灰葡萄孢培養基種類和繼代培養對松材線蟲致病力的影響

摘要

本試驗在8種培養基上培養灰葡萄孢Botrytis"cinerea，以灰葡萄孢喂飼松材線蟲Bursaphelenchus"xylophilus，采用3年生黑松Pinus"thunbergii作為接種材料，研究松材線蟲繁殖力和致病力的變化，同時探究了在PDA灰葡萄孢上繼代培養84代的松材線蟲致病力的變化。結果表明，以玉米、小麥和PDA"3種培養基培養的灰葡萄孢喂飼松材線蟲，其繁殖力顯著高于CDA和4種合成培養基，其中PDA灰葡萄孢上的松材線蟲數量最多，比合成培養基C或D培養的灰葡萄孢上的線蟲數量提升了4894%;接種PDA灰葡萄孢組松材線蟲的黑松病情指數最高，較最低的合成培養基D灰葡萄孢組高了4787%。松材線蟲在PDA灰葡萄孢上繼代培養至第14代后，繼代次數的增加會導致其致病力下降，接種第79代松材線蟲后黑松病情指數已為0。因此，為保證松材線蟲的致病力不衰退，應使用PDA灰葡萄孢培養基喂飼松材線蟲，且松材線蟲繼代培養應控制在14代以內。研究結果將為松材線蟲的繁殖技術與致病相關機理分析等提供參考。

關鍵詞

松材線蟲;"繁殖力;"致病力;"培養基;"繼代培養

中圖分類號：

S"7637

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2024121

Influence"of"Botrytis"cinerea"culture"mediums"and"subculturing"on"the"virulence"of"Bursaphelenchus"xylophilus

WANG"Daohan1，"QU"Hongye1，"MI"Renjun2，"TAN"Jiajin1*

（1."CoInnovation"Center"for"Sustainable"Forestry"in"Southern"China，College"of"Forestry"and"Grassland，"Nanjing"Forestry"

University，"Nanjing"210037，China;"2."Forestry"Bureau"of"Chenxi"County，"Hunan"Province，"Huaihua"419599，"China）

Abstract

In"this"study，"changes"in"the"fecundity"and"virulence"of"Bursaphelenchus"xylophilus"fed"on"Botrytis"cinerea"growing"on"eight"different"mediums"and"changes"in"the"virulence"of"B.xylophilus"subcultured"on"PDA"for"84"generations"were"examined，"using"3yearold"Pinus"thunbergii"as"the"inoculum"material."The"results"showed"that"the"fecundity"of"B.xylophilus"fed"on"B.cinerea"growing"on"three"mediums，"namely"corn，"wheat，"and"PDA，"was"significantly"higher"than"those"fed"on"B.cinerea"on"CDA"and"four"synthetic"mediums."The"population"size"of"B.xylophilus"was"highest"on"the"combination"of"PDA"and"B.cinerea，"4894%"higher"than"those"the"combination"of"synthetic"medium"C/D"and"B.cinerea."The"disease"index"of"P.thunbergii"inoculated"with"B.xylophilus"fed"on"B.cinerea"on"PDA"was"also"the"highest，"4787%"higher"than"inoculation"with"B.xylophilus"fed"on"B.cinerea"on"the"synthetic"medium"D."However，"after"14"generations"of"subculturing"B.xylophilus"fed"on"B.cinerea"on"PDA，"an"increase"in"successive"generations"led"to"a"decrease"in"virulence."By"the"79th"generation，"the"disease"index"of"P.thunbergii"inoculated"with"B.xylophilus"was"zero."Therefore，"to"maintain"virulence，"B.xylophilus"should"be"cultured"on"B.cinerea"growing"on"PDA"and"subcultured"for"no"more"than"14"generations."These"findings"provide"valuable"insights"into"the"reproduction"technology"and"pathogenic"mechanisms"of"B.xylophilus.

Key"words

Bursaphelenchus"xylophilus;"fecundity;"virulence;"culture"medium;"subculturing

松材線蟲病是由松材線蟲Bursaphelenchus"xylophilus引起的一種系統性侵染病害，主要危害松屬Pinus植物［1］。松材線蟲取食

導致松樹萎蔫枯死。松材線蟲病蔓延迅速，致死率高，感病松樹種類多，防治難度大，已成為我國最具危險性和毀滅性的植物檢疫性病害。松材線蟲病自1982年在南京市首次報道［2］后，40多年來在我國不斷發展，目前我國已是松材線蟲病發生最嚴重的國家，至2024年全國共有18個省（自治區、直轄市）663個縣級行政區發生疫情［3］。在松材線蟲病研究過程中，以人工方法大量培養松材線蟲是十分必要的，目前實驗室常用的方法是在真菌灰葡萄孢Botrytis"cinerea菌落上培養松材線蟲，國內外對不同培養材料（培養基/木材）和真菌種類培養松材線蟲的研究已有不少報道［45］，但在培養過程中是否會因真菌培養基種類的不同而使線蟲繁殖力和致病力發生變化，這一問題并未有深入的研究。此外，在線蟲繼代培養方面，1983年日本學者提出，人工培養的松材線蟲在5年內致病力不會喪失［6］。而高景斌等［7］于2006年指出多次繼代培養的松材線蟲較初代培養的繁殖能力顯著下降，且生命活力更差，繼代培養15代后松材線蟲的致病力會急劇下降。線蟲的繼代次數與其致病力變化的關系究竟如何，目前仍不清楚。由于松材線蟲的致病力是影響病害流行的重要因素，且致病力分化一直是松材線蟲病的研究熱點［810］。為明確人工培養松材線蟲過程中影響其致病力的因素，本研究測定不同培養基種類和繼代培養對松材線蟲致病力的影響，為松材線蟲病的病理研究提供參考。

1"材料與方法

1.1"供試材料

松苗為南京林業大學北大山苗圃內3年生黑松Pinus"thunbergii。

松材線蟲Bursaphelenchus"xylophilus強毒力蟲株FD3，由南京林業大學森林病理實驗室提供，已經過形態學與分子生物學鑒定。該蟲株分離自福建省東山縣西山巖2～（2）區小班一瀕死馬尾松Pinus"massoniana，為第0代松材線蟲。

灰葡萄孢Botrytis"cinerea由南京林業大學森林病理實驗室提供。供試培養基共8種，包括2種天然培養基（玉米和小麥培養基），2種半合成培養基（PDA和CDA培養基）和4種合成培養基（合成培養基A、B、C和"D）。培養基種類參考文獻［1113］，根據試驗需求調整組分，配方見表1。

1.2"試驗方法

1.2.1"灰葡萄孢的培養

所有培養基121℃高溫高壓滅菌20"min后，分裝到直徑90"mm，高16"mm的培養皿中，20"mL/皿。待培養基冷卻后，接種灰葡萄孢，25℃恒溫暗培養7"d，用于喂飼松材線蟲。

1.2.2"松材線蟲的培養

將表面消毒的松材線蟲FD3接種到長滿灰葡萄孢的培養基上，25℃恒溫暗培養5"d左右。繼代培養線蟲采用長滿灰葡萄孢的PDA培養基，25℃暗環境下繼代培養4～84代，每代培養5"d。接種前采用貝爾曼漏斗法［14］分離線蟲，用1%的硫酸鏈霉素表面消毒15"min，再用無菌水洗滌3次，最后用無菌水配制濃度為17"500條/mL的線蟲懸浮液［15］。

1.2.3"松材線蟲的繁殖力測定

在8種不同培養基培養的灰葡萄孢菌落上分別接入200條松材線蟲，每處理5個重復，25℃恒溫培養5"d后，貝爾曼漏斗法分離線蟲，制備為線蟲懸浮液，在顯微鏡下統計線蟲數量，按觀測線蟲液體積與懸浮液總體積比例計算線蟲總量。

1.2.4"松材線蟲對松樹苗的致病力測定

接種采用人工皮接法［16］。用滅菌解剖刀在松苗主莖中部偏下的主莖上由下往上割開樹皮，深及木質部，但不超過莖直徑的1/3。掀開樹皮塞入大小合適的滅菌棉球，并用封口膜將樹皮和棉球包裹好，用移液槍注入線蟲懸浮液，每株加樣量為200"μL"（約3"500條），對照注入等量無菌水。各處理接種8株黑松苗，每周苗圃內所有苗木統一澆水2次。

每天觀察松苗的發病情況并記錄，5"d統計1次發病級別，病株分級標準［17］如下：0級，正常;Ⅰ級，褪綠、部分針葉（1/4以下）變黃;Ⅱ級，1/4～3/4針葉變黃、1/4以下針葉變紅;Ⅲ級，3/4左右針葉變紅;Ⅳ級，針葉全部變紅、植株死亡。參考方中達［18］的方法，按下列公式計算病情指數，比較各處理病害嚴重程度。待松樹完全枯死后，將枝干劈至玉米粒大小，采用貝爾曼漏斗法分離線蟲并鑒定。

病情指數=∑（各級病株數×各級代表值）調查總株數×最高級代表值×100。

1.3"數據統計

利用SPSS"24.0軟件通過單因素方差分析及LSD多重比較對數據進行統計分析，采用Graphpad"Prism"9.0作圖。

2"結果與分析

2.1"不同灰葡萄孢培養基對松材線蟲繁殖力的影響

試驗結果表明，玉米、小麥和PDA"3種培養基較CDA和4種合成培養基繁殖灰葡萄孢效果好，同時，松材線蟲在它們培養的灰葡萄孢菌落上繁殖力也較大（圖1）。培養5"d線蟲數量分別為4"200、4"000條和3"860條，顯著高于其他培養基，而CDA和4種合成培養基繁殖灰葡萄孢效果較差，松材線蟲在其上繁殖量較小，培養5"d后僅為2"820～3"240條。PDA灰葡萄孢上的線蟲數量最高，相較于線蟲數量最低的合成培養基C/D灰葡萄孢提高了48.94%。

2.2"不同灰葡萄孢培養基對松材線蟲致病力的影響

接種松材線蟲后15"d，用PDA灰葡萄孢培養的線蟲接種的黑松苗頂部梢頭開始萎蔫下垂，接種點附近針葉的基部變成褐色，而針葉其余部分正常（圖2a）。接種后25"d這種癥狀向遠離接種點擴展，針葉變色的長度逐漸增加（圖2b），接種后40"d大部分針葉失綠變成褐色，僅有少數針葉維持在淺綠色或黃色（圖2c）。接種后60"d所有的針葉全部失綠變成褐色，莖部干枯，全株枯萎死亡（圖2d）。在死亡的松苗中均分離到松材線蟲，而對照一直生長良好，沒有分離到松材線蟲。

培養基種類對松材線蟲致病力有明顯影響。松材線蟲取食PDA、玉米和小麥培養基培養的灰葡萄孢其致病力大于取食CDA和4種合成培養基上的灰葡萄孢。表現為：接種后黑松的病情指數明顯偏高。接種線蟲后37"d，"PDA、玉米、小麥培養基處理組黑松的病情指數達64.25～69.50，而其他處理的黑松的病情指數僅為47.00～56.25（圖3）。PDA組的黑松病情指數最高，較最低的合成培養基D組高了47.87%。試驗中還發現，松材線蟲蟲株FD3的繁殖力與其致病力有關，繁殖力大，則致病力強。取食PDA、玉米和小麥培養基上的灰葡萄孢的線蟲其繁殖力較取食CDA和4種合成培養基上的灰葡萄孢高，致病力強，接種后黑松的病情指數高。

2.3"繼代次數對松材線蟲致病力的影響

繼代培養4代的松材線蟲接種后14"d，松苗開始出現癥狀，頂部梢頭略萎蔫下垂，失去光澤，接種點附近針葉的基部變成褐色，而針葉其余部分正常。隨后這種癥狀向遠離接種點擴展，針葉變色的長度逐漸增加，大部分針葉失綠變成褐色，褐變沿針葉基部向葉尖蔓延，"同時伴隨失水，僅有少數針葉維持在淺綠色或黃色。接種后55"d，針葉全部失綠變成褐色，莖部干枯，全株枯萎死亡。從死亡松苗中均分離到松材線蟲，而對照松苗一直生長良好，沒有分離到松材線蟲。

繼代次數增加會導致其致病力下降。繼代培養4、9、14代，線蟲致病力沒有變化，接種松苗后17"d，黑松的病情指數均達到了22;繼代培養19～39代，線蟲致病力開始下降，接種后黑松的病情指數為13～16;培養44～64代后，線蟲致病力再次衰退，接種后黑松的病情指數為4～7;而培養69～84代后，線蟲致病力已經很微弱，接種后黑松的病情指數最低，僅為0～1（圖4）。

3"結論與討論

無菌松材線蟲接種松樹致使寄主萎蔫，確定了松材線蟲是松材線蟲病的病原［19］。該病原線蟲的致病力是影響松材線蟲病的關鍵因子，而松材線蟲致病力的分化受地理位置、寄主來源和種類、氣候和自身特性等多種因素的影響，因此，把握住病原致病力的分化對全面監測松材線蟲病和控制其繼續擴散蔓延具有重要的意義。室內培養階段中灰葡萄孢培養基種類和繼代培養次數對松材線蟲致病力影響的相關研究較少，本研究針對以上2個影響因素，測定了松材線蟲FD3蟲株對3年生黑松的致病力變化。結果表明，在人工培養松材線蟲的過程中，線蟲取食玉米、小麥和PDA培養基上的灰葡萄孢后，其繁殖力和致病力顯著高于CDA和4種合成培養基，而在PDA灰葡萄孢上繼代培養大于14代，松材線蟲的致病力會下降。

培養灰葡萄孢的培養基種類影響松材線蟲的繁殖力，松材線蟲在取食PDA、玉米和小麥3種培養基繁殖的灰葡萄孢后，其繁殖力顯著高于CDA和4種合成培養基，其致病力也均高于后者。前人針對繁殖松材線蟲的灰葡萄孢培養基種類的研究較少，但早在1992年白興月等［20］便嘗試用三角瓶裝的玉米粒培養基取代PDA平板，這一培養方式使松材線蟲的繁殖量提高了20～30倍，且在4℃下，松材線蟲在玉米粒上可以存活10個月以上，這遠遠長于其在PDA平板上的存活時間。王守先［13］在探究松材線蟲的人工培養方式時，發現玉米粒培養基雖得到的松材線蟲繁殖倍數遠高于PDA平板培養基，但其分離出來的線蟲溶液較混濁，在反復清洗的過程中容易丟失線蟲，且操作繁瑣。本研究中的松材線蟲取食兩種天然培養基灰葡萄孢的繁殖力與PDA灰葡萄孢相當，并未出現玉米粒灰葡萄孢的極高繁殖倍數，這可能是由于采用的培養基容器（平板/三角瓶）、培養基體積以及天然材料的預處理方式不同等原因造成的。

有關松材線蟲繁殖力與致病力之間的關系一直是研究的熱點。本試驗表明，松材線蟲取食PDA、玉米和小麥3種培養基繁殖的灰葡萄孢，其繁殖力和致病力均高于取食CDA和4種合成培養基培養的灰葡萄孢的松材線蟲，且取食PDA灰葡萄孢的松材線蟲繁殖力和致病力均最高，因此松材線蟲蟲株FD3的繁殖力與其致病力存在正相關性，這與Kiyohara等［21］的結果相一致，該結果同樣與前人研究的主流結論相似［2223］，但這種正相關性在不同蟲株間表現是否穩定還有待于進一步研究。有研究發現松材線蟲的大量繁殖及其在樹體內的遷移與寄主早期癥狀的發展相一致，認為松材線蟲的繁殖力是影響致病力和該病發生發展的關鍵原因［24］。另有研究報道，致病力較弱的松材線蟲蟲株在黑松幼苗樹體內的繁殖量顯著低于致病力較強的蟲株［25］，而強致病力蟲株較弱致病力蟲株擁有更短的代時、更高的繁殖力和更快的種群增長率［26］。朱麗華等［2728］發現松材線蟲不同致病力蟲株雜交的后代在馬尾松P.massoniana幼苗體內的繁殖力與致病力之間存在一定程度的正相關，但不顯著，而在灰葡萄孢上的繁殖力與致病力相關性較弱。還有研究［29］對比了中美兩國不同株系松材線蟲繁殖力和致病力的差異，發現入侵中國的外來種繁殖力和致病力有明顯增強的現象，這與其sod3基因的異常存在一定聯系。但也有研究認為松材線蟲的繁殖力與致病力之間并無關系，甚至認為松材線蟲的致病力與繁殖力呈負相關［30］，松材線蟲在侵染松樹的過程中的強致病力以犧牲部分繁殖力為代價。

本研究中，通過對不同繼代次數松材線蟲蟲株FD3致病力的測定，發現松材線蟲繼代次數的增加會導致其致病力下降，至接種第79代線蟲的黑松病情指數已為0。目前已知繼代培養可能會引起微生物變異和生物學特性的改變，但有關病原微生物致病力變化的研究多是真菌類病原。白僵菌Beauveria"bassiana［31］"和金龜子綠僵菌Metarhizium"anisopliae［32］在繼代培養后都出現退化現象，其內的破壞毒素含量明顯降低。玉米大斑病菌Setosphaeria"turcica繼代培養14～22代時，其產孢能力、生長速度、孢子大小、發病率和病斑面積均呈明顯退化現象［33］。鏈格孢Alternaria"alternata［34］在PDA"培養基上連續繼代培養5代后，也出現菌株退化現象，并且會影響菌株產生"AOH、AME、ALT"和"TeA"毒素的能力。但也有研究發現繼代次數和病原致病力之間并非簡單的正相關性，繼代培養30代的青枯雷爾氏菌Ralstonia"solanacearum致病力低于繼代培養0代的菌株，但繼代培養60代的菌株卻高于前兩者［35］。有關線蟲繼代培養的研究較為空缺，早期有學者提出連續5年以上通過取食灰葡萄孢繼代培養的松材線蟲種群，對松樹的致病力顯著降低［6］。高景斌等［7］也通過試驗證實多次繼代培養的松材線蟲難以侵入松樹體內，且在寄主體內難以大量繁殖。本次試驗中，松材線蟲蟲株FD3在繼代培養19代后致病力開始下降，這與高景斌等報道的松材線蟲繼代培養15代后致病力急劇下降的結果有些差異，可能是因為不同蟲株本身致病力大小不同所造成的，或者是在繼代培養過程中，由于培養條件不同而引起的。本試驗結果進一步證實了繼代培養會導致松材線蟲致病力的下降。"目前，蟲株FD3出現該現象的具體影響因素仍不清楚，還需進行遺傳方面的分析，"探究各代蟲株之間是否發生了關鍵致病基因及轉錄表達方面的改變。

綜上所述，在FD3蟲株實際應用過程中，為保證蟲株的致病力不衰退，應使用PDA灰葡萄孢培養基培養線蟲，且線蟲繼代次數應盡量控制在14代以內。本研究結果為松材線蟲的繁殖技術與致病機理分析等提供了參考。但目前對于各處理松材線蟲的繁殖力和致病力出現變化是否是因為松材線蟲在取食不同培養基上的灰葡萄孢后或繼代培養不同代后，線蟲的壽命或發育過程產生了變化，還是存在其他影響因素尚未明確，因此，擬進一步開展對于灰葡萄孢培養基種類和繼代培養次數在生理及分子層面對松材線蟲繁殖力和致病力影響的研究。

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