寄生線蟲蛋白質組學

通過質譜技術，尤其是基于質譜技術的定量蛋白組學，能夠直觀地探索與植物寄生線蟲抗性相關的蛋白質表達差異。例如，采用無標記定量質譜技術對水稻Oryza"sativa"‘日本晴’（‘Nipponbare’）與擬禾本科根結線蟲M.graminicola的互作進行蛋白組學分析，共鑒定出6"072種蛋白，其中513種因線蟲感染而特異或顯著差異表達［33］。質譜鑒定技術被用于鑒定根結線蟲分泌的效應子，并與動物寄生線蟲的效應子進行比較［34］。研究者使用特定抗體免疫沉淀技術，研究了感染大豆孢囊線蟲后，大豆Glycine"max抗性基因GmSHMT08相關的蛋白質復合物，揭示了大豆抗線蟲的關鍵生物過程，如乙醛酸循環和氧化還原平衡等［35］。此外，基于iTRAQ蛋白質組學分析，揭示了抗大豆孢囊線蟲的差異表達蛋白，這些蛋白參與了抗病和適應環境脅迫的多個生物過程［36］。在種子萌發過程中，大豆種子分泌特定蛋白參與對南方根結線蟲的防御，這些發現都是通過質譜技術實現的［37］。

蛋白質組學不僅在基因組注釋、信號通路分析以及RNAi介導的基因靶向驗證中發揮著關鍵作用，還被用于分析植物面對線蟲侵染等不同生物脅迫反應時發生的蛋白質組變化［3839］。這些研究表明，蛋白質組學是連接基因與蛋白質功能互作的重要橋梁，為深入理解植物與寄生線蟲之間的相互作用提供了新的視角和工具。

1.4"其他組學

其他組學研究方向包括代謝組學、表觀基因組學、互作組學等。通過結合代謝組和轉錄組分析，Shi等探討了不同大豆品種在響應大豆孢囊線蟲小種侵染時的差異，發現了37種差異代謝物和20條KEGG代謝途徑，揭示了在抗線蟲過程中可能起關鍵作用的代謝物和相關基因［40］;Zhang等［41］利用轉錄組和代謝組分析2個水稻品種‘ZH11’和‘IR64’在感染擬禾本科根結線蟲后基因表達和代謝物的變化，發現‘ZH11’的類黃酮代謝顯著增強，這為抗病育種研究提供了理論指導。另有研究通過代謝組學分析發現促生根際細菌Bacillus"simplex菌株Sneb545能增強大豆對大豆孢囊線蟲的抵抗力，具有生物防御的潛在優勢［42］;此外，Eloh等［43］通過氣相色譜質譜聯用技術發現，感染南方根結線蟲后2個月，番茄Solanum"lycopersicum葉片中的代謝物β丙氨酸、苯丙氨酸和蜜二糖含量升高，而核糖、甘油、肉豆蔻酸和棕櫚酸含量則下將。番茄莖中核糖、蔗糖、果糖和葡萄糖含量上升，而延胡索酸和甘氨酸含量下降。這些代謝物含量的變化反映了番茄面臨線蟲寄生壓力的分子適應機制，為理解植物如何應對線蟲侵染提供了新見解。這些代謝組學研究揭示了寄主與線蟲相互作用下的生理變化。

表觀基因組學關注DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA修飾（如m6A、m5C、Ψ等）等表觀遺傳信息［44］，在研究植物寄生線蟲感染過程中的基因表達調控機制方面具有重要作用。Qin等［45］通過m6A測序揭示了大豆孢囊線蟲誘導的動態甲基化如何促進大豆的防御反應，促進了對植物應答機制的理解;互作組學則專注于寄主與線蟲間的相互作用，包括蛋白蛋白相互作用，如Xiang等［33］通過全蛋白組學分析揭示了擬禾本科根結線蟲與水稻品種‘日本晴’之間的相互作用，發現了多個與抗病防御相關的關鍵蛋白質和基因表達變化，為水稻抵抗該線蟲的機制提供了新見解。

2"植物基因編輯技術在病原線蟲研究中的應用進展

2.1"CRISPR/Cas9系統在植物與線蟲相互作用中的應用

CRISPR/Cas9基因編輯技術在植物抗線蟲研究中發揮了關鍵作用，揭示了多個重要基因在植物防御中的功能。例如，研究發現，擬禾本科根結線蟲的效應子MgMO237能通過與水稻防御相關蛋白OsBetv1相互作用，抑制水稻的防御反應［46］。利用CRISPR/Cas9技術敲除OsBetv1基因后，突變體水稻對擬禾本科根結線蟲的抗性顯著低于野生型水稻，進一步驗證了OsBetv1在水稻抵御根結線蟲侵染中的關鍵作用。此外，敲除OsBetv1還影響了水稻的生長發育，表明這一基因可能還具備調控植物生長的功能［47］。在番茄中，CRISPR/Cas9被用來研究MYB轉錄因子SlMYB57、SlMYB108和SlMYB112在茉莉酸介導的防御南方根結線蟲中的作用。敲除這些基因的試驗表明，SlMYB57負調控番茄對線蟲的抗性以及根系生長，而SlMYB108和SlMYB112則展現出相反的效果［48］。利用CRISPR/Cas9系統對水稻MG1基因進行功能驗證，結果發現該基因可以增強水稻對擬禾本科根結線蟲的抗性。敲除MG1導致抗性降低，揭示了MG1在植物防御中的重要角色［22］。應用CRISPR/Cas9研究大豆抗、感品種中特定基因的作用，證實了tSNARE家族蛋白在大豆抵御線蟲侵染中的重要性［49］。Huang等［50］用CRISPR/Cas9系統敲除水稻"‘日本晴’中擬禾本科根結線蟲效應子MgMO289的靶基因OsHPP04，結果顯示，OsHPP04的缺失提高了水稻對擬禾本科根結線蟲的抗性，并增強了活性氧、胼胝質以及防御基因的表達，表明OsHPP04在水稻抗線蟲中具有重要作用。敲除番茄‘小湯姆’"（‘MicroTom’）的SlARF8A和SlARF8B基因后，突變體中南方根結線蟲的卵塊和卵量顯著減少，且被取食細胞相比野生型縮小約30%［51］。盡管突變體和野生型植株的葉片表型相似，但突變體主根長度和次生根數量的減少可能對南方根結線蟲的侵染產生了影響。在大豆與南方根結線蟲的相互作用中，南方根結線蟲的RALFlike"1蛋白與大豆GmLMM1結合，抑制宿主免疫反應，從而促進線蟲侵染［52］。此外，利用CRISPR/Cas9技術敲除黃瓜Cucumis"sativus"‘Xintaimici’中蘋果酸合成酶基因對阻礙南方根結線蟲的取食和發育有顯著效果［53］。

盡管目前CRISPR/Cas9已在水稻、番茄、大豆、黃瓜等多種作物中得到應用，但在馬鈴薯、小麥和甘薯等作物的線蟲病害研究中尚未得到廣泛應用［54］，顯示出CRISPR/Cas9在植物線蟲病害防控領域具有巨大的潛力。CRISPR/Cas9技術及其衍生的多種應用，如基因敲入、基因組內的精確編輯（如base"editing）、CRISPRi/a的基因表達調控、表觀遺傳學修改、多重基因編輯、創建基因驅動系統等，為植物線蟲病害防控機制研究提供了前所未有的精準和靈活的工具。這些技術能夠實現從單個基因的精確調控到全基因組層面的大規模編輯，為揭示線蟲與植物相互作用的復雜網絡，發現新的抗病基因，以及調控關鍵的抗性路徑提供可能。通過這些技術實現精準調控植物基因的表達和功能，不僅加深了我們對植物抗線蟲機制的理解，還加快了植物抗病品種的開發和優化，展現了其在植物線蟲病害防控研究中的巨大應用前景和潛力。

2.2"CRISPR/Cas12系統在植物病原線蟲檢測中的應用

相比于CRISPR/Cas9，CRISPR/Cas12具有一些獨特的優勢，越來越受到研究者的青睞。首先，CRISPR/Cas12系統不需要tracrRNA，只需要crRNA即可靶向基因，簡化了系統的結構和使用;其次，Cas12蛋白比Cas9更小，使其更容易包裝和輸送;特別是CRISPR/Cas12在處理AT富集區域的基因編輯時表現出色，因為它不需要GC序列作為原核識別位點（PAM），因此在某些特定基因組區域比Cas9更具優勢。在涉及單鏈DNA切割和診斷應用時，CRISPR/Cas12具有較高的切割效率和精度，使其在某些應用中更具吸引力。CRISPR/Cas12a技術已被開發用于松材線蟲［55］以及甜菜孢囊線蟲H.schachtii［56］快速和可視化檢測。

CRISPR/Cas12技術在植物寄生線蟲與寄主互作研究中的應用尚在起步階段。通過該技術，不僅可以有效規避Cas9的專利壁壘，更能提供更精準的基因功能驗證手段，幫助識別和調控與抗性相關的基因，從而為植物抗病育種和可持續農業提供支持。相信隨著更多相關研究的開展，CRISPR/Cas12系統有望在推動植物寄生線蟲研究和防治方面發揮更大的作用。

2.3"VIGS技術在植物與線蟲互作研究中的應用

病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術作為一種強大的反向遺傳工具，在植物與線蟲互作研究中發揮了重要作用。Kandoth等［57］利用菜豆莢斑駁病毒（bean"pod"mottle"virus，"BPMV）為基礎的VIGS載體，開發了一種適用于大豆根系反向遺傳研究的VIGS技術，并用于分析大豆抗大豆孢囊線蟲相關的基因，為研究根系病原或共生關聯的基因提供了新工具，Liu等［58］通過BPMV介導的VIGS系統在大豆中驗證了主效抗性基因位點Rhg4中SHMT基因對大豆孢囊線蟲的抗性作用表型;Zou等［59］通過煙"草"脆"裂"病"毒（tobacco"rattle"virus，TRV）介導的

VIGS系統在番茄中驗證了

茉莉酸信號通路的負調控因子JAM1通過干擾細胞自噬途徑削弱了番茄對根結線蟲的抗性，

VIGS技術在不同植物與線蟲系統中的成功應用展示了其在功能基因研究中的廣泛適用性和重要性。進一步探索和優化VIGS技術，將有助于我們更深入地了解植物與線蟲相互作用的分子機制，并為開發新的病害防控策略提供科學依據。

3"基因調控技術在植物寄生線蟲抗性中的應用

3.1"線蟲CRISPR/Cas基因編輯的進展、應用及前景

得益于秀麗隱桿線蟲作為模式生物的優點，CRISPR/Cas9系統在秀麗隱桿線蟲中得到了廣泛應用。近年來，這一技術開始應用于人類寄生線蟲Strongyloides"stercoralis的研究中，證明了CRISPR/Cas9技術在寄生性線蟲中的應用可能性［60］。此外，利用Pristionchus"pacificus作為模型，進行密碼子優化和添加內含子等操作，顯著提高了在該線蟲中CRISPR編輯轉化效率，為其他線蟲物種提供了潛在的改進方法［61］。CRISPR/Cas9系統也在非寄生性線蟲Panagrolaimus"sp."PS1159中被首次成功應用進行基因編輯［62］。

對于植物寄生線蟲，盡管已經有研究嘗試應用CRISPR/Cas9技術，但相比于秀麗隱桿線蟲，這些研究還處于起步階段。由于植物寄生線蟲與寄主植物存在復雜的相互作用以及在實驗室條件下難以培養，CRISPR/Cas9技術的應用面臨更多挑戰。植物寄生線蟲之所以難以進行CRISPR/Cas9基因編輯的一部分原因可能包括：1）傳遞系統的局限性。Park等［63］利用顯微注射對松材線蟲進行RNAi處理，取得了一定效果，但該技術未能在其他植物寄生線蟲中得到應用;Kranse等［64］采用了脂質體轉染法，在甜菜孢囊線蟲和北方根結線蟲中成功進行了外源mRNA的瞬時表達。值得注意的是，目前還沒有關于利用顯微注射技術將CRISPR/Cas9組件成功導入植物寄生線蟲體內并進行成功編輯的研究報道。2）培養條件的限制。植物寄生線蟲通常需要特定的寄主植物進行培養，這使得在實驗室環境下進行基因編輯試驗更加復雜。3）生命歷程和生態位的特殊性。植物寄生線蟲的生命周期和生態位與自由生活線蟲大不相同，這可能影響CRISPR/Cas9編輯效率和策略的選擇。盡管存在挑戰，植物寄生線蟲的CRISPR/Cas9研究仍具有巨大潛力，特別是在揭示寄主寄生線蟲相互作用、鑒定新的抗性基因，以及開發新型抗線蟲作物方面。隨著技術的進步和對植物寄生線蟲生物學特性更深入的理解，未來可能會有更多植物寄生線蟲的成功基因編輯案例。

3.2"植物寄生線蟲RNAi技術的進展、應用及前景

相較于CRISPR/Cas技術，RNA干擾（RNAi）技術在植物寄生線蟲研究領域中的應用更為成熟和廣泛［65］。通過向線蟲或其宿主植物中引入特定基因的雙鏈RNA（dsRNAs），可以特異性地抑制線蟲的關鍵基因，進而抑制其生長、發育或繁殖，以減少其對植物的傷害［66］。這種方法已被證明是控制病原線蟲的有效策略，特別是在不能使用化學農藥或其他生物控制手段（如線蟲捕食性真菌、寄生性細菌）的情況下。隨著對線蟲基因組的深入研究和RNAi遞送系統的不斷完善，將會不斷拓展RNAi在植物保護領域的應用。未來，結合傳統育種和基因編輯技術開發能表達特定dsRNA的轉基因作物，有望成為一種長期有效的植物病原線蟲管理方法。

3.2.1"利用RNAi技術直接改造植物寄生線蟲

RNAi技術在直接改造植物寄生線蟲方面展現了巨大的潛力，但其應用仍面臨諸多挑戰。在植物寄生線蟲的RNAi技術應用中，將特定基因的dsRNAs直接引入線蟲的方法包括顯微注射、用表達dsRNA的大腸桿菌進行喂食以及將線蟲浸泡于dsRNA溶液中［67］。然而，對于植物寄生線蟲而言，采用這些方法存在一定難度。目前，通過顯微注射法向植物寄生線蟲引入dsRNA尚無成功案例，且由于植物寄生線蟲的專性寄生習性，體外飼喂方法受到限制［6465］。定居型植物寄生線蟲僅在侵染和卵期階段能在寄主體外生存，通常采用浸泡dsRNA溶液的方式實現dsRNAs的引入［65］。Urwin等［68］首次將線蟲浸泡在含有神經遞質激動劑章魚胺（octopamine）的dsRNA溶液中，成功在馬鈴薯白線蟲Globodera"pallida和大豆孢囊線蟲侵染期沉默了目標基因。通過在浸泡溶液中添加異硫氰酸熒光素（FITC）或有熒光標記的dsRNA，追蹤線蟲體內dsRNA的吸收情況，結果表明，目標基因表達下調與寄生效率降低、繁殖能力減弱、行為受抑、寄主定位能力下降等表型變化相關聯。目前，該技術已在多種線蟲中得到應用，如孢囊線蟲、根結線蟲、球孢囊線蟲、穿孔線蟲、滑刃線蟲Aphelenchoides、根腐線蟲Pratylenchus及傘滑刃線蟲Bursa"phelenchus等屬的種群［65，6970］。

3.2.2"寄主誘導的基因沉默

采用寄主誘導的基因沉默（hostinduced"gene"silencing，"HIGS）技術來對抗線蟲的研究已取得進展，這對于開發新型轉基因抗線蟲作物具有重要意義，原理如圖1所示。Boutla等［71］使用siRNA喂食轉GFP基因的秀麗隱桿線蟲，使線蟲中GFP的轉錄水平下降，證明了植物與線蟲之間存在相似的RNAi機制，并首次提出了在植物中表達針對線蟲基因的dsRNA以抵抗線蟲的概念。dsRNA和siRNA能從植物轉移至病原，例如植物寄生線蟲［66，7273］。在擬南芥中表達根結線蟲基因16D10的dsRNA，發現這些dsRNA在植物體內被加工成siRNA，導致植物上根結數和產生的卵數顯著減少，并對包括多種根結線蟲在內的病原物表現出抗性［74］。通過在大豆中引入靶向秀麗隱桿線蟲的關鍵胚胎致死基因，成功地抑制了大豆孢囊線蟲雌蟲的發育［75］。在擬南芥和馬鈴薯中表達根結線蟲基因的dsRNA，培育出抗性增強的轉基因植株。用這些植株喂養線蟲后線蟲體內目標基因表達量下調，其后代類似基因的表達量也降低，揭示了寄主誘導基因沉默可能具有系統性和遺傳性的特征［76］。此外，通過寄主誘導沉默大豆孢囊線蟲的幾丁質合成酶基因SCNCHS，可以廣泛且持久地增強大豆對不同大豆孢囊線蟲群體以及尖鐮孢Fusarium"oxysporum引起的大豆枯萎病的抗性，為控制大豆孢囊線蟲和枯萎病提供了一種潛在方法［77］。

3.2.3"病毒介導的線蟲基因沉默

病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術是探索植物基因功能的常見方法，但其在動物基因功能研究中的應用相對較少。Guo等［78］以改造后的獸棚病毒（flock"house"virus，"FHV）為載體，對攜帶GFP基因的轉基因秀麗隱桿線蟲中的GFP基因進行了沉默，發現病毒產生的siRNA（viral"siRNA，vsiRNA）可以調控秀麗隱桿線蟲中GFP基因的表達，這表明，VIGS技術不僅能沉默特定基因的表達還可能對后代產生遺傳性影響。VIGS在線蟲基因沉默中的成功應用為直接沉默植物寄生線蟲相關基因提供了借鑒，在植物寄生性線蟲的研究中，病毒基因沉默技術已成為解析線蟲與宿主植物互作關系的重要工具。目前使用的VIGS技術主要依賴煙草脆裂病毒系統，并集中在茄科植物和根結線蟲等特定宿主寄生體系統上［7982］。對于其他類型的線蟲，如孢囊線蟲和其他非茄科植物宿主，目前關于使用VIGS的報道相對較少。孢囊線蟲由于其與宿主植物的相互作用方式以及其生物學特性的差異，使用TRV或其他病毒作為VIGS載體可能會遇到特定的挑戰。除了TRV之外，已鑒定出多種能夠侵染植物寄生線蟲的病毒，例如侵染大豆孢囊線蟲的SCN"nyavirus"（ScNV）、SCN"rhabodovirus"（ScRV）、SCN"phlebovirus"（ScPV）、SCN"tenuivirus"（ScTV）、soybean"cyst"nematode"virus"5"（SbCNV5）、SCN"nyamilike"virus"（NLV）和SCN"bunyalike"virus"（BLV）［8385］，以及侵染馬鈴薯孢囊線蟲的PCN"picornalike"virus"（PLV）［85］。研究如何改造這些病毒以有效地實施VIGS，將是未來重要的研究方向。

4"展望

植物寄生線蟲與寄主的互作研究正處于一個前所未有的變革期，借助于RNAi技術和CRISPR編輯技術的迅速發展，正在逐步揭開這一群體復雜生物學性質的神秘面紗。隨著這些技術的持續進步和優化，預計未來將出現以下幾個研究和應用方向，這些將極大地推動植物寄生線蟲領域的科學研究和應用實踐。1）"多組學結合研究：隨著基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等組學技術的不斷發展，結合CRISPR編輯和RNAi技術，將能夠更全面深入地解析線蟲與寄主植物互作的分子機制。這種多維度的研究方法將揭示線蟲侵染植物的關鍵分子事件和調控網絡，為開發新型的抗線蟲策略提供科學依據。2）基因編輯技術的創新與應用：CRISPR技術的快速演進將進一步擴展其在植物寄生線蟲研究中的應用。除了CRISPR/Cas9和Cas12系統外，新的CRISPR系統如Cas13（針對RNA的編輯）和精準基因修復技術（如基因組編輯的精準定點插入）的開發，將為植物寄生線蟲的功能基因組學研究和抗性基因的精準育種提供更多工具。3）生物信息學與人工智能的結合：隨著生物信息學和人工智能技術的發展，未來寄生線蟲研究將越來越依賴于這些技術來處理和分析大量的組學數據。機器學習和深度學習等算法將在預測線蟲的功能基因、抗性基因標記以及寄主與病原物之間相互作用的復雜網絡中發揮關鍵作用。4）"非編碼RNA與表觀遺傳學的作用：非編碼RNA和表觀遺傳修飾在植物響應植物寄生線蟲侵染中扮演著重要角色。未來的研究需加強對這些因素如何調控植物抗病性的探討，以及它們如何被植物和植物寄生線蟲所利用來調控寄主病原物之間相互作用的研究。這一領域的進展將為開發新的抗線蟲策略提供新思路。5）"精準農業在病原線蟲管理中的應用：精準農業技術，包括高通量表型平臺、遙感技術和地理信息系統等，將使我們能夠更精確地監測植物寄生線蟲的分布和侵染情況。結合基因編輯和RNAi技術，可以實現針對特定病原線蟲種群的定制化防控策略，提高農業生產效率和可持續性。總之，通過這些先進技術的應用和研究，未來植物寄生線蟲的控制將更加精準、高效和環境友好。這不僅將促進植物病害管理領域的科學進步，也將為全球農業生產和食品安全提供堅實的支撐。

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