麥田雜草節節麥與圓柱山羊草的DNA條形碼鑒定

摘要

麥田惡性雜草節節麥Aegilops"tauschii"Coss.和圓柱山羊草Aegilops"cylindrica"Host.均為我國檢疫性有害生物，二者形態極其相似，導致生產中難以采取針對性的防控措施。為快速、準確地進行區分鑒定，本研究利用DNA條形碼技術，對采自河北、河南、山東等9省的52份樣品進行了鑒定。針對4個DNA條形碼序列區段rbcL、matK、trnHpsbA和ITS2，測序并計算種內、種間的雙參數遺傳距離，采用鄰接法構建系統發育樹。結果表明，matK擴增測序結果不理想;rbcL序列無差異;ITS2序列種內遺傳距離0.000"7，種間遺傳距離0.009"6;trnHpsbA序列存在15個差異位點，種內遺傳距離0，種間平均遺傳距離0.005"1，NJ樹支持率為96.0%，能明顯區分二者。特異性檢測中，節節麥和圓柱山羊草均存在特異性堿基，進一步證明trnHpsbA為最優鑒定序列。本研究為快速、準確鑒定這2種檢疫性雜草提供了新的分子檢測技術。

關鍵詞

節節麥;"圓柱山羊草;"DNA條形碼;"trnHpsbA

中圖分類號：

S"451.221

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023663

DNA"barcoding"identification"of"Aegilops"tauschii"and"Ae.cylindrica"in"wheat"fields

JIANG"Cuilan1，2，"HUANG"Hongjuan1，"LI"Longlong1，"WU"Kaidie1，"HUANG"Zhaofeng1，CUI"Hailan1*，"WEI"Shouhui1*

（1."Institute"of"Plant"Protection，"Chinese"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Beijing"100193，"China;"

2."Beijing"Wanhe"Technology"Co.，"Ltd.，"Beijing"102204，"China）

Abstract

Aegilops"tauschii"Coss."and"Ae.cylindrica"Host.，"both"malignant"weeds"in"wheat"fields，"are"considered"quarantine"pests"in"China."The"morphological"similarity"between"Ae.cylindrica"and"Ae.tauschii"complicates"targeted"weed"management"in"agricultural"production."To"address"this，"this"study"utilized"DNA"barcoding"technology"to"differentiate"and"identify"these"weeds."A"total"of"52"samples"from"9"provinces，"including"Hebei，"Henan，"and"Shandong，"were"analyzed."Four"DNA"barcode"sequences"（rbcL，"matK，nbsp;trnHpsbA，"and"ITS2）"were"sequenced."Intraspecific"and"interspecific"genetic"distances"were"calculated，"and"a"phylogenetic"tree"was"constructed"using"the"neighborjoining"method."The"results"showed"that"among"the"four"DNA"barcodes，"matK"sequencing"was"unsatisfactory."The"rbcL"sequences"of"the"two"species"were"identical."The"intraspecific"genetic"distance"of"ITS2"was"0.000"7，"while"its"interspecific"genetic"distance"was"0.009"6."The"trnHpsbA"sequence"accurately"identified"Ae.tauschii"and"Ae.cylindrica，"showing"15"different"interspecific"loci"with"a"genetic"distance"of"0.005"1，"and"no"intraspecific"differences."The"neighborjoining"tree"had"a"frequency"of"96.0%."In"specificity"testing，"both"Ae.tauschii"and"Ae.cylindrica"exhibited"specific"bases，"confirming"trnHpsbA"as"the"optimal"identification"sequence."This"study"provides"a"novel"molecular"approach"for"the"rapid"and"accurate"identification"of"these"two"quarantine"weeds.

Key"words

Aegilops"tauschii;"Aegilops"cylindrica;"DNA"barcode;"trnHpsbA

節節麥Aegilops"tauschii"Coss.與圓柱山羊草Ae.cylindrica"Host.混生于麥田，嚴重影響小麥的生長［1］。我國已將節節麥和圓柱山羊草列入進境植物檢疫性有害生物名錄［2］。我國檢驗檢疫部門在進口糧谷檢疫中經常截獲節節麥和圓柱山羊草［34］，近年來，節節麥在河北、山東、山西、河南等省的危害面積迅速擴大［5］，嚴重影響我國小麥生產和貿易，造成巨大經濟損失［67］。節節麥已成為俄羅斯、美國、澳大利亞、中亞和歐洲等國的惡性雜草，且危害面積仍在不斷擴大［8］。圓柱山羊草又名具節山羊草，起源于地中海、中東，后被引入美國大平原及太平洋西北部地區，成為該地區冬小麥田的突出問題［910］。危害美國冬小麥面積超過300萬hm2，造成的平均產量損失達25%［11］。

國內圓柱山羊草的分布及危害未見報道。2016年，我們發現其在我國山東省章丘市、北京市房山區、天津市寶坻區和武清區以及河北省保定市等多個縣區有零星分布，有單一種群危害，也有與節節麥混合危害。圓柱山羊草對主控除草劑甲基二磺隆的耐藥性較節節麥強［12］，因此常規用藥情況下常常難以有效防控，這就需要對圓柱山羊草進行早期識別和精準防控，以避免其大面積擴散蔓延。節節麥和圓柱山羊草的主要區別在于穎的形態。節節麥的穎頂端截平，而圓柱山羊草穎的頂端具2齒，外側延伸成長5～20"mm的芒（圖1）。二者與小麥親緣關系近［13］，外部形態和生長習性非常相似，尤其是生長前期難以識別（圖2）。目前，尚未發現有效且準確鑒別節節麥和圓柱山羊草的方法報道。

物種鑒定是進行生物安全監管的關鍵手段和重要前提，可以幫助確定物種的身份［14］。目前SSR、ISSR、RFLP等分子標記技術廣泛應用于種質資源鑒定。DNA條形碼技術是一種新的物種鑒定技術，但目前國際上還沒有找到一個通用序列能鑒定所有植物物種［15］。為探索適合于節節麥和圓柱山羊草的DNA條形碼序列，擬使用成熟酶K編碼基因（matK）、核酮糖1，5二磷酸化/加氧酶大亞基編碼基因（rbcL）、核基因（ITS2）和葉綠體基因間隔區序列（trnHpsbA），對采自我國河北、河南、山東、陜西和北京等9個省市的52份節節麥和圓柱山羊草樣品進行分析及鑒定，以期獲得最優鑒定序列，達到僅使用1對引物即可區分節節麥和圓柱山羊草，實現對未知節節麥和圓柱山羊草樣品的快速、準確鑒定，為生產中節節麥和圓柱山羊草的鑒別和精準防控提供科學依據。

1"材料與方法

1.1"試驗材料

種子樣本材料采自河北、河南、山東、陜西和北京等9個省、自治區或直轄市，共52份（表1）。樣本均是采集自然成熟的小穗，保存于中國農業科學院植物保護研究所雜草種子庫中。經詳細的植株形態和種子特征比對，確定節節麥41份、圓柱山羊草11份。

為明確節節麥和圓柱山羊草的DNA條形碼與其他相近物種的差異，進一步檢測了最優鑒定序列的特異性。采集小麥及17種禾本科雜草作為特異性驗證材料，均為自然成熟的種子，保存在中國農業科學院植物保護研究所雜草種子庫中（表2）。

1.2"儀器

TissueLyserⅡ樣品破碎儀，北京天根生化科技有限公司;Nanodrop"One超微量分光光度計，基因有限公司;T100TM"PCR擴增儀，BioRad公司;ML204電子天平，MettleToledo公司;Eppendorf"Centrifuge"5430R離心機，Eppendorf公司;JY600C電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司;Tanon3500凝膠圖像分析系統，北京原平皓生物技術有限公司。

新型植物基因組DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司;瓊脂糖，北京艾普利幫科技有限公司;Gel"Red核酸染色劑，Biotium公司;2×TSINGKE"Master"Mix、DL"2000"Marker，北京擎科生物技術有限公司。

1.3"DNA提取及檢測

試驗材料在溫室中培養至2～3葉期取樣，稱取頂端幼嫩葉片30"mg，放入2"mL離心管中，同時加入2枚直徑3"mm鋯珠，裝入適配器中，液氮冷凍2"min，使用組織破碎儀30"Hz破碎40"s，樣品破碎至粉狀，采用新型植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA，超微量分光光度計檢測DNA濃度，根據檢測結果，將原液稀釋至工作濃度30"ng/μL。

1.4"PCR擴增及測序

參考rbcL、matK、trnHpsbA基因和ITS2序列的國際DNA條形碼通用引物進行PCR擴增、測序及分析［16］。PCR反應采用30"μL體系，其中基因組DNA"1"μL，2×TSINGKE"Master"Mix"15"μL，上、下游引物各1"μL（引物信息見表3）［17］，ddH2O"12"μL。PCR擴增程序：94℃預變性5"min;94℃變性30"s，退火溫度（表3）退火30"s，72℃延伸相應時間，35個循環;72℃延伸10"min;4℃保存。

使用1%瓊脂糖凝膠電泳分離、檢測PCR產物，條帶清晰、單一的PCR產物送北京擎科生物技術有限公司測序。為保證序列的可靠性，所有片段都進行雙向測序。

1.5"數據處理及分析

利用Vector"NTI軟件觀察序列峰圖質量，檢查、校對堿基，對序列進行剪切拼接。通過MEGA"6.0軟件，計算樣本種內和種間的Kimura"2parameter"（K2P），采用鄰接法（neighborjoining，NJ）構建系統發育樹，基于K2P距離模型及自舉檢驗法（bootstrap"method）檢驗各分支的置信值，測定1"000次循環。

2"結果與分析

2.1"序列信息及差異分析

52個樣品經4種條形碼序列區段雙向測序發現，節節麥和圓柱山羊草的rbcL序列一致，片段長度為542"bp，無核苷酸差異;matK片段長度827～898"bp，比對后長度920"bp，PCR測序結果不理想，反向引物測序結果為Poly結構，同一PCR結果雙向測序結果有差異;ITS2片段長度788"bp，存在8個核苷酸差異位點，種內平均遺傳距離0.000"7，種間平均遺傳距離0.009"6;trnHpsbA序列片段比對后長度600"bp，存在6個信息位點，有15個核苷酸差異，種內遺傳距離0，種間平均遺傳距離0.005"1。由此可見，rbcL和matK區段不適用于鑒定節節麥與圓柱山羊草。ITS2因存在種內差異，在鑒定過程中較為復雜，故不是最佳選擇。trnHpsbA區段種內無差異，種間有差異，可能為節節麥和圓柱山羊草的最優鑒定序列。

2.2"節節麥與圓柱山羊草的trnHpsbA鑒定

節節麥片段長度597"bp，GC含量36.35%，圓柱山羊草片段長度591"bp，GC含量36.04%。二者之間有15個差異位點，分別是551位圓柱山羊草有9個堿基（GTCTTTTCT）的缺失;490位有1個堿基（A）的插入，157位有2個堿基（AA）的插入;63（G/T）、501（A/G）和506（C/A）位各有1個堿基差異（圖3）。

為確定trnHpsbA序列在節節麥與圓柱山羊草之間的鑒定能力，本研究采用鄰接法構建了NJ樹（圖4）。分析顯示，節節麥與圓柱山羊草親緣關系極為相近，NJ樹支持率為96.0%，二者種內樣本分別聚為一支，表現出單系統性，彼此能夠明顯區分。

2.3"特異性驗證

選取小麥及17種禾本科雜草對trnHpsbA條形碼區段進行特異性驗證。結果表明，trnHpsbA序列片段長度在563～593"bp之間，其中無芒雀麥最短（563"bp），小麥和節節麥最長（593"bp），比對后序列總長度為599"bp。序列GC含量在34.43%～37.70%之間，其中早熟禾最低（34.43%），虎尾草、狼尾草和馬唐均為37.70%。節節麥第48位存在特異性堿基G，其他17份材料堿基相同（T）;圓柱山羊草第475位存在特異性堿基A插入，其他物種缺失（-）;圓柱山羊草第486位特異性堿基為G，無芒雀麥缺失（-），其他16份材料堿基（T）相同，證明trnHpsbA區段在供試材料中存在特異性，可用于鑒別節節麥和圓柱山羊草。

通過MEGA"6.0軟件計算遺傳距離，節節麥與其他17份材料的遺傳距離為0.003"6～0.056"2，圓柱山羊草與其他17份材料的遺傳距離為0.002"5～0.052"4。應用鄰接法構建系統發育樹，發現節節麥和圓柱山羊草與其他16份材料均存在差異（圖5）。其中節節麥和圓柱山羊草聚為同一類群，與小麥和無芒雀麥類群親緣關系較近，但也較易區分;野燕麥、看麥娘、日本看麥娘、大穗看麥娘、早熟禾、菵草、鬼蠟燭和硬草均聚于同一類群，與節節麥和圓柱山羊草類群親緣關系較遠;牛筋草、虎尾草、馬唐、糠稷、狗尾草、狼尾草所在的類群與節節麥和圓柱山羊草類群的親緣關系最遠。上述結果表明，trnHpsbA區段能將節節麥與圓柱山羊草分開，并且與其他禾本科雜草也存在顯著差異，具有很強的特異性。

3"討論

近年來，SSR、ISSR和RFLP等分子標記技術廣泛應用于對節節麥的鑒定及遺傳背景分析。蘇亞蕊等［18］選用32對SSR引物，對不同來源的147份節節麥進行遺傳多樣性分析，結果顯示中東地區的節節麥遺傳多樣性高于中國黃河流域的節節麥。李玉閣等［19］利用9個ISSR引物對75份節節麥的遺傳多樣性進行分析，認為中國的節節麥具有較高的遺傳變異，并篩選到5個具有獨特遺傳變異的黃河流域節節麥種群。郜曉峰等［20］以762份中國節節麥資源作為試驗材料，利用28對SSR引物共檢測出62個等位變異，結果顯示節節麥的遺傳變異較小，許多材料DNA片段的多態性表現一致，新疆節節麥有較為豐富的遺傳多樣性。此外，伏建國等［21］研究了一種PCRRFLP分子鑒定方法，能夠快速、準確地將檢疫性山羊草屬雜草與非檢疫性種類區分開來，可以從分子水平上快速、準確地鑒定出山羊草屬檢疫性雜草。分子標記能夠直接反映基因組DNA間的差異，但物種間通用性不如DNA條形碼。

DNA條形碼是一段短的、標準化的DNA序列，DNA條形碼技術通過對DNA條形碼序列分析實現物種的有效鑒定，是近年來生物學研究的熱點領域，也是生物學發展最迅速的方向之一［22］。DNA條形碼技術鑒定準確率高、重復性好，且不受環境、物種等因素限制，方法通用性強，為物種鑒定和新種發現提供了方便快捷的手段和分子依據［23］。國際生命條形碼聯盟植物工作組（CBOL"Plant"Working"Group）推薦matK和rbcL組合作為陸地植物的核心DNA條形碼［24］。在第三屆國際生命條形碼大會上，ITS2和trnHpsbA又被推薦作為植物條形碼的輔助條形碼。

用于DNA條形碼研究的材料，最好采自不同地域和居群，應盡可能地覆蓋物種的整個分布區［25］。本研究所用的節節麥材料來源于河北、山東、山西、河南、重慶、陜西、新疆、內蒙古和江蘇等省，是節節麥和圓柱山羊草的大面積典型發生區，可以最大限度地覆蓋二者的遺傳變異范圍，具有較好的代表性。

選取的DNA條形碼序列不同，鑒定效率也有很大差別。作為DNA條形碼鑒定的目標基因區段，應具備較高的物種間多態性和物種內穩定性，從而在序列比對中表現出較強的物種區分能力。蘇杰天等［16］利用4個DNA條形碼候選序列（rbcL、matK、trnHpsbA和ITS2）對13份大穗看麥娘和10份日本看麥娘葉片材料進行鑒定，發現ITS2序列無種內差異，種間平均遺傳距離大于rbcL，顯示較高的種間多態性和特異性，適宜用于大穗看麥娘和日本看麥娘的準確鑒定。張毅笑等［26］利用rbcL、matK、ITS2序列對采自我國向日葵主產區的58份彎管列當樣品進行鑒定，發現3個DNA條形碼序列中僅ITS2片段鑒定結果理想，將供試樣品聚為3類，分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。因此，選擇最為有效的DNA條形碼序列進行物種鑒定尤為關鍵。本研究中節節麥與圓柱山羊草的rbcL序列完全一致，不具備物種間多態性，無法區分這兩種檢疫性雜草;而trnHpsbA序列具有較高的種間多態性和種內穩定性，在序列比對中表現出極強的物種區分能力，鑒定結果準確性高和特異性強。

4"結論

通過對節節麥和圓柱山羊草DNA條形碼區段的序列信息、差異位點和NJ樹分析，確定trnHpsbA為最優鑒定區段，可用來準確鑒定節節麥和圓柱山羊草，特異性檢測進一步證實trnHpsbA區段鑒定具有準確性和特異性。本研究為準確鑒定節節麥和圓柱山羊草提供了新的分子檢測技術，可用于相關種子、苗期樣本或破碎組織的快速、準確鑒定。

參考文獻

［1］"袁美麗，"王寧."節節麥密度對小麥生長發育與競爭能力的影響［J］."貴州農業科學，"2022，"50（11）："5763.

［2］"朱崧琪，"梁柱偉，"汪紹文."《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》更新項目簡介［J］."中國海關，"2021（7）："54.

［3］"石潔."重慶首次截獲具節山羊草［J］."中國檢驗檢疫，"2016（2）："13.

［4］"武目濤，"趙菊鵬，"陳曉玲，"等."廣東口岸入境糧谷截獲有害生物分析及建議措施［J］."雜草學報，"2016，"34（2）："3841.

［5］"張朝賢，"李香菊，"黃紅娟，"等."警惕麥田惡性雜草節節麥蔓延危害［J］."植物保護學報，"2007，"34（1）："103106.

［6］"房鋒，"高興祥，"魏守輝，"等."麥田惡性雜草節節麥在中國的發生發展［J］."草業學報，"2015，"24（2）："194201.

［7］"于海燕，"李香菊."節節麥在我國的分布及其研究概況［J］."雜草學報，"2018，"36（1）："17.

［8］"BAKHSHI"B，"AGHAEI"M"J，"ZARIFI"E，"et"al."Distribution"and"characterization"of"Aegilops"cylindrica"Host."from"Iran"［J］."Bangladesh"Journal"of"Plant"Taxonomy，"2019，"26（2）："183195.

［9］"BRADY"F"K，"DREW"J"L，"PHILLIP"W"S，"et"al."Wheat"plant"density"influences"jointed"goatgrass"（Aegilops"cylindrica）"competitiveness"［J］."Weed"Technology，"2002，"16（1）："102108.

［10］YOUNG"F"L，"BALL"D"A，"THILL"D"C，"et"al."Integrated"weed"management"systems"identified"for"jointed"goatgrass"（Aegilops"cylindrica）"in"the"Pacific"Northwest"［J］."Weed"Technology，"2010，"24（4）："430439.

［11］ANDERSON"R"L."Jointed"goatgrass"（Aegilops"cylindrica）"ecology"and"interference"in"winter"wheat"［J］."Weed"Science，"1993，"41（3）："388393.

［12］吳仁海，"徐洪樂，"孫蘭蘭，"等."甲基二磺隆與唑啉草酯混用對麥田節節麥和多花黑麥草的防治效果［J］."河南農業科學，"2022，"51（6）："103110.

［13］GOGNIASHVILI"M，"JINJIKHADZE"T，"MAISAIA"I，"et"al."Complete"chloroplast"genomes"of"Aegilops"tauschii"Coss."and"Ae.cylindrica"Host."sheds"light"on"plasmon"D"evolution"［J］."Current"Genetics，"2016，"62（4）："18.

［14］宋云，"李鵬舉，"池秀蓮，"等."物種鑒定在市場生物安全監管中的應用［J］."質量安全與檢驗檢測，"2023，"33（3）："5759.

［15］方振名，"趙仕花，"盧海嘯，"等."夾竹桃科DNA條形碼的初步篩選［J］."中華中醫藥學刊，"2022，"40（1）："9396.

［16］蘇杰天，"姜翠蘭，"黃兆峰，"等."大穗看麥娘與日本看麥娘的DNA條形碼鑒定［J］."植物保護，"2021，"47（3）："170176.

［17］高連明，"劉杰，"蔡杰，"等."關于植物DNA條形碼研究技術規范［J］."植物分類與資源學報，"2012，"34（6）："592606.

［18］蘇亞蕊，"張大樂，"徐守明，"等."粗山羊草居群間遺傳分化及多樣性的SSR分析［J］."生態學報，"2010，"30（4）："969975.

［19］李玉閣，"蘇亞中，"張大樂，"等."中國節節麥基于ISSR標記的遺傳多樣性分析［J］."麥類作物學報，"2017，"37（1）："3039.