蘋果類受體激酶MdFER1負調控腐爛病抗性

摘要

挖掘抗病基因可為蘋果抗病育種提供基因材料。本研究結合生物信息學分析、基因表達分析和功能驗證，分析了長春花類受體激酶1類蛋白（Catharanthus"roseus"receptorlike"kinase1like，"CrRLK1L）亞家族成員MdFER1在蘋果腐爛病抗性中的作用。結果表明，MdFER1與擬南芥FER同源但序列相似性較低，僅為46.4%。在‘煙富6號’果實和‘王林’懸浮細胞中瞬時表達MdFER1，果實和細胞對蘋果腐爛病的抗性顯著降低。MdFER1瞬時表達可顯著誘導活性氧（reactive"oxygen"species，"ROS）相關基因TaNOX和超敏反應（hypersensitive"response，"HR）相關基因HSR203的表達，但抑制防御相關基因PR1和EDS1的表達。綜上所述，MdFER1負調控‘煙富6號’果實和‘王林’懸浮細胞對蘋果腐爛病抗性，ROS和HR信號被激活和防御相關基因表達被抑制是該基因負調控蘋果腐爛病抗性的重要原因。

關鍵詞

蘋果腐爛病;"長春花類受體激酶1類蛋白;"標記基因

中圖分類號：

S"436.611.11

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023657

The"malectinlike"kinase"MdFER1"negatively"regulates"resistance"to"Valsa"canker

ZHENG"Yan1，"LU"Yuan1，"SUN"E1，"CAI"Minrui1，"LIU"Zhihong1，"ZUO"Cunwu1*，"NIU"Junqiang2*

（1."College"of"Horticulture，"Gansu"Agricultural"University，"Lanzhou"730070，"China;"2."Institute"of"Fruit"

and"Flower"Research，"Gansu"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Lanzhou"730070，"China）

Abstract

Screening"for"resistance"genes"can"provide"valuable"genetic"materials"for"breeding"apple"varieties"with"enhanced"resistance."We"analyzed"the"role"of"MdFER1，"a"member"of"the"Catharanthus"roseus"receptorlike"kinase1like"（CrRLK1L）"proteins"subfamily，"in"apple"Valsa"canker"resistance"through"bioinformatics"analysis，"expression"analysis，"and"functional"verification"of"the"gene."The"results"showed"that"MdFER1"is"homologous"to"Arabidopsis"FER，"although"the"sequence"similarity"is"only"46.4%."Transient"expression"of"MdFER1"in"either"‘Yanfu"6’"fruits"or"‘Wanglin’"suspension"cells"significantly"reduced"resistance"to"apple"Valsa"canker."Additionally，"MdFER1"transient"expression"significantly"activated"the"expression"of"genes"associated"with"reactive"oxygen"species"（TaNOX）"and"hypersensitive"response"（HSR203），"but"inhibited"the"expression"of"defenserelated"genes"PR1"and"EDS1."In"summary，"MdFER1"negatively"regulates"resistance"to"apple"Valsa"canker"in"‘Yanfu"6’"fruits"or"‘Wanglin’"suspension"cells."The"activation"of"ROS"and"HR"signaling，"along"with"the"inhibition"of"defenserelated"gene"expression，"are"key"factors"contributing"to"the"negative"regulation"of"apple"Valsa"canker"resistance"by"MdFER1.

Key"words

apple"Valsa"canker;"Catharanthus"roseus"receptorlike"kinase1like;"marker"gene

由腐生黑腐皮殼屬Valsa"spp.致病真菌引起的腐爛?。╒alsa"canker）極具破壞性，可導致植株主干或主枝韌皮組織腐爛乃至整棵樹死亡，是蘋果和梨產業的重大真菌病害［16］。長期以來，科技工作者研發了多種農業防治、物理防治、生物防治和化學防治措施，但由于病原菌菌絲可深入至木質部，現有的防控措施仍很難實現對該病害的根治［7］?？共》肿佑N從病原物與寄主互作機制出發，深入挖掘抗病基因，從而定向培育抗性植物。蘋果組織再生、遺傳轉化和基因編輯技術體系的不斷成熟為抗病育種提供了可能［89］。因此，深入研究腐爛病抗性機理并挖掘主效基因對加快育種進程具有重要作用。

植物對病原體的免疫反應包括基礎免疫和寄主特異性免疫，其中基礎免疫在植物抵抗腐生菌中起重要作用，其主要由植物模式識別受體（pattern"recognition"receptor，"PRRs）響應病原菌分子模式（pathogen"associate"molecular"patterns，"PAMPs）后啟動［10］。類受體激酶（receptorlike"kinase，"RLK）家族擁有龐大的家族成員，其多個成員響應PAMPs信號并激活免疫反應［11］。長春花類受體激酶1類蛋白（Catharanthus"roseus"receptorlike"kinase1like，CrRLK1L）亦被稱為Malectin樣受體激酶，其亞家族成員FERONIA（FER）參與多種生物學過程，如感知細胞壁完整性、植物激素信號傳導及免疫反應等［12］。fer純合突變體增強了擬南芥對高氏白粉病菌Golovinomyces"orontii的抗性［13］。FER也負調控寄主對尖孢鐮刀菌Fusarium"oxysporum的免疫反應［14］。蘋果FER類受體激酶"MdMRLK2過表達抑制植物抗病防御體系和超敏反應，負調控蘋果腐爛病的抗性［12］。此外，FER可與PRRs形成復合物正向調節植物基礎免疫反應［1516］。因此，FER功能的多樣性引起了研究者的廣泛研究。

本研究結合生物信息學分析、表達分析和功能驗證，分析MdFER1在蘋果腐爛病抗性中的作用，并對免疫反應中重要信號通路的標記基因的表達進行分析。初步解析蘋果類受體激酶MdFER1的功能，為抗病基因的鑒定提供參考。

1"材料與方法

1.1"材料

1.1.1"病原菌及植物材料

蘋果腐爛病菌Valsa"mali（Vm）菌株VmA019分離自甘肅靜寧發病‘富士’蘋果樹韌皮組織?！趿帧仓旰汀疅煾?號’果實由甘肅農業大學提供，

‘王林’愈傷組織由‘王林’植株的幼嫩葉片誘導獲得，‘王林’懸浮細胞由‘王林’愈傷組織在MS液體培養基中懸浮培養獲得。

1.1.2"試劑及載體材料

大腸桿菌TreliefTM"5α購買自北京擎科生物科技股份有限公司;SteadyPure質粒DNA提取試劑盒、Evo"MMLV"RTPCR試劑盒、Evo"MMLV反轉錄預混型試劑盒、SYBR"Green"Pro"Taq"HS預混型qPCR試劑盒和DNA連接試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;AscⅠ和AvrⅡ酶購買自賽默飛世爾科技公司;GV3101感受態細胞購自上海唯地生物技術有限公司;柱式RNA提取試劑盒和載體pFGC5941購自北京天恩澤基因科技有限公司。頭孢霉素、MES"［2（N嗎啡啉）乙磺酸］、AS（乙酰丁香酮）、6BA（6芐氨基喋呤）、2，4滴、瓊脂粉和蔗糖購自北京索萊寶科技有限公司。M519購自PhytoTech"Labs。

1.1.3"培養基

MS液體培養基：每1"000"mL培養基中含4.43"g"M519、2"mL"6BA（1"mg/mL）、0.5"mL"2，4滴（1"mg/mL）和30"g蔗糖。MS液體培養基中加入0.8%瓊脂粉為MS固體培養基。所有培養基高溫滅菌（121℃，20"min）后使用。

1.2"方法

1.2.1"表達載體構建及結構域分析

根據蘋果轉錄組數據篩選得到差異基因MD17G1063000，該基因經注釋具有長春花類受體激酶1類蛋白的功能。利用薔薇科基因組在線數據庫GDR（genome"database"for"Rosaceae，"https："∥www.rosaceae.org/species/malus/all）獲得MD17G1063000的CDS序列和蛋白序列。將MD17G1063000的蛋白序列提交至擬南芥在線數據資源庫TAIR（Arabidopsis"information"resource，"http：∥www.arabidopsis.org）比對相似性，并根據擬南芥同源基因名稱將MD17G1063000命名為MdFER1。利用在線軟件SMART（http："∥smart.emblheidelberg.de/）預測MdFER1蛋白序列是否包含Malectin結構域。使用Primer"Premier"5.0設計MdFER1特異性引物pFGC5941MdFER1（表1）。

使用柱式RNA提取試劑盒提取培養3"d的‘王林’懸浮細胞的RNA，利用Evo"MMLV"RTPCR試劑盒反轉錄為cDNA。利用特異性引物pFGC5941MdFER1，以cDNA為模板擴增MdFER1全長。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。產物與克隆載體pMDTM19T連接并轉化至大腸桿菌TreliefTM"5α。挑選陽性單克隆送擎科生物科技股份有限公司測序。挑選測序正確的菌液擴繁，并用SteadyPure質粒DNA提取試劑盒提取質粒，經AscⅠ和AvrⅡ酶切后，使用DNA連接酶連接至表達載體pFGC5941中，提取質粒后轉化農桿菌GV3101，與50%甘油混合后保存至-80℃冰箱備用。

1.2.2"MdFER1組織特異性分析

收集健康野生‘王林’植株的不同組織（葉片、新根、果實、莖及花），樣品經液氮速凍后保存于-80℃備用;使用柱式RNA提取試劑盒提取不同組織的RNA。使用Evo"MMLV反轉錄預混型試劑盒反轉錄為cDNA，以該cDNA為模板使用MdFER1引物（表1）進行實時熒光定量PCR（quantitative"realtime"PCR，qPCR）分析。qPCR反應體系（20"μL）：cDNA"1"μL，上、下游引物（10"μmol/L）各1"μL，超純水7"μL，SYBR"Green"Master"Mix"10"μL。反應條件為：95℃"2"min;95℃"10"s，58℃"20"s;40個循環。以Actin為內參基因，以全部組織中目標基因的平均表達量為對照，采用2-ΔΔCt法計算各個基因的表達量，其中ΔΔCt=ΔCt試驗組-ΔCt對照組;ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因。采用"IBM"SPSS"Statistics"22進行單因素方差分析，鄧肯氏新復極差法進行差異顯著性檢驗，顯著水平設置為0.05。

1.2.3"MdFER1響應腐爛病菌信號的表達分析

1.2.3.1"蘋果腐爛病菌代謝物制備

參照Sun等［17］的方法收集蘋果腐爛病VmA019菌株的代謝物。具體如下：將VmA019菌株接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato"dextrose"agar，"PDA）活化72"h;而后在菌落邊緣均勻取10個菌餅接種至馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基（potato"dextrose"broth，"PDB）中，于25℃培養箱中黑暗、靜置培養72"h（每隔12"h振蕩1次），經離心和過濾除菌，獲得菌株VmA019的代謝物原液，保存于4℃冰箱，用于處理‘王林’懸浮細胞。

1.2.3.2"‘王林’一年生枝條中MdFER1對腐爛病菌的響應

使用一次性打孔器在‘王林’一年生枝條均勻打3個孔，在活化72"h的VmA019在菌落邊緣均勻取3個菌餅接種至‘王林’一年生枝條，并在接種后24、36"h和48"h在接種部位取樣，樣品經液氮速凍后保存于-80℃備用，RNA提取及熒光定量分析同1.2.2。以未處理（0"h）的‘王林’一年生枝條為對照，Actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算24、36"h和48"h時MdFER1的表達量。

1.2.3.3"‘王林’懸浮細胞中MdFER1對蘋果腐爛病菌代謝物的響應

取繼代培養3"d的‘王林’懸浮細胞，利用40目細胞過濾篩去除較大細胞團，再用200目細胞過濾收集小的‘王林’細胞團，將500"μL‘王林’細胞團轉入36"mL"MS液體培養基中，25℃、130"r/min黑暗培養48"h后加入4"mL蘋果腐爛病菌的代謝物（Valsa"mali"metabolite，VmM），分別于處理后1、3"和6"h收集懸浮細胞，液氮速凍后保存于-80℃，以未處理（0"h）的‘王林’懸浮細胞為對照，Actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算1、3"h和6"h時MdFER1的表達量;RNA提取及熒光定量分析同1.2.2。

1.2.4"‘煙富6號’果實上瞬時過表達MdFER1及功能驗證

將攜帶pFGC5941（空載體，對照）和pFGC5941MdFER1的農桿菌菌株在28℃，220"r/min振蕩培養，當OD600為0.4～0.6時收集菌液，使用農桿菌重懸緩沖液（含10"mmol/L"MES，200"μmol/L"AS）重懸活化的農桿菌，于4℃冰箱靜置4"h。使用一次性無菌注射器吸取0.2"mL重懸液注射進‘煙富6號’果實中，放置于25℃培養箱中黑暗培養3"d，3"d后分別在注射部位取樣測定MdFER1是否成功過表達，以攜帶pFGC5941的農桿菌處理為對照，Actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算暗培養3"d時MdFER1的表達量，樣品保存、RNA提取及熒光定量分析見1.2.2。同時，暗培養3"d后在注射部位接種蘋果腐爛病菌，并在接種后24、48、72"h和96"h使用十字交叉法測量發病部位直徑。數據采用Microsoft"Excel"2007統計，使用t測驗（α=0.05）分析瞬時表達pFGC5941和pFGC5941MdFER1的果實上病斑直徑的差異顯著性。

1.2.5"在‘王林’懸浮細胞中瞬時過表達MdFER1及功能驗證

將攜帶pFGC5941和pFGC5941MdFER1的農桿菌菌株在28℃，220"r/min振蕩培養，當OD600為0.4～0.6時收集菌液用MS液體培養基重懸，而后與‘王林’懸浮細胞共培養48"h，獲得的懸浮細胞用含有200"μg/mL的頭孢霉素的滅菌水清洗3次，參照1.2.2的方法測定共培養細胞中MdFER1的相對表達量。同時將上述懸浮細胞平鋪于大小為35"mm×10"mm的MS固體培養基上，接種直徑5"mm的蘋果腐爛病菌菌餅，于接種后24、36"h和48"h使用十字交叉法測量菌落直徑。數據分析同1.2.4。

1.2.6"瞬時表達MdFER1的‘王林’懸浮細胞中不同信號通路標記基因表達模式分析

按1.2.5的方法制備MdFER1瞬時過表達細胞。使用蘋果腐爛病菌的代謝物處理瞬時表達pFGC5941（對照）及pFGC5941MdFER1的細胞，處理方法同1.2.3.3;分別在處理后1、3"h和6"h后取樣測定EDS1、HSR203、PR1以及TaNOX的表達量;樣品RNA保存、提取及熒光定量分析見1.2.2。數據采用Microsoft"Excel"2007統計，使用t測驗（α=0.05）分析同時期瞬時表達pFGC5941和pFGC5941MdFER1細胞中不同信號通路標記基因相對表達量的差異顯著性。

2"結果分析

2.1"MdFER1生物信息學分析

對MdFER1蛋白結構域進行分析表明，該蛋白包含典型的Malectin結構域（圖1b），是典型的長春花類受體激酶1類蛋白亞家族成員。以‘王林’懸浮細胞RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，采用MdFER1特異性引物進行擴增和克隆，結果顯示，目標條帶與MdFER1基因片段大小一致（圖1a），全長2"505"bp。

2.2"MdFER1組織特異性分析

為研究MdFER1在‘王林’植株的不同組織中的表達模式，通過RTqPCR對MdFER1在葉片、新生根部、果實等組織中的表達進行分析。結果表明，MdFER1在‘王林’果實中的表達量最高，其次為花和葉片;在莖中的表達量最低（圖2）。

2.3"MdFER1對蘋果腐爛病菌及其代謝物的響應

利用RTqPCR分析了蘋果腐爛病菌和蘋果腐爛病菌代謝物處理下MdFER1的表達模式。與沒有接種蘋果腐爛病菌的‘王林’一年生枝條相比，接種蘋果腐爛病菌24、36"h和48"h后，MdFER1的相對表達量分別下調18.6%、68.7%和37.9%（圖3a）。與未用蘋果腐爛病菌代謝物處理的‘王林’懸浮細胞相比，10%蘋果腐爛病菌代謝物處理‘王林’懸浮細胞后1、3"h和6"h，MdFER1的表達量分別下調了30.2%、78.95%和55.6%（圖3b）。表明MdFER1的表達受蘋果腐爛病菌信號誘導。

2.4"MdFER1在果實中瞬時表達及其對腐爛病菌的調控

利用農桿菌滲透法在‘煙富6號’蘋果果實中瞬時表達pFGC5941MdFER1，并在接種蘋果腐爛病菌后24、48、72"h和96"h檢測果實發病情況，以評價MdFER1瞬時表達對蘋果腐爛病抗性的影響。接種后96"h，瞬時表達pFGC5941MdFER1的果實病斑直徑明顯大于表達空載體pFGC5941的對照（圖4a，"b），且具有統計學意義（圖4d）。RTqPCR結果顯示，MdFER1在蘋果果實中成功瞬時過表達（圖4c）。結果表明，MdFER1負調控蘋果果實對蘋果腐爛病的抗性。

2.5"MdFER1在‘王林’懸浮細胞中瞬時過表達及其對腐爛病菌的調控

為了進一步研究MdFER1對蘋果腐爛病菌的調控作用，將MdFER1在‘王林’懸浮細胞中瞬時過表達。RTqPCR結果顯示，pFGC5941MdFER1表達上調至對照的36.5倍，已成功過表達（圖5c）。對pFGC5941處理的對照細胞和過表達pFGC5941MdFER1的細胞分別接種蘋果腐爛病菌，并在接種后24、36"h和48"h測定菌絲生長直徑，結果顯示，在過表達pFGC5941MdFER1的細胞上腐爛病菌生長迅速，但在對照細胞上生長緩慢（圖5a，b，d）。以上結果表明，MdFER1負調控‘王林’懸浮細胞對蘋果腐爛病菌的抗性。

2.6"過表達MdFER1的‘王林’懸浮細胞中相關通路標記基因表達量

為進一步探究MdFER1調節蘋果腐爛病的免疫機制，使用10%的蘋果腐爛病菌的代謝物處理瞬時表達pFGC5941（對照）和pFGC5941MdFER1的細胞，處理后1、3"h和6"h采用RTqPCR檢測了植物防御相關基因的表達水平。由圖6可知，與對照細胞相比，過表達MdFER1誘導了活性氧通路基因TaNOX和超敏反應通路基因HSR203的表達，且在處理1"h時TaNOX表達量達到最高值。而HSR203的表達在處理后隨著時間的變化持續上升，在6"h時最高，為對照的12.23倍。此外，過表達MdFER1后，系統性獲得抗性相關基因PR1和抗性R基因相關基因EDS1的表達水平均明顯低于對照細胞的水平。綜上，MdFER1瞬時表達后可激活ROS和HR相關的信號通路，但降低了抗性R基因及系統性獲得抗性基因的表達。

3"結論與討論

長春花類受體激酶1類蛋白基因作為重要的受體激酶亞家族，已在擬南芥、水稻等一些模式植物中廣泛研究。在擬南芥中，fer突變體增強了擬南芥對真菌尖孢鐮刀菌Fusarium"oxysporum的抗性［14］。水稻FERONIA樣受體基因OsFLR2和OsFLR11通過抑制防御相關基因表達減弱了水稻幼苗對稻瘟病的抗性［18］。本研究中，MdFER1的表達受蘋果腐爛病菌信號抑制，且瞬時表達MdFER1顯著降低‘煙富6號’果實和‘王林’懸浮細胞對蘋果腐爛病菌的抗性。因此，盡管MdFER1和擬南芥等物種中FER的序列相似性較低，但其在調控真菌抗性方面的功能相對保守，負調控植物對多種真菌的抗性［14，18］。

活性氧是一種重要的信號分子，在植物免疫反應過程中起重要的調控作用［18］。ROS通路相關基因的上調表達可激活植物細胞的超敏反應（HR），進而有效限制寄生菌的進一步侵染。然而，ROS爆發對腐生菌抗性的調控存在時空特異性，其激活的HR有利于腐生病原菌進一步繁殖［1921］。禾谷鐮孢Fusarium"graminearum分泌的高濃度毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，"DON）可以刺激ROS積累進而促進其在寄主植物上的生長及侵染［22］。燕麥葉枯病菌Cochliobolus"victoriae可以通過分泌毒素victorin誘導HR反應及細胞死亡，最終促進病原菌的繁殖［23］。蘋果腐爛病菌的代謝物處理后，與表達pFGC5941的對照細胞相比，MdFER1過表達細胞中HR相關基因HSR203和ROS相關基因TaNOX的表達量都顯著上調，而防御相關基因PR1及R蛋白EDS1的表達量都被大幅度抑制。推測ROS和HR信號的激活和防御基因表達的抑制可能是MdFER1負調控腐爛病抗性的重要原因。

綜上所述，MdFER1和擬南芥FER同源，但序列相似性較低，為46.4%，其響應蘋果腐爛病菌信號且負調控蘋果腐爛病抗性;ROS和HR信號的激活和防御相關基因表達的抑制是MdFER1負調控腐爛病抗性的重要原因。

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（責任編輯：楊明麗）