南方根結(jié)線蟲生防真菌的篩選鑒定及防效研究

摘要

根結(jié)線蟲Meloidogyne"spp.是常見的嚴重危害植物的寄生線蟲，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來重大損失。本研究篩選到一株對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲具有較強毒殺能力并能有效抑制卵孵化的真菌Snef2766。通過形態(tài)學和ITS序列分析，鑒定其為因蘇特曲霉Aspergillus"insuetus。盆栽條件下，菌株Snef2766灌根能顯著減少番茄植株根結(jié)數(shù)和卵囊數(shù)，減退率分別為6422%和5870%，并且促進番茄生長。溫室試驗結(jié)果表明，菌株Snef2766包衣和灌根處理均能有效防治番茄根結(jié)線蟲病，防效分別為6069%和6355%，同時促進番茄生長。綜上，因蘇特曲霉Snef2766具有顯著的促生和防治南方根結(jié)線蟲病效果。本文首次報道因蘇特曲霉能有效防治南方根結(jié)線蟲病，為根結(jié)線蟲病的生物防治提供新的生防微生物資源。

關鍵詞

南方根結(jié)線蟲;"因蘇特曲霉;"番茄;"鑒定;"防效

中圖分類號：

S"43245;"S"4761

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2024244

Screening，"identification"and"efficacy"of"biocontrol"fungi"against"southern"rootknot"nematode

WANG"Lifei1，"WU"Xiaobin1，"ZHU"Xiaofeng1，"WANG"Yuanyuan2，"ZHAO"Di3，"YANG"Ning1，"LIU"Xiaoyu4，DUAN"Yuxi1，"FAN"Haiyan1*，"CHEN"Lijie1*

（1."College"of"Plant"Protection，"Shenyang"Agricultural"University，"Shenyang"110866，"China;"2."College"of"

Bioscience"and"Biotechnology，"Shenyang"Agricultural"University，"Shenyang"110866，"China;"3."Analytical"

and"Testing"Center，"Shenyang"Agricultural"University，"Shenyang"110866，"China;"4."College"of"Science，"

Shenyang"Agricultural"University，"Shenyang"110866，"China）

Abstract

The"rootknot"nematode"（Meloidogyne"spp.）"is"one"of"the"most"common"and"harmful"plant"parasitic"nematodes，"causing"significant"losses"to"agricultural"production."The"fungus"strain"Snef2766"was"screened"in"this"study，"which"showed"high"nematocidal"activity"against"Meloidogyne"incognita"secondstage"juveniles"（J2）"and"could"effectively"inhibit"egg"hatching."Based"upon"morphological"characteristics"and"ITS"sequence"analysis，"strain"Snef2766"was"identified"as"Aspergillus"insuetus."Pot"experiments"demonstrated"that"root"irrigation"with"fermentation"filtrates"of"the"strain"Snef2766"significantly"reduced"root"knots"of"tomato"plant"and"egg"masses，"with"the"reduction"rates"of"6422%"and"5870%，"respectively，"and"promoted"the"growth"of"tomato"plants."Greenhouse"experiment"showed"that"strain"Snef2766"could"effectively"control"rootknot"nematode"disease"by"seedcoating"and"root"irrigation"treatment，"with"the"control"efficacy"of"6069%"and"6355%，"respectively，"and"promote"the"growth"of"tomato."Therefore，"A.insuetus"Snef2766"had"a"significant"effect"on"promoting"growth"and"controlling"southern"rootknot"nematode"disease."This"is"the"first"report"of"A.insuetus"as"a"biocontrol"agent"against"M.incognita，"which"provide"a"new"microbial"resource"for"the"biological"control"of"rootknot"nematode"disease.

Key"words

Meloidogyne"incognita;"Aspergillus"insuetus;"tomato;"identification;"biocontrol"effect

植物寄生線蟲因其難發(fā)現(xiàn)、難防控、侵染能力強、寄主范圍廣泛和傳播迅速等特點，已成為嚴重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要病原物之一，在全球引起的農(nóng)業(yè)損失每年約1"570"億美元［13］。根結(jié)線蟲Meloidogyne"spp.是常見的危害農(nóng)作物最嚴重的植物寄生線蟲。其中，引發(fā)蔬菜和園林苗木根結(jié)線蟲病的主要以南方根結(jié)線蟲為主。南方根結(jié)線蟲發(fā)生嚴重時會引起植株根部腐爛，導致整株植物死亡，從而造成巨大的經(jīng)濟損失［45］。

目前，使用化學藥劑是防治南方根結(jié)線蟲病的主要方法［6］。但化學藥劑的使用存在對環(huán)境的不可逆污染，線蟲易產(chǎn)生抗藥性以及威脅人畜安全等問題。隨著人們生活水平的不斷提高，對食品安全和環(huán)境污染問題越來越關注，尋找安全有效的防治手段迫在眉睫。生物防治因安全無毒、不易產(chǎn)生抗性、對人畜安全、無污染等特點，是防治根結(jié)線蟲病的有效措施。生防真菌是生物防治的主要微生物資源之一，研究較多的有曲霉屬Aspergillus、木霉屬Trichoderma、節(jié)叢孢屬Arthrobotrys、擬青霉屬Paecilomyces等。其中，曲霉屬真菌在防治南方根結(jié)線蟲中被廣泛應用。例如，黑曲霉A.niger"Snf009能夠產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物降低根結(jié)線蟲的種群數(shù)量，提高過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等的活性，提高植株抗根結(jié)線蟲侵染的能力，有效防治南方根結(jié)線蟲病［7］。聚多曲霉A.sydowii"Snef210菌株發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲J2和卵有強毒殺能力，盆栽條件下顯著降低根結(jié)數(shù)，有效防治番茄根結(jié)線蟲病［8］。日本曲霉A.japonicus"ZW1發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲J2具有毒殺作用［9］。但是，安全、穩(wěn)定、高效防治南方根結(jié)線蟲病的生防微生物資源仍然較少。因此，本研究以南方根結(jié)線蟲為靶標，篩選對南方根結(jié)線蟲J2有較強觸殺活性的真菌并對其進行鑒定，評價其對南方根結(jié)線蟲卵孵化的抑制效果以及盆栽和田間條件下防治南方根結(jié)線蟲病的能力和對番茄的促生長作用。旨在為南方根結(jié)線蟲病的防治提供新的潛在生防菌株。

1"材料與方法

1.1"供試材料

1.1.1"供試土壤樣品"

從遼寧省沈陽市采集不同寄主植物（花生、番茄、黃瓜等）的土壤樣品7份。

1.1.2"供試植物

番茄品種‘L402’，為南方根結(jié)線蟲的感病品種，購于遼寧園藝種苗有限公司。

1.1.3"供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PD）參照文獻［10］配制，121℃高壓濕熱滅菌30"min后用于試驗。

1.2"土壤真菌菌株的分離純化

通過平板稀釋法對采集土樣中的真菌進行分離［11］。平板在28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5～7"d，挑取顏色、形態(tài)不同的菌落進行純化，純化后的菌株使用15%的甘油保存在沈陽農(nóng)業(yè)大學北方線蟲研究所-80℃冷庫中。

1.3"土壤真菌菌株發(fā)酵液和發(fā)酵濾液的制備

將菌株在PDA平板上活化，28℃條件下倒置培養(yǎng)3～5"d。用打孔器（d=9"mm）在菌落邊緣打取菌餅接種于裝有100"mL"PD的錐形瓶中，28℃條件下150"r/min振蕩培養(yǎng)5～7"d，獲得菌株發(fā)酵液。將真菌發(fā)酵液加入抽濾瓶中，取上清液通過022"μm無菌濾膜獲得真菌發(fā)酵濾液，備用［12］。

1.4"南方根結(jié)線蟲J2和卵懸液的制備

南方根結(jié)線蟲M.incognita采自遼寧省沈陽市遼中區(qū)吳家崗村（122°47′E，41°22′N）溫室中南方根結(jié)線蟲病嚴重田塊的番茄根系，在沈陽農(nóng)業(yè)大學北方線蟲研究所溫室大棚的番茄植株上繁殖培養(yǎng)。選取南方根結(jié)線蟲病發(fā)生嚴重的番茄根系，沖洗干凈后，挑取單一飽滿的卵囊，放入小皿中用05%"NaClO消毒1"min，再用無菌水沖洗3～5次，移入裝有無菌水的孵化池中，置于25℃培養(yǎng)，收集南方根結(jié)線蟲J2，用無菌水稀釋到所需濃度，用于觸殺活性測定和溫室盆栽條件下的防效測定試驗［13］。一部分卵囊戳破獲得卵懸液，用無菌水稀釋到所需濃度，用于卵孵化抑制試驗。

1.5"防治南方根結(jié)線蟲的生防真菌的篩選

取待測定菌株的發(fā)酵濾液400"μL分別加入到貝氏小皿中，再向皿中加入100"μL（約含50條J2）的線蟲懸浮液，以PD培養(yǎng)基處理為空白對照，每個處理重復3次。貝氏小皿放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24"h和48"h使用體視顯微鏡（SMZ161BLED，沈陽寧遠技術(shù)服務有限公司）觀察并記錄線蟲的死亡數(shù)和總數(shù)［14］。線蟲呈直線狀僵直，撥動無反應，即視為死亡。計算線蟲死亡率和校正死亡率。

死亡率=死亡線蟲總數(shù)/線蟲總數(shù)×100%;

校正死亡率=（處理組線蟲死亡率-對照組線蟲死亡率）/（1-對照組線蟲死亡率）×100%。

復篩試驗方法同初篩。選擇48"h時校正死亡率大于90%的真菌菌株作為候選生防菌，用于后續(xù)試驗。

1.6"菌株Snef2766的鑒定

1.6.1"菌株Snef2766的形態(tài)學鑒定

用打孔器（d=9"mm）在菌株Snef2766菌落邊緣打菌餅，置于PDA培養(yǎng)基平板正中央位置，平板在28℃培養(yǎng)箱中避光倒置培養(yǎng)7"d。觀察菌落的形狀、顏色、菌絲疏密度、生長速度、有無色素的產(chǎn)生、辨別是否有氣味等，同時使用光學顯微鏡觀察菌株的分生孢子梗和分生孢子形態(tài)。參照魏景超的《真菌鑒定手冊》和張中義的《中國真菌志》進行鑒定［1516］。

1.6.2"菌株Snef2766的分子鑒定

參考文獻中的方法提取真菌DNA［1719］。

采用真菌通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGC3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）擴增菌株的ITS序列［20］。25"μL"PCR反應體系：上游和下游引物各1"μL，DNA"模板2"μL，2×Taq"Master"Mix（Dye"Plus）"125"μL、ddH2O"85"μL。擴增程序為：94℃預變性5"min;94℃變性1nbsp;min，56℃復性1"min，72℃延伸2"min，循環(huán)30次;72℃延伸5"min，4℃保存。PCR產(chǎn)物通過12%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增后的產(chǎn)物提交給生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結(jié)果經(jīng)NCBI中BLAST數(shù)據(jù)庫比對分析，并使用MEGA"70軟件以neighborjoining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。同時，將菌株的ITS序列提交至GenBank，獲得基因登錄號。

1.7"菌株Snef2766發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲卵孵化的抑制能力測定

取菌株Snef2766的發(fā)酵濾液400"μL，加入到貝氏小皿中，再向每孔中加入100"μL南方根結(jié)線蟲卵懸液（約含300粒卵），以PD處理為空白對照，每處理重復3次。將貝氏小皿放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24"h和48"h后分別使用體視顯微鏡觀察并記錄孵化出的線蟲數(shù)，計算卵孵化率和相對抑制率［14］。

卵孵化率=孵化線蟲數(shù)/供試卵數(shù)×100%;

相對抑制率=（對照孵化線蟲數(shù)-處理孵化線蟲數(shù)）/對照孵化線蟲數(shù)×100%。

1.8"菌株Snef2766發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲病的盆栽防效試驗

選擇飽滿的番茄種子，用1%的NaClO溶液進行表面消毒3"min，再用無菌水反復沖洗3～5次、晾干，播種于裝有營養(yǎng)土（沙子∶育苗基質(zhì)=1∶1）的育苗盤中，播種前營養(yǎng)土經(jīng)160℃滅菌180"min。待番茄幼苗生長至4葉期后，移栽入裝有滅菌營養(yǎng)土（土壤∶沙子∶育苗基質(zhì)=1∶1∶1）的花盆（95"cm×115"cm）中，每盆移栽1株番茄苗。移入花盆1周后，每株苗灌根10"mL菌株Snef2766發(fā)酵液（濃度為1×108"cfu/mL）并接種南方根結(jié)線蟲J2懸浮液2"mL"（約1"000條J2），分別以無菌水和PD培養(yǎng)基灌根處理且接種南方根結(jié)線蟲J2為對照，每處理重復5次。將花盆置于25℃、光周期L∥D=16"h∥8"h"的溫室中培養(yǎng)，花盆完全隨機擺放。培養(yǎng)30"d后，測量番茄植株的株高、根長、植株莖葉和根的鮮重和干重等生理指標，調(diào)查根結(jié)數(shù)量和卵囊數(shù)量，計算根結(jié)線蟲病的根結(jié)減退率和卵囊下降率［8］。

根結(jié)減退率=（對照根結(jié)數(shù)-處理根結(jié)數(shù)）/對照根結(jié)數(shù)×100%;

卵囊下降率=（對照卵囊數(shù)-處理卵囊數(shù)）/對照卵囊數(shù)×100%。

1.9"菌株Snef2766對根結(jié)線蟲病的溫室防效試驗

溫室試驗區(qū)位于遼寧省錦州市太和區(qū)中環(huán)北路前山（121°03′E，41°07′N）。該溫室大棚的生產(chǎn)模式為黃瓜和番茄輪作，根結(jié)線蟲病發(fā)生嚴重。番茄起壟栽培：壟長65"m，壟間距16"m，植株間距026"m，每壟種植約25株番茄苗。采用Bridge等［21］的分級標準統(tǒng)計病情：0級，無根結(jié);1級，須根上有一些小根結(jié);2級，須根上有一些明顯的小根結(jié)、主根上無根結(jié);3級，須根上有一些明顯的大根結(jié)、主根上無根結(jié);4級，須根上絕大部分是大根結(jié)、主根上無根結(jié);5級，一半根系有根結(jié)、主根上也有根結(jié);6級，主根上出現(xiàn)大量根結(jié);7級，絕大部分的主根上有根結(jié);8級，全部主根上有根結(jié);9級，全部根上有根結(jié);10級，主根上根結(jié)嚴重、無須根。

1.9.1"Snef2766發(fā)酵液灌根處理

種子處理方法同18，待番茄幼苗生長至4葉期后，移栽至溫室大棚。移苗當天，用菌株Snef2766發(fā)酵液（濃度為1×108"cfu/mL）

對番茄幼苗進行灌根處理。以無菌水、PD培養(yǎng)基和18%阿維菌素乳油稀釋1"000倍液灌根為對照，每株苗灌根200"mL，每處理3個重復，每重復5株苗，各處理隨機分布。移栽后30"d，將番茄苗整株挖出，保留完整根系，測量生理指標，調(diào)查根結(jié)指數(shù)并計算防效［22］。

根結(jié)指數(shù)=Σ（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值）×100;

防效=（對照根結(jié)指數(shù)-處理根結(jié)指數(shù)）/對照根結(jié)指數(shù)×100%。

1.9.2"Snef2766發(fā)酵液包衣種子處理

番茄種子用1%"NaClO溶液表面消毒3"min，再用無菌水反復沖洗3～5次、晾干，于濃度為1×108"cfu/mL

的Snef2766發(fā)酵液中浸種5"min，取出晾干。分別以無菌水、PD培養(yǎng)基處理為對照，包衣體積比為1∶40。將包衣的番茄種子播種于裝有

滅菌

營養(yǎng)土（沙子∶育苗基質(zhì)=1∶1）的育苗盤中，待番茄幼苗生長至4葉期時移栽至溫室大棚［23］。移栽時，每處理3個重復，每重復5株苗。各處理隨機分布。移栽后30"d，將番茄苗整株挖出，保留完整根系，測量生理指標，調(diào)查根結(jié)指數(shù)并計算防效。

1.10"數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Microsoft"Office"Excel"2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用SPSS"statistics"220軟件進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，試驗采用Duncan氏新復極差法（Plt;005）進行差異顯著性分析。

2"結(jié)果與分析

2.1"南方根結(jié)線蟲生防真菌的分離和篩選

從采集的土壤樣品中共獲得44株真菌（表1），所有菌株均保存在沈陽農(nóng)業(yè)大學北方線蟲研究所－80℃冰箱中。

以南方根結(jié)線蟲J2為靶標，篩選有高毒殺能力的菌株。真菌菌株的發(fā)酵濾液處理48"h后，校正死亡率大于90%的菌株7株，50%～90%的菌株25株，小于50%的菌株12株。選取處理48"h校正死亡率大于90%的7株菌株進行復篩。結(jié)果顯示，7株真菌菌株發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲"J2"均有高毒殺活性，其致死效果隨著處理時間的增加而增強。處理48"h后，菌株的校正死亡率均大于90%，其中，菌株Snef2766處理24"h和48"h對J2的毒殺活性最高，校正死亡率分別為9164%和9803%（表2）。選取該菌株進行后續(xù)研究。

2.2"菌株Snef2766的鑒定

在PDA培養(yǎng)基上，28℃完全避光條件下培養(yǎng)，菌株Snef2766生長初期菌落為淡棕色，菌絲短絨狀、密實;培養(yǎng)3～5"d后菌落顏色開始轉(zhuǎn)深，出現(xiàn)深淺交接線，有深淺不一的溝壑形成，呈現(xiàn)輻射狀生長;培養(yǎng)7"d時，菌落直徑450"cm左右;生長后期菌落顏色全部轉(zhuǎn)深，背面黃色，會產(chǎn)生黃色素，顏色擴散至基質(zhì)中（圖1a，b）。菌株Snef2766生長較為緩慢，在光學顯微鏡下，菌絲末端形成球狀膨脹，分生孢子梗呈現(xiàn)“菊花狀”，孢子梗長短不一的生長在孢子頭上，分生孢子球形或近球形（圖1c）。

基于ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株Snef2766與因蘇特曲霉Aspergillus"insuetus（登錄號FJ8786281、MN6508391）具有100%的相似性（圖2）。同時，菌株Snef2766的ITS基因序列已提交GenBank"數(shù)據(jù)庫，序列號為PP549965。

結(jié)合菌株形態(tài)特征（圖1）和分子生物學鑒定（圖2），將菌株Snef2766鑒定為因蘇特曲霉A.insuetus。

2.3"因蘇特曲霉Snef2766發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲卵孵化的抑制效果

因蘇特曲霉Snef2766發(fā)酵濾液能有效抑制南方根結(jié)線蟲卵孵化，且隨著處理時間的延長抑制效

果增強。處理24"h和48"h時，對南方根結(jié)線蟲的卵孵化抑制率分別達到6766%和7931%。

2.4"因蘇特曲霉Snef2766發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲病的盆栽防治效果

在接種南方根結(jié)線蟲J2并經(jīng)過灌根處理30"d后，PD液體培養(yǎng)基處理的發(fā)病情況與無菌水處理無顯著差異。與PD對照相比，經(jīng)因蘇特曲霉Snef2766菌株發(fā)酵液灌根處理后，番茄植株根部的根結(jié)數(shù)量和卵囊數(shù)量均顯著下降，根結(jié)減退率和卵囊減退率分別為6422%和5870%（圖3）。

盆栽條件下，對不同處理后番茄植株的生理指標進行了測定。移栽30"d后，PD處理的植株生長情況與無菌水處理無顯著差異（圖4、表3）。與PD對照相比，經(jīng)過菌株Snef2766發(fā)酵液處理后的番茄植株株高、根長、株鮮重、根鮮重、株干重和根干重均顯著增加，分別增加1853%、5526%、5059%、5278%、3721%和8462%（圖4、表3）。盆栽試驗結(jié)果表明，菌株Snef2766發(fā)酵液灌根處理可以有效地抑制番茄根結(jié)線蟲病的發(fā)生，同時還可以促進番茄植株生長。

2.5"因蘇特曲霉Snef2766發(fā)酵液對根結(jié)線蟲病的溫室防治效果

因蘇特曲霉Snef2766發(fā)酵液在大棚的表現(xiàn)與盆栽試驗結(jié)果基本一致。試驗結(jié)果表明，移栽后30"d，PD液體培養(yǎng)基處理的番茄發(fā)病情況、根長、根鮮重和根干重與無菌水處理無顯著差異，株高顯著低于無菌水處理。移栽30"d后，因蘇特曲霉Snef2766發(fā)酵液和阿維菌素灌根處理后的根結(jié)指數(shù)分別為2883和3777，顯著低于無菌水和PD處理的根結(jié)指數(shù)（7911和7443）。因蘇特曲霉Snef2766灌根處理的防效為6355%，顯著高于阿維菌素處理的防效（5226%）。而且，因蘇特曲霉Snef2766灌根處理后與無菌水和PD處理相比顯著增加了番茄的株高和根鮮重。采用因蘇特曲霉Snef2766發(fā)酵液對番茄種子包衣處理的試驗結(jié)果表明，溫室大棚條件下，移栽30"d后，因蘇特曲霉Snef2766包衣處理后的番茄植株根結(jié)指數(shù)顯著下降，防效為6069%，同時番茄植株的株高、根鮮重和根干重均有顯著提高（圖5、表4）。

3"結(jié)論與討論

利用生防微生物防治南方根結(jié)線蟲病是可持續(xù)治理的理想途徑之一。目前，能有效防治根結(jié)線蟲病的生防微生物資源仍然有限，挖掘穩(wěn)定、高效的南方根結(jié)線蟲生防菌迫在眉睫。本研究從土壤中分離、篩選獲得1株對南方根結(jié)線蟲J2具有較強觸殺能力的真菌菌株Snef2766，通過形態(tài)學鑒定和ITS基因序列分析鑒定其為因蘇特曲霉A.insuetus。曲霉作為一種重要的生防微生物資源，已廣泛應用于植物線蟲病害生物防治研究中。水稻潛根線蟲Hirschmanniella"spp.經(jīng)日本曲霉A.japonicus和黑曲霉處理72"h后的死亡率分別為937%和967%［24］。百歲蘭曲霉A.welwitschiae對水稻根結(jié)線蟲有良好的毒殺作用和抑制作用，溫室盆栽條件下可使侵染線蟲數(shù)量減少405%，且延緩線蟲發(fā)育［25］。土曲霉A.terreus對南方根結(jié)線蟲J2具有高毒性，南方根結(jié)線蟲死亡率約為68%［26］。泡盛曲霉A.awamori"BS05在盆栽條件下對南方根結(jié)線蟲病的防治效果為449%［27］。因蘇特曲霉Snef73對南方根結(jié)線蟲J2有觸殺作用，但其抑制卵孵化效果、溫室及田間條件下的防效未知［28］。本研究發(fā)現(xiàn)因蘇特曲霉Snef2766對南方根結(jié)線蟲J2有較強的觸殺作用、并可有效抑制卵孵化，在溫室盆栽和溫室大棚條件下，對根結(jié)線蟲病的防效高于60%，而且顯著促進植株生長。本研究首次報道因蘇特曲霉能有效防治南方根結(jié)線蟲病。

曲霉可產(chǎn)生具有殺線蟲活性的酶、抗生素、揮發(fā)性物質(zhì)和毒素等代謝產(chǎn)物，通過毒殺作用、抑制卵孵化等作用來防治根結(jié)線蟲病害［2932］。黑曲霉DE09002產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和胞外蛋白酶在抗線蟲侵染過程中起重要作用［29］。亮白曲霉A.candidus中分離得到的化合物檸檬酸使南方根結(jié)線蟲卵的孵化減少94%以上［30］。煙曲霉A.fumigatus"1T2發(fā)酵液中分離鑒定出一種結(jié)構(gòu)簡單的線蟲拮抗化合物2糠酸，其對南方根結(jié)線蟲表現(xiàn)出有效的致死活性［31］。本研究發(fā)現(xiàn)因蘇特曲霉Snef2766顯示出較高殺線蟲活性和卵孵化抑制作用，并隨處理時間的增加而增強。而且，因蘇特曲霉可以產(chǎn)生具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤等活性的化合物包括萜類、苯酚類、糖苷類、環(huán)肽類等［32］。因此，需要針對因蘇特曲霉菌株Snef2766殺線蟲活性物質(zhì)進行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定研究。

曲霉不僅能夠防治植物病害，而且能夠有效促進植物生長發(fā)育。黑曲霉"Z8具有良好的促生功能，顯著增加大豆芽的生物量，提高大豆幼苗的株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、可溶性糖、可溶性蛋白含量［33］。盆栽條件下，黑曲霉ZJ17對白芷具有促生作用［34］。日本曲霉M1對玉米植株有顯著促生效果，不僅提高玉米植株鮮重和干重，而且顯著增加土壤有效磷含量［35］。本研究發(fā)現(xiàn)，溫室盆栽和溫室大棚條件下因蘇特曲霉Snef2766均能顯著增加番茄株高和根鮮重等生理指標。但因蘇特曲霉Snef2766菌株促進番茄植株生長的活性物質(zhì)及機制還有待進一步研究。

利用生防菌灌根和包衣處理種子是防治植物病害的有效措施之一。在溫室條件下，塔賓曲霉A.tubingensis通過包衣種子處理和灌根處理，均能減少南方根結(jié)線蟲J2的侵入量并降低線蟲發(fā)育［36］。以適宜濃度的黑曲霉作為丸粒化種衣劑的有效成分處理高粱種子，可以使株高矮化增強其抗倒伏能力，對高粱葉斑病有一定的防效［37］;盆栽試驗中，土曲霉MR9孢子懸浮液灌根處理防風，對防風枯萎病防效為6786%，防治效果較好［38］。本研究發(fā)現(xiàn)，因蘇特曲霉Snef2766發(fā)酵液灌根和包衣番茄種子處理后均能有效防治南方根結(jié)線蟲病的發(fā)生。在生產(chǎn)實踐中，灌根和包衣種子處理也將是該菌株可供選擇的使用方法。

本研究篩選并鑒定出一株因蘇特曲霉Snef2766，能有效防治根結(jié)線蟲病并促進番茄植株生長，具有較好的應用潛能，但需要進一步評價其田間生防效果、解析生防和促生機理等，為南方根結(jié)線蟲病的防治提供新的潛在生防資源和策略支持。

參考文獻

［1］"李解放."南方根結(jié)線蟲趨化性相關基因的初步研究［D］."昆明："云南大學，"2020.

［2］"ABAD"P，"GOUZY"J，"AURY"J"M，"et"al."Genome"sequence"of"the"metazoan"plantparasitic"nematode"Meloidogyne"incognita"［J］."Nature"Biotechnology，"2008，"26（8）："909915.

［3］"BIRD"D"M，"KOLTAI"H."Plant"parasitic"nematodes："Habitats，"hormones，"and"horizontallyacquired"genes"［J］."Plant"Growth"Regulation，"2000，"19（2）："183194.

［4］"段玉璽."植物線蟲學［M］."北京："科學出版社，"2011.

［5］"彭煥，"趙薇，"姚珂，"等."植物寄生線蟲基因組學研究進展［J］."生物技術(shù)通報，"2021，"37（7）："313.

［6］"盧志軍，"陳明遠，"黃健，"等."土壤化學熏蒸劑在根結(jié)線蟲防治中的應用［J］."中國植保導刊，"2016，"36（9）："5964.

［7］"李頌，"段玉璽，"朱曉峰，"等."黑曲霉次生代謝產(chǎn)物對番茄抗根結(jié)線蟲病效果的影響［J］."中國蔬菜，"2011（4）："44"49.

［8］"王帥，"郭龍玉，"朱曉峰，"等."聚多曲霉Snef210對南方根結(jié)線蟲毒性的研究［J］."植物保護，"2018，"44（6）："5560.

［9］"何瓊，"李丙雪，"王冬亞，"等."日本曲霉ZW1發(fā)酵濾液的殺線蟲活性和發(fā)酵條件優(yōu)化［J］."中國生物防治學報，"2020，"36（4）："619627.

［10］張春秋，"馬光恕，"廉華，"等."木霉對黃瓜幼苗生理特性及枯萎病防治效果的影響［J］."植物保護，"2018，"44（5）："238246.

［11］宿靜瑤."蘋果樹腐爛病菌拮抗菌的分離、篩選和鑒定［D］."呼和浩特："內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，"2021.

［12］李磊，"趙俊杰，"劉瑩瑩，"等."高效根結(jié)線蟲生防真菌篩選及其性能研究［J］."生物學雜志，"2021，"38（6）："7074.

［13］劉維志."植物線蟲學研究技術(shù)［M］."沈陽："遼寧科學技術(shù)出版社，"1995.

［14］陸然，"王媛媛，"朱曉峰，"等."八角根圍土壤真菌種類鑒定及其對南方根結(jié)線蟲的活性評價［J］."植物保護，"2014，"40（6）："4246.

［15］魏景超."真菌鑒定手冊［M］."上海："上海科學技術(shù)出版社，"1979.

［16］張中義."中國真菌志［M］."北京："科學出版社，"2003.

［17］SAGHAIMAROOF"M"A，"SOLIMAN"Knbsp;M，"ALLARD"R"A"J"W."Ribosomal"DNA"spacerlength"polymorphisms"in"barley："Mendelian"inheritance，"chromosomal"location，"and"population"dynamics"［J］."Proceedings"of"the"National"Academy"of"Sciences"of"the"United"States"of"America，"1984，"81（24）："80148018.

［18］DOYLE"J."A"rapid"DNA"isolation"procedure"for"small"quantities"of"fresh"leaf"tissue"［J］."Phytochemical"Bulletin，"1987，"19：1115.

［19］GUO"Liangdong，"HYDE"K"D，"LIEW"E"C"Y."Identification"of"endophytic"fungi"from"livistona"chinensis"based"on"morphology"and"rDNA"sequences"［J］.New"Phytologist，"2000，"147（3）："617630.

［20］FAN"Haiyan，"YAO"Meiling，"WANG"Haiming，"et"al."Isolation"and"effect"of"Trichoderma"citrinoviride"Snef1910"for"the"biological"control"of"rootknot"nematode，"Meloidogyne"incognita"［J/OL］."BMC"Microbiology，"2020，"20（1）："299."DOI："101186/s12866020019844.

［21］BRIDGE"J，"PAGE"S"L"J."Estimation"of"rootknot"nematode"infestation"levels"on"roots"using"a"rating"chart"［J］."Tropical"Pest"Management，"1980，"26（3）："296298.

［22］趙勁捷."根瘤內(nèi)生細菌抗南方根結(jié)線蟲的生物活性研究［D］."沈陽："沈陽農(nóng)業(yè)大學，"2020.