蘋果樹腐爛病生防菌的篩選及其防治效果

摘要

蘋果樹腐爛病由黑腐皮殼菌Valsa"mali引起，是蘋果生產中威脅最大的病害之一。為了篩選蘋果樹腐爛病的生防菌，本研究對田間分離的473株細菌進行了室內拮抗評價和田間防控效果評價，并對防控效果較好的菌株進行了鑒定。結果表明，通過室內拮抗菌的篩選，獲得了10株對蘋果樹腐爛病菌V.mali具有拮抗作用的生防細菌;對10株菌進行田間防治效果評價，結果表明菌株A18589對蘋果樹腐爛病具有顯著的防治效果，且該菌株對蘋果其他病害也具有顯著的室內抑菌效果。經形態學、生理生化特性以及多位點序列分析，菌株A18589被鑒定為貝萊斯芽胞桿菌Bacillus"velezensis。綜上所述，本研究篩選獲得的生防菌A18589對蘋果樹腐爛病具有相對較好的防治效果，具有替代化學藥劑的潛在應用價值。

關鍵詞

蘋果樹腐爛病;"黑腐皮殼菌;"貝萊斯芽胞桿菌;"生物防治

中圖分類號：

S"436.611.11

文獻標識碼："B

DOI："10.16688/j.zwbh.2023609

Screening"of"biocontrol"bacteria"against"apple"Valsa"canker"and"their"control"effect

GUO"Jiachen，"DONG"Yanhong，"SHI"Zhaoyang，"LI"Bo，"DAI"Pengbo，"WANG"Yanan，"HU"Tongle，CAO"Keqiang，"WANG"Shutong*，"MENG"Xianglong*

（College"of"Plant"Protection，"Hebei"Agricultural"University，"Baoding"071001，"China）

Abstract

Apple"Valsa"canker，"caused"by"Valsa"mali，"is"one"of"the"most"serious"diseases"in"apple"production."In"order"to"screen"biocontrol"bacteria"against"apple"Valsa"canker，"473"strains"of"bacteria"isolated"from"the"field"were"evaluated"for"indoor"antagonism"and"field"prevention"and"control"effects，"and"the"strains"with"better"prevention"and"control"effects"were"identified."The"results"showed"that"through"the"screening"of"antagonistic"bacteria"in"the"laboratory，"10"strains"of"biocontrol"bacteria"with"antagonistic"effect"on"V.mali"were"obtained."The"field"control"effect"of"10"strains"was"evaluated."The"results"showed"that"the"strain"A18589"had"significant"control"effect"on"apple"tree"rot"disease，"which"also"had"significant"indoor"inhibitory"effect"on"other"apple"diseases."The"strain"A18589"was"identified"as"Bacillus"velezensis"by"morphological，"physiological"and"biochemical"characteristics"and"multilocus"sequence"analysis"（MLSA）."In"summary，"the"biocontrol"bacterium"A18589"has"a"relatively"good"control"effect"on"apple"tree"canker，"and"has"potential"application"value"as"an"alternative"to"chemical"agents.

Key"words

apple"Valsa"canker;"Valsa"mali;"Bacillus"velezensis;"biological"control

蘋果樹腐爛病是蘋果生產上最嚴重的病害之一，嚴重威脅我國蘋果產業的健康發展［1］。該病害由黑腐皮殼菌Valsa"mali"Miyabe"et"Yamada引發，孢子通過傷口侵入并寄生于果樹主干、側枝、小枝和某些輔養枝的樹皮內，侵入后可以潛伏侵染達2年。當條件適合時可引發樹皮腐爛，病害嚴重時甚至會侵害果實［23］。蘋果樹腐爛病菌的孢子可以在果樹的各種類型的傷口處定殖，其侵染過程不產生附著胞，因此主要依賴外泌細胞壁降解酶輔助病原物侵入植物組織［45］。

當前，蘋果樹腐爛病發生后，通常采用將病斑刮除并結合涂抹化學藥劑的方式進行防控。然而，頻繁和長時間使用化學藥劑可能導致農藥殘留，進而引發環境污染問題。此外，長期單一的使用殺菌劑，存在使病原體產生耐藥性的潛在風險［6］。因此，應研究具備高效性、安全性、低毒性、抗藥性低、兼具防治綜合性及促生特性的生物防治策略，為替代傳統化學防治手段提供理想途徑［7］。

利用菌株對病原菌的拮抗性篩選生防菌是目前生防菌篩選最常用的方法之一。芽胞桿菌作為地球微生態環境中的優勢種群，具備提高植株抗逆性的功能，在農業實際生產中有著較為廣泛的應用［8］。研究發現，芽胞桿菌對蘋果樹腐爛病菌表現出顯著的拮抗效果［911］。具體而言，比如萎縮芽胞桿菌Bacillus"atrophaeus"XW2在室內展現出卓越的拮抗效果，且在離體枝條上能夠有效預防腐爛病的發生［12］。薛應鈺等［13］通過對菌株JPD1的離體枝條試驗發現，該菌株表現出對蘋果樹腐爛病的良好防護效果。然而，在實際田間應用時，生防菌的存活受到多種環境因素的制約，包括干燥、紫外輻射和降水等［14］。然而，多數生防菌株的篩選重視菌株在實驗室條件下對病原菌的拮抗能力，卻容易忽視其在田間的防治效果。

為了篩選出對蘋果樹腐爛病具有防控效果的菌株，本研究從發生蘋果樹腐爛病的蘋果園采集土壤，并進行生防菌的分離和篩選，對分離的菌株進行室內拮抗和田間防治效果研究，旨在獲取對蘋果樹腐爛病具有防控效果的生防菌株，為該病的生物防治提供潛在資源。

1"材料與方法

1.1"土壤細菌的分離、初篩與復篩

按照易婷等［15］的方法，使用梯度稀釋法從土樣中分離細菌。初篩：通過平板對峙法初步篩選候選生防菌［16］。

將西北農林科技大學黃麗麗老師課題組提供的菌株編號為038的蘋果樹腐爛病菌菌餅（直徑7"mm）接種于PDA培養基中央，將蘸有不同細菌菌懸液（菌懸液濃度為1×109"cfu/mL）的濾紙片（直徑為7"mm）置于病原菌菌餅上下左右3"cm處的4個方位，28℃黑暗培養7"d，每個處理3次重復。采用十字交叉法測量菌株038菌落直徑，并計算抑菌率。復篩：將菌株038的菌餅接種于PDA培養皿（直徑為90"mm）中央，兩側放置蘸有初篩效果較好的生防菌菌懸液的濾紙片（直徑為7"mm，菌懸液濃度為1×109"cfu/mL），28℃下黑暗培養。以蘸LB液體培養基的濾紙片為對照，培養7"d，每個處理重復3次。測定菌落直徑，并計算抑菌率。

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.2"發酵過濾液對病菌菌絲生長和孢子萌發的影響

復篩得到的待測生防菌在LB液體培養基中培養2"d后獲得發酵液，采用先離心后過濾的方法獲得發酵過濾液［17］。將發酵濾液配制成10%的含藥PDA平板，并將菌株038接種于含藥平板的中央，以含有10%"LB液體培養基的PDA平板作

為對照，28℃培養7"d。測定抑菌率，每處理重復3次。

制備038菌株孢子懸浮液（1×105～1×106"cfu/mL），并將孢子懸浮液、生防菌發酵濾液及2%蔗糖溶液等體積混合，以孢子懸浮液、LB液體培養基及2%蔗糖溶液等體積混合作為對照。25℃黑暗培養24"h，利用光學顯微鏡觀察并統計不同處理菌株038孢子萌發情況，每組進行3次重復。按照以下公式計算孢子萌發率和孢子萌發抑制率。

孢子萌發率=萌發的孢子數/孢子總數×100%；

孢子萌發抑制率=（對照孢子萌發率-處理孢子萌發率）/對照孢子萌發率×100%。

1.3"生防菌的離體枝條防治效果評價

使用離體枝條法［18］，評價生防菌發酵液對蘋果樹腐爛病的保護效果和治療效果。

保護效果測定：從河北農業大學實驗果園采集粗細一致的兩年生‘富士’蘋果枝條，剪取30"cm長的枝段，75%乙醇浸泡30"s，2%次氯酸鈉浸泡1"min，無菌水沖洗后涂抹液體石蠟和凡士林。使用滅菌后的打孔器在枝條中間及距離中間10"cm處的表面刮出3處圓形傷口，傷口直徑為0.7"cm，露出木質部。向傷口中滴加100"μL生防菌株發酵液（1×109"cfu/mL），用保鮮膜包裹，以3%甲基硫菌靈糊劑（威海韓孚生化藥業有限公司，125"g/m2）作為對照藥劑，以LB培養液作為空白對照。每種生防菌發酵液接種5根枝條。生防菌接種3"d后，接種菌株038菌餅（直徑7"mm），保鮮膜包裹接種后枝條，并于25℃黑暗培養。接種病原物7"d后，測量病斑長度并計算防治效果。

治療效果測定：使用相同的方法對兩年生蘋果離體枝條制造傷口，并按照上述方法先接種菌株038的菌餅（直徑7"mm），并用保鮮膜包裹后，25℃黑暗培養72"h。然后將病變組織刮除干凈后，向刮除的部位涂抹50"μL生防菌株發酵液（1×109"cfu/mL），以3%甲基硫菌靈糊劑（威海韓孚生化藥業有限公司，125"g/m2）作為對照藥劑，以LB培養液作為空白對照，每種生防菌發酵液接種5根枝條。接種生防菌14"d后，測量病斑長度并計算防治效果。

1.4"生防菌株的田間防治效果評價

通過田間試驗，評價生防菌發酵液在田間活體枝條上對蘋果樹腐爛病的保護效果和治療效果［18］。

保護效果測定：從河北農業大學實驗果園選取粗細一致的兩年生健康枝條（直徑約1.5"cm），按照前述方法，在枝條表面刮出直徑為7"mm的傷口，向傷口中滴加100"μL生防菌株發酵液（1×109"cfu/mL），用保鮮膜包裹。以3%甲基硫菌靈糊劑（125"g/m2）作為對照藥劑，以無菌水作為空白對照。每種生防菌發酵液接種5根枝條，每根枝條3個接種點。生防菌接種3"d后接種菌株038菌餅（直徑為7"mm），覆膜包裹。接種病原菌14"d后，測量病斑長度并計算防治效果。

治療效果測定：按照前述方法對果園中兩年生蘋果活體枝條制造傷口，并按照上述方法在傷口處接種菌株038菌餅（直徑為7"mm）并用保鮮膜保濕，約7"d后接種部位出現癥狀，刮凈全部變色組織，涂抹50"μL生防菌株發酵液（1×109"cfu/mL），以3%甲基硫菌靈糊劑（125"g/m2）作為藥劑對照，以無菌水作為空白對照，用保鮮膜包裹保濕。試驗處理與保護效果測定，待對照組癥狀再次全部出現后，接種3個月后測量病斑長度并統計防治效果。

1.5"生防菌膏劑的田間防治效果測定

微生物膏劑制備：混合200"g羧甲基纖維素鈉（縮寫為CMC，河南萬邦）與1"000"mL蒸餾水，沸水浴加熱攪拌至CMC完全溶解，制得糊狀膠液備用。將菌株A18589發酵液（1×109"cfu/mL）按1∶1的比例加入CMC中攪拌備用。

保護作用測定：在田間選取粗細一致的2～3年生蘋果枝條，按照前述方法刮出傷口。在傷口以及傷口外圍2"cm處涂抹生防菌膏劑，直至膏劑完全覆蓋傷口為止，以3%甲基硫菌靈糊劑（125"g/m2）作為對照藥劑，以不含有生防菌的膏劑作為對照，每種膏劑接種5根枝條。涂抹膏劑后，使用保鮮膜包裹傷口，3"d后在傷口處接種038菌餅（直徑為7"mm），并再次用保鮮膜包裹后保濕處理。接種14"d后，記錄腐爛病的發病情況，測量病斑長度并計算防治效果。

治療作用測定：按照前述方法對田間選取的蘋果兩年生枝條刮出傷口。先在傷口處接種菌株038的菌餅（直徑為7"mm），并使用保鮮膜包裹后保濕處理。接種7"d后，刮除病變組織，并按照上述方法涂抹生防菌的膏劑，以3%甲基硫菌靈糊劑（125"g/m2）作為對照藥劑，以不含有生防菌的膏劑作為對照，每種膏劑接種5根枝條。接種生防菌膏劑接種3個月后進行調查，測量病斑長度并計算防治效果。

1.6"生防菌株的抑菌譜分析

將供試的蘋果輪紋病菌Botryosphaeria"dothidea（A1653）、蘋果炭疽病菌Colletotrichum"fructicola（A22）、蘋果黑斑病菌Alternaria"alternata（P18484）、棉花絲核病菌Thanatephorus"cucumeris（C0613）、小麥赤霉病菌Fusarium"graminearum（B20903）和梨黑斑病菌Alternaria"tenuissima（BD15）"6種病原菌分別接入新鮮PDA培養基中培養3"d后，在菌落邊緣取新鮮菌餅（7"mm），并將菌餅接種于PDA培養皿左側距離邊緣30"mm處。將蘸有生防菌菌懸液的濾紙片（直徑為7"mm，菌懸液濃度為1×109"cfu/mL）置于相同PDA平板的中軸線右側距離邊緣30"mm處，28℃下黑暗培養。以LB液體培養基作為對照，培養7"d，每個處理重復3次。測定菌落直徑，并計算抑菌率。

相對抑菌率=（對照菌落擴展直徑-處理菌落擴展直徑）/對照菌落擴展直徑100%。

1.7"蘋果腐爛病菌生防菌株A18589的鑒定

篩選的生防菌株，將其劃線接種于LB固體培養基上，28℃培養24"h。記錄菌落顏色和形態，并進行革蘭氏染色。參考鄭雪晴等［18］和《常見細菌系統鑒定手冊》［19］的方法，對菌株進行生理生化指標測定，以實驗室前期分離和鑒定的菌株X2作為參考菌株［18］。

采用天根生化科技有限公司的細菌DNA提取試劑盒提取生防菌株A18589的DNA。通過16S"rDNA通用引物進行PCR擴增，隨后對PCR產物進行測序，利用MEGA"5.0軟件構建系統發育樹，進行單基因聯合系統發育分析。參照Xuan等［20］的方法，基于6個持家基因（rpoD、glpF、ilvD、ptA、tpiA、purH）的串聯序列，利用MEGA"5.0軟件使用最大似然法、TamuraNei模型進行多位點序列分析（MLSA）。

1.8"數據處理

經Microsoft"Excel"2012整理試驗數據，用SPSS"24.0軟件分析，Oneway"ANOVA方差分析，顯著性水平α=0.05。

2"結果與分析

2.1"生防菌株的分離及初篩

通過平板涂布法從土壤中分離純化獲得473株細菌菌株。平板對峙培養結果顯示，80株細菌表現出對蘋果樹腐爛病菌的拮抗作用，占分離細菌菌株的16.91%。其中，菌株A18589展現出對蘋果樹腐爛病菌最強的拮抗作用，培養3"d后即表現拮抗效果，培養至5"d時，蘋果樹腐爛病菌與A18589菌餅無接觸，培養至7"d時，對照組的蘋果樹腐爛病菌在培養皿上生長良好，而受拮抗的蘋果樹腐爛病菌則呈現近十字形生長形態（圖1）。

2.2"生防菌株的復篩效果

對初篩得到的80個菌株進行復篩，結果表明A18589、C0526等10株菌對蘋果腐爛病菌的菌絲生長具有顯著的抑制效果，其中菌株A18589和菌株C0526對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用顯著高于其他8個菌株，抑制率達86.85%和86.59%（表1）。

2.3"生防菌株發酵濾液對腐爛病菌菌絲生長和分生孢子萌發的影響

生防菌發酵濾液對腐爛病菌038菌絲生長

的抑制作用存在顯著差異，抑制率范圍為57.78%

～92.30%。其中對病原菌生長有較強抑制作用的拮抗細菌為A18589、Y27和Y30，抑制率達91.11%～92.30%。生防菌發酵過濾液對腐爛病菌038的孢子萌發具有顯著抑制作用，其中A18589菌株的抑制效果最為顯著，抑制率達72.81%，其次為菌株Y27，抑制率為59.01%，其他菌株的抑制率均低于59%（表2）。

2.4"生防菌株發酵液對離體枝條的防治效果

采用先注射發酵液后接種病原菌的方式評價10株拮抗細菌發酵液對蘋果樹腐爛病的保護效果，采用先接種病原菌后涂抹發酵液的方式評價10株拮抗細菌發酵液對蘋果樹腐爛病的治療效果。結果表明，除了Y18之外，無論是保護效果試驗還是治療效果試驗中，生防菌處理后的病斑長度均顯著低于清水對照（Plt;0.05），但是均顯著大于對照藥劑處理后的病斑長度（表3）。在所有的10株細菌中，菌株A18589、APH25、Y30與Y27的發酵液的治療效果和保護效果均在50%以上。

2.5"生防菌發酵液和膏劑對蘋果腐爛病的田間防治效果

為了進一步評價生防菌發酵液對蘋果樹腐爛病的防治效果，我們在田間使用蘋果活體枝條評價了10株生防菌發酵液對蘋果樹腐爛病的保護效果和治療效果。結果表明，在保護作用試驗中，所有的生防菌處理都顯著降低了病斑的長度，其中菌株A18589、APH25和C0526發酵液的保護效果均大于60%，在所有的生防菌中保護效果最好。在治療效果試驗中，10株生防細菌對病斑的擴展均有一定抑制效果，其中A18589和A18587發酵液的治療效果大于60%。但是，無論是治療實驗還是保護實驗，所有的生防菌發酵液處理后的病斑長度都顯著大于對照藥劑處理后的病斑長度（圖2，表4）。

為了檢測膏劑是否會影響生防菌的防治效果，我們將前期離體和田間試驗中表現最好的菌株A18589制備成膏劑，并在田間蘋果活體枝條上評價了菌株A18589膏劑的保護效果和防治效果。結果表明，在保護作用試驗中，菌株A18589膏劑可以顯著抑制病斑在蘋果活體枝條上的擴展，并且與對照藥劑相比無顯著性差異（Plt;0.05），生防菌膏劑的田間保護效果可達68.27%。而在治療效果試驗中，生防菌A18589膏劑雖然也可以顯著抑制病斑在蘋果活體枝條上的擴展，但是造成的病斑長度顯著高于對照藥劑處理后的病斑長度（Plt;0.05）（表5）。

2.6"生防菌株的抑菌譜

利用平板對峙法測定10株細菌菌株對6種常見病原菌的抑菌效果，結果顯示，菌株A18589、A18587、APH24、APH25、Y18和Y30具有廣泛的抑菌譜，對供試的6種病原菌均具有一定的拮抗效果，但對不同植物病原菌其拮抗程度不等。其中菌株A18589對蘋果黑斑病菌的抑菌效果最好，抑菌率為66.67%（表6，圖3）。

2.7"生防菌株A18589的鑒定

2.7.1"形態學鑒定

菌株A18589在LB培養基上，28℃培養24"h后，形成中等大小、乳白色不透明、扁平、邊緣不規則、皺褶狀凸起的圓形菌落。菌落表面呈粗糙、不透明、無光澤、干燥的特征，隨著培養時間的增加，菌落逐漸呈現淺黃色（圖4a）。革蘭氏染色后鏡檢呈藍紫色，桿狀，表明該菌株為革蘭氏陽性菌（圖4b）。

2.7.2"生理生化鑒定

由表7可知，菌株A18589表現出對明膠的液化能力，不產生H2S，可利用蔗糖、果糖和甘露醇，葡萄糖發酵、麥芽糖發酵呈現陽性，而半乳糖發酵呈現陰性。此外，菌株A18589對丙二酸鹽、七葉苷和甲基紅檢測呈現陰性，而VP反應呈陽性，該結果與貝萊斯芽胞桿菌參考菌株X2的生理生化結果一致。

2.7.3"分子生物學鑒定

分別使用16S"rDNA基因序列和多基因聯合系統發育分析，對菌株A18589進行分子生物學鑒定。16S序列分析表明，菌株A18589與Bacillus屬的菌株劃分在同一分支，表明菌株A18589為Bacillus屬，但是無法將其鑒定到種水平（圖5）。為

了進一步鑒定到種水平，利用glpF、ilvD、ptA、purH、rpoD、tpiA等基因進行了多位點序列分析（MLSA）。結果表明，菌株A18589與B.velezensis的標準菌株DR08聚在同一分支（圖6）。綜合形態特征、生理生化特性以及16S"rDNA基因序列分析結果，A18589菌株被鑒定為貝萊斯芽胞桿菌，并已保存于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏編號為CGMCC1.18865。

3"結論與討論

蘋果樹腐爛病一直依賴化學殺菌劑進行控制，但其潛在危害促使科研人員尋找生物替代方案。通過分離和純化發病蘋果園土壤中的473株細菌，成功獲得1株高效的貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis（A18589），對蘋果樹腐爛病表現出顯著防治效果。與化學藥劑相比，生防菌表現出易降解、無污染、無抗藥性、無殘留等環保特性，提供了可行性生物防治方案。

菌株A18589在室內拮抗試驗中對蘋果樹腐爛病菌Valsa"mali表現出顯著的抑制效果，抑制率為86.85%。其發酵過濾液對V.mali的菌絲生長和孢子萌發具有顯著的抑制活性，抑制率分別為91.11%和72.81%，驗證了其產生具有抑制作用的活性物質。貝萊斯芽胞桿菌作為產生抗菌活性物質的細菌，在農業生產中具有生物防治調節劑的潛在價值［21］。其在培養基和蘋果樹枝條上對腐爛病菌的抑制效果顯著，并對其他多種植物病原真菌也表現出顯著的抑制效果。

貝萊斯芽胞桿菌用于防治蘋果樹腐爛病的報道較少見。劉欣等［22］從草原土樣中分離得到貝萊斯芽胞桿菌DM529，在蘋果樹腐爛病離體枝條上的防治效果在64%以上。鄭雪晴等［18］在田間試驗測定了貝萊斯芽胞桿菌BV2007+ND7對蘋果樹腐爛病的防治效果，結果表明該菌株的防治效果達到了58.56%。而本研究篩選出的貝萊斯芽胞桿菌菌株A18589在室內的離體枝條試驗和田間試驗中均展現出顯著的防治效果，其中田間防效高達63.59%。這表明菌株A18589在樹體中展現良好的防治活性。生防菌株的定殖是生防菌發揮生防作用的基礎，有研究表明，可通過制備相應劑型提高生防菌在寄主植物上的定殖能力［23］。前期研究表明微生物膏劑防效優于發酵液［2425］。針對蘋果樹腐爛病，本研究將生防菌制備成膏劑通過涂干法施用于樹干或刮除傷口以提高在施藥位置的定殖能力，發現菌株A18589膏劑較發酵液對活體枝條腐爛病表現出更好地防治效果，保護作用方面，膏劑防效達到68.27%，治療作用方面，膏劑防效達到55.32%。

鑒于菌株A18589對蘋果樹腐爛病菌Valsa"mali的較好抑制效果，未來將深入探究其抑制機制，全面評估其促進生長和誘導植物抗性等附加作用，為其產業應用提供理論支持。

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（責任編輯：田"喆）