草莓白化伴隨病毒RTLAMP檢測方法的建立

摘要

草莓白化伴隨病毒（strawberry"pallidosisassociated"virus，SPaV）能引起草莓白化病，與其他病毒復合侵染后會加重癥狀。本研究建立了SPaV的反轉錄環介導等溫擴增方法（reverse"transcriptionloopmediated"isothermal"amplification，"RTLAMP），對反應體系的各條件進行評估優化后，檢測了RTLAMP的特異性和靈敏度，且對田間樣品進行了測試。結果表明，優化后的反應體系包含2.5"μL"10×Isothermal"Amplification"Buffer、6"mmol/L"Mg2+、1"mmol/L"dNTPs、1"μmol/L"SPaVFIP和SPaVBIP，0.1"μmol/L"SPaVF3和SPaVB3，0.3"μmol/L"SPaVLB，0.4"mol/L"Betaine，0.256"U/μL"WarmStart"Bst"2.0"DNA"Polymerase，0.12"U/μL"WarmStart"RTx"Reverse"Transcriptase，1"μL"RNA，反應條件為61℃恒溫孵育40"min。采用優化后的反應體系，在特異性檢測中，只有攜帶了病毒SPaV的樣品才能發生陽性擴增。靈敏度測試中，RTLAMP比RTPCR靈敏度高10倍。田間應用中，RTLAMP和RTPCR檢測結果一致。本研究建立的SPaV"RTLAMP檢測方法操作簡便、快速、特異，可供實驗室及生產實踐中應用，助力脫毒種苗的鑒定和田間病毒病調查。

關鍵詞

草莓白化伴隨病毒;"反轉錄環介導等溫擴增;"可視化;"快速檢測

中圖分類號：

S"436.684

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2024172

Establishment"of"RTLAMP"detection"method"for"strawberry"pallidosisassociated"virus

WANG"Yong，"ZENG"Xiangguo，"XIAO"Guilin，"WEN"Xin，"ZHOU"Xinxin，"DENG"Jiangli，"HAN"Yongchao*

（Institute"of"Industrial"Crops，"Hubei"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Wuhan"430064，"China）

Abstract

Strawberry"pallidosisassociated"virus"（SPaV）"can"cause"strawberry"pallidosis"disease，"and"the"symptoms"will"worse"when"SPaV"coinfects"with"other"viruses."This"study"established"a"reverse"transcriptionloopmediated"isothermal"amplification"（RTLAMP）"for"SPaV"detection."After"evaluating"and"optimizing"the"conditions"of"the"reaction"system，"the"specificity"and"sensitivity"of"this"RTLAMP"procedure"were"mensurated"and"field"samples"were"tested."The"results"showed"that"the"optimized"reaction"system"contained"2.5"μL"10×Isothermal"Amplification"Buffer，"6"mmol/L"Mg2+，"1"mmol/L"dNTPs，"1"μmol/L"SPaVFIP"and"SPaVBIP，"0.1"μmol/L"SPaVF3"and"SPaVB3，"0.3"μmol/L"SPaVLB，"0.4"mol/L"Betaine，"0.256"U/μL"WarmStart"Bst"2.0"DNA"Polymerase，"0.12"U/μL"WarmStart"RTx"Reverse"Transcriptase，"1"μL"RNA，and"incubated"at"61℃"for"40"min."Only"the"sample"containing"the"SPaV"could"be"positively"amplified"by"the"optimized"reaction"system."The"sensitivity"of"this"RTLAMP"was"10"times"higher"than"that"of"RTPCR"detection."In"the"field"application，"the"RTLAMP"detection"result"was"consistent"with"RTPCR."The"RTLAMP"method"developed"for"SPaV"detection"in"this"study"is"simple，"rapid"and"specific，"and"can"be"used"in"laboratory"and"field"to"identify"virusfree"seedlings"and"investigate"virus"diseases.

Key"words

strawberry"pallidosisassociated"virus;"RTLAMP;"visualization;"rapid"detection

草莓富含營養和大量活性物質，有益于人體健康［1］。因其美味可口和保健功效而深受消費者喜愛，其種植面積不斷增大，2020年我國草莓種植面積相比于2019年增加了556"hm2，達到12.72萬"hm2［2］。但是，在草莓種植過程中，病毒病發生普遍，發生率可高達80.2%，引起植株長勢衰退、果實畸形和減產等，造成嚴重的經濟損失［3］。草莓白化伴隨病毒（strawberry"pallidosisassociated"virus，SPaV）隸屬長線形病毒科Closteroviridae毛狀病毒屬Crinivirus，其基因組由長度分別為8"067"nt和7"979"nt的2條正義單鏈RNA組成［4］。該病毒于2004年首次被報道與草莓白化病相關，能加重被草莓輕型黃邊病毒（strawberry"mild"yellow"edge"virus，"SMYEV）和草莓斑駁病毒（strawberry"mottle"virus，"SMoV）侵染的植株病毒病癥狀［5］。2017年，我國福建地區首次發現了SPaV［6］。2018年，在河南局部地區也檢測到草莓中的SPaV［7］。本實驗室在2023年從湖北地區草莓中也檢測到SPaV［8］。高效快速的病毒檢測技術是脫毒種苗病毒鑒定的基礎，能夠為草莓無病毒種苗生產與應用提供技術支撐。目前，病毒SPaV的檢測方法主要包括傳統的RTPCR、高通量測序［9］，以及基于PCR的改進方法［10］等。其中，高通量測序技術涉及樣品制備及后續復雜的數據分析和驗證;RTPCR方法要用到PCR儀，結果觀測需要電泳儀和紫外成像儀器。這些方法耗時久，操作復雜，需要使用昂貴的儀器，且結果不能肉眼直觀判定，不適用于田間生產中快速鑒定。環介導等溫擴增技術（loopmediated"isothermal"amplification，"LAMP）自2000年被發明后［11］，因擴增效率高、特異性好、靈敏度高，已被廣泛應用到多種病原物的檢測中［1213］。該技術針對的核酸模板為DNA，無法直接用于RNA病毒的檢測。為適用于RNA模板的擴增，在LAMP體系中加入反轉錄酶即可實現RNA病毒的擴增檢測，即反轉錄環介導等溫擴增技術（reverse"transcriptionloopmediated"isothermal"amplification，"RTLAMP）［14］。在草莓的病毒檢測中，基因組為DNA的草莓鑲脈病毒（strawberry"vein"banding"virus，"SVBV），基因組為RNA的草莓斑駁病毒和草莓輕型黃邊病毒的LAMP/RTLAMP檢測方法已經建立［1517］。目前，病毒SPaV的RTLAMP檢測方法尚未見報道。本研究對反應體系的各條件進行評估，以建立并優化SPaV"RTLAMP檢測體系，為該病毒的田間診斷和預防提供低成本、快速且高效的技術支持。

1"材料與方法

1.1"材料

試驗中所用的草莓葉片均采自湖北省農業科學院武漢南湖草莓基地，經RTPCR檢測后，將分別含有病毒SPaV、SVBV、SMYEV、SMoV、草莓毛形病毒3（strawberry"crinivirus"3，SCrV3）和草莓毛形病毒4（strawberry"crinivirus"4，"SCrV4）的RNA樣品置于-80℃冰箱保存備用。

植物總RNA提取試劑盒和DNA回收試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司;cDNA合成試劑盒、DNA"Marker、大腸桿菌DH5α感受態購自吐露港生物科技有限公司;"2×Es"Taq"MasterMix購自康為世紀生物科技股份有限公司;10×Isothermal"Amplification"Buffer、Bst"2.0"WarmStart"DNA"Polymerase、WarmStart"RTx"Reverse"Transcriptase、MgSO4購自New"England"BioLabs（NEB，北京）公司;Betaine購自上海源葉生物科技有限公司;dNTPs和SYBR"Green"I染料購自北京索萊寶科技有限公司;TA克隆載體pMD19及DNA連接試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2"方法

1.2.1"引物設計與合成

實驗室前期通過高通量測序從草莓樣品中檢測到病毒SPaV，針對該病毒的外殼蛋白編碼區設計了檢測引物SPaVF和SPaVR用于RTPCR檢測，引物FaActinF和FaActinR用于擴增草莓Actin基因，作為內參引物檢測反轉錄是否成功。將引物SPaVF和SPaVR擴增產物進行測序后與GenBank發布的SPaV序列（登錄號分別為OK04297.1、MZ328109.1、OP839188.1、NC_005896.2和MN747002.1）通過DNAMAN進行同源性分析，將其中的保守區作為模板，使用NEB公司在線LAMP引物設計軟件（https：∥lamp.neb.com/#！/），根據各參數質量評估結果，選擇綜合質量最佳的一組引物用于SPaV的RTLAMP檢測（表1）。本試驗中使用的引物均由武漢奧科生物技術有限公司合成。

1.2.2"總RNA提取

總RNA均提取自草莓葉片組織，具體操作步驟參照總RNA提取試劑盒（R4151）說明書。提取的總RNA均保存于-80℃冰箱備用。

1.2.3"RTPCR檢測

反轉錄具體操作如下：4"μL"5×Allinone"RT"buffer、1"μL"Allinone"Enzyme"Mix、1"μL總RNA，加入ddH2O補至20"μL后，于25℃反應5"min，然后60℃反應15"min，最后85℃處理5"s。合成的cDNA置于-20℃保存備用。

PCR檢測體系為5"μL"2×Es"Taq"MasterMix，0.4"μmol/L引物SPaVF和SPaVR，1"μL模板cDNA，加入ddH2O補至10"μL，最后在反應混合物上加入20"μL滅菌礦物油防止擴增反應過程體系被蒸干。擴增程序為：95℃預變性3"min;94℃變性30"s，62℃退火30"s，72℃延伸40"s，34個循環;72℃延伸5"min。取3"μL擴增產物進行電泳檢測，目標擴增條帶大小為1"068"bp。通過擴增Actin檢測反轉錄效率。

1.2.4"SPaV"RTLAMP擴增條件優化

初始的SPaV"RTLAMP擴增體系為：2.5"μL"10×Isothermal"Amplification"Buffer，8"mmol/L"MgSO4，1.4"mmol/L"dNTPs，1.6"μmol/L"SPaVFIP和SPaVBIP，0.2"μmol/L"SPaVF3和SPaVB3，0.4"μmol/L"SPaVLB，0.4"mol/L"Betaine，1"μL"Bst"2.0"WarmStart"DNA"Polymerase（8"U/μL），0.2"μL"WarmStart"RTx"Reverse"Transcriptase（15"U/μL），1"μL模板RNA，加入ddH2O補至25"μL，最后在反應混合物上加入20"μL滅菌礦物油，以防止反應中和開蓋過程氣溶膠污染。反應程序為63℃孵育60"min，80℃"20"min。

RTLAMP檢測從恒溫孵育溫度、時間、引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度、Betaine濃度、酶濃度等條件進行評估優化。為觀察反應產物的顏色變化，反應前，在反應管蓋內側提前加入3"μL稀釋10倍的SYBR"Green"I核酸染料，反應結束后通過離心混勻檢測顏色變化;同時，取0.5"μL產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外成像檢測。陽性樣品電泳結果顯示瀑布狀條帶［11］，同時產物顏色呈綠色［1819］，陰性樣品電泳無瀑布狀條帶，且產物顏色為橙色。

1.2.5"RTLAMP檢測體系的特異性和靈敏度測定

根據實驗室已有材料中草莓病毒的種類，選用分別含有SPaV、SVBV、SMoV、SMYEV、SCrV3和SCrV4的RNA作為模板進行RTLAMP擴增。通過瓊脂糖凝膠電泳和染色法同步檢測。由于RTLAMP擴增的外引物SPaVF3和SPaVB3的預期擴增片段大小為225"bp，因此，RTLAMP擴增產物電泳后，切取凝膠上大小約為225"bp的條帶進行TA克隆測序分析，確定檢測體系的特異性。

為檢測RTLAMP反應體系的靈敏度，10倍梯度逐級稀釋含有SPaV的RNA，獲得RNA原液（100）～10-7共8個不同濃度的RNA模板。對這些RNA同時進行RTLAMP和RTPCR擴增檢測，比較2種檢測方法的靈敏度。

1.2.6"RTLAMP方法的田間應用

于生產基地隨機采集14份草莓的葉片組織，提取總RNA后，分別用RTPCR方法和RTLAMP方法檢測病毒SPaV。RTPCR檢測結果通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，RTLAMP檢測結果通過SYBR"Green"I染色鑒定。

2"結果與分析

2.1"SPaV"RTLAMP擴增條件優化

2.1.1"反應溫度的選擇

以1℃為梯度，設置了60～66℃共7個恒溫反應溫度。保持其他條件不變，不同反應溫度下，同時進行不加RNA模板（NTC）和含有SPaV的RNA模板的RTLAMP擴增。結果顯示，NTC反應在各溫度下均無瀑布狀條帶，且染色后仍為橙色;而加入含有SPaV的RNA后，反應溫度在61～65℃時，電泳結果均呈瀑布狀條帶，且產物都被SYBR"Green"I染色成綠色，無明顯差異（圖1）。從節省能源的角度出發，選擇恒溫擴增溫度為61℃。

2.1.2"反應時間的選擇

設置10、20、30、40、50、60"min共6個不同反應時間，結果顯示反應時間在40～60"min產物均可見瀑布狀條帶，反應時間為40"min時，產物電泳條帶清晰且SYBR"Green"I染色后呈明顯的綠色（圖2），從節省時間和保證明顯擴增的角度，選擇恒溫反應時間為40"min。

2.1.3"反應體系中引物終濃度選擇

設置RTLAMP反應體系中內引物SPaVFIP/BIP終濃度為1.0、1.2、1.4、1.6、1.8"μmol/L，結果顯示這5個濃度下，擴增產物均能產生瀑布狀條帶，經SYBR"Green"I染色后均呈明顯的綠色（圖3），說明這些濃度均適合反應。從節省原料的角度考慮，選擇SPaVFIP/BIP的反應終濃度為1.0"μmol/L。

對外引物SPaVF3/B3設置0.1、0.15、0.2、0.25、0.3"μmol/L等5個反應終濃度，結果顯示不同濃度下反應產物均能產生瀑布狀條帶，經SYBR"Green"I染色后均呈明顯的綠色（圖4），從節省原料角度選擇SPaVF3/B3的反應終濃度為0.1"μmol/L。

對環引物SPaVLB設置0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5"μmol/L等6個反應終濃度，結果顯示在終濃度為0.1～0.5"μmol/L時，電泳檢測均可見瀑布狀條帶，對應的SYBR"Green"I染色均呈現明顯的綠色，其中，0.3～0.5"μmol/L時，條帶更加明亮（圖5），綜

合考量節省引物用量，選擇SPaVLB的反應終濃度為0.3"μmol/L。

2.1.4"Mg2+反應終濃度選擇

設置Mg2+反應終濃度為2、4、6、8、10"mmol/L，檢測結果顯示在6"mmol/L和8"mmol/L"2個終濃度下，反應產物有瀑布狀條帶，且經SYBR"Green"I染色后呈現綠色，而終濃度為6"mmol/L時，條帶更加明亮（圖6），因此，選擇Mg2+反應終濃度為6"mmol/L。

2.1.5"dNTPs終濃度選擇

對反應體系中dNTPs終濃度設置0、0.5、1.0、1.4、2.0"mmol/L等5個不同處理，檢測擴增產物顯示，當dNTPs終濃度為1.0"mmol/L時，其產物電泳條帶最明亮，且染色后呈現綠色最為明顯（圖7），因此，確定dNTPs的反應終濃度為1.0"mmol/L。

2.1.6"Betaine反應終濃度選擇

Betaine的加入可以抑制假陽性擴增［20］，在RTLAMP反應體系中加入Betaine，使其終濃度分別為0.4、0.8、1.0、1.2"mol/L和1.4"mol/L。結果顯示，在終濃度為0.4"mol/L時，反應產物的條帶最亮，且經SYBR"Green"I染色為綠色最為明顯（圖8），因此確定反應體系中加入的Betaine終濃度為0.4"mol/L。

2.1.7"反應體系中酶濃度的選擇

對反應體系中的反轉錄酶終濃度設置0、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30"U/μL等6個不同處理，反應結果顯示，在終濃度為0.12"U/μL和0.18"U/μL時，電泳檢測條帶最亮，且染色結果為明顯的綠色（圖9），綜合考量節約成本，選擇反轉錄酶的終濃度為0.12"U/μL。

對反應體系中Bst"2.0的終濃度設置0、0.064、0.128、0.192"U/μL和0.256"U/μL等5個不同處理。檢測結果顯示在終濃度為0.192"U/μL和0.256"U/μL時，電泳條帶最明亮清晰，且染色為明顯的綠色（圖10）。由于后續試驗中，當選用0.192"U/μL時，出現無擴增情況，考慮到擴增的穩定性，選擇Bst"2.0的反應終濃度為0.256"U/μL。

經過以上對RTLAMP檢測體系的優化，確定優化后體系為2.5"μL"10×Isothermal"Amplification"Buffer、6"mmol/L"Mg2+、1.0"mmol/L"dNTPs、1.0"μmol/L"SPaVFIP和SPaVBIP，0.1"μmol/L"SPaVF3和SPaVB3，0.3"μmol/L"SPaVLB，0.4"mol/L"Betaine，0.256"U/μL"WarmStart"Bst"2.0"DNA"Polymerase，0.12"U/μL"WarmStart"RTx"Reverse"Transcriptase，1"μL"RNA，加ddH2O補足25"μL。61℃反應40"min。

2.2"特異性檢測

使用優化好的SPaV"RTLAMP檢測體系，對分別含有SPaV、SVBV、SMoV、SMYEV、SCrV3和SCrV4的RNA樣品進行擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳

和SYBR"Green"I染色法檢測，發現只有攜帶了病毒SPaV的樣品出現瀑布狀條帶，且產物被染成綠色（圖11）。切取大小約為225"bp的條帶通過TA克隆，選取4個不同的單克隆測序，結果經BLASTn比對均為病毒SPaV。說明該檢測體系對SPaV具有良好的特異性。

2.3"靈敏度檢測

將RNA原液（228.8"ng/μL）進行梯度稀釋后，RTPCR檢測結果顯示，只有原液（228.8"ng/μL）才能檢測到SPaV病毒（圖12a），而RTLAMP檢測結果顯示，以原液及稀釋10倍后的RNA作為模板時，電泳檢測出現瀑布狀條帶，且SYBR"Green"I染色后也呈現明顯的綠色（圖12b）。因此，RTLAMP檢測草莓葉片樣品中的SPaV比RTPCR檢測的靈敏度高10倍。

2.4"RTLAMP方法的田間應用

利用優化的RTLAMP檢測體系及常規RTPCR方法對生產基地的14份樣品進行檢測，其中RTPCR檢測到4份樣品能擴增到目標核酸片段大小的條帶，RTLAMP檢測中對應的4份樣品被SYBR"Green"I染色為明顯的綠色（圖13）。結果顯示這2種檢測方法結果一致，說明優化的SPaV"RTLAMP檢測方法適用于草莓田間樣品的可視化快速檢測。

3"結論與討論

本研究在建立了SPaV的RTLAMP初始檢測體系后，對檢測體系中的各個條件進行了優化，最終獲得了穩定靈敏的檢測體系。各條件優化過程中的檢測均采用電泳和SYBR"Green"I染色法同步進行。結果顯示，電泳檢測中條帶越明亮，染色法呈現越明顯的綠色，說明SYBR"Green"I染色可替代電泳檢測法，節省擴增結果判定的時間，進一步提高RTLAMP檢測效率。

RTLAMP檢測體系的靈敏度因不同病毒存在差異，其中，陳柳等建立的草莓輕型黃邊病毒的RTLAMP方法比RTPCR檢測的靈敏度至少高100倍［17］，王鳳麗等報道的山藥潛隱病毒（yam"latent"virus，YLV）的RTLAMP檢測靈敏度是RTPCR檢測的100倍［21］，談靜惠等報道的葡萄扇葉病毒（grapevine"fanleaf"virus，GFLV）的RTLAMP檢測方法比RTPCR檢測靈敏度高10倍［22］。本研究中，草莓白化伴隨病毒的RTLAMP檢測方法比傳統RTPCR方法靈敏度只提高10倍，這可能是由于試驗中各條件的選擇加入了成本因素的考量所致。關于成本節省與效率提高之間的綜合評估還需進一步探究。實際應用中可以適當調整體系以達到更好的檢測效果。本研究中并未純化出病毒SPaV的基因組RNA進行靈敏度測試，使用的是植物總RNA，因此，無法確定優化的RTLAMP檢測體系檢測SPaV的最低拷貝數。

RTLAMP檢測技術涉及4～6條引物，具有較強的特異性。但是，由于該檢測方法通常在1"h內能夠擴增109～1010倍，在開蓋檢測過程中極容易出現試驗環境的氣溶膠污染，而導致后續相同病毒RTLAMP檢測的假陽性發生。為避免開蓋造成的氣溶膠污染，本研究采用滅菌礦物油液封反應液，在反應前將染料預先加在管蓋內壁，以及在空曠通風處進行電泳檢測等方法，可以有效避免氣溶膠污染。

由于RTLAMP檢測過程中，RNA提取步驟通常會耗費近1"h的時間，為減少模板制備時間，尹新穎等開發了免核酸提取的RTLAMP法檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber"green"mottle"mosaic"virus，CGMMV）［23］。本研究也嘗試簡化RNA提取

步驟，具體操作為直接取攜帶病毒SPaV的葉片組織研磨液作為模板加入RTLAMP檢測體系進行擴增，體系中預先加入了RNase抑制劑，結果未發生陽性擴增，可能是由于加入的模板中病毒含量過低，或者粗提液中抑制擴增的物質過多導致RTLAMP擴增失敗。后續研究可以嘗試在本研究基礎上優化出免RNA提取的一步法RTLAMP檢測體系，進一步提高檢測效率，從而更好地將SPaV"RTLAMP檢測技術推廣應用到基層生產中，助力草莓無病毒種苗篩選，促進草莓產業健康發展。

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