華蟾素調控AKT介導的上皮間質轉化抑制肝細胞癌肺轉移裸鼠模型的作用機制

通信作者：宋海燕，songhy@126.com（ORCID：0000-0003-2155-8110）；張春蕾，clzhang213@163.com（ORCID：0000-0002-3934-7816）

摘要：目的研究華蟾素通過調控肝細胞癌（HCC）上皮間質轉化（EMT）抑制HCC轉移的作用和機制。方法將36只6周齡雄性BALB/c裸鼠尾靜脈注射MHCC97H細胞建立肝癌肺轉移瘤模型，隨機分為華蟾素高、低劑量組和對照組。建模當日起分別腹腔注射華蟾素120μL/kg、60μL/kg或生理鹽水，每周2次。8周后取肺組織行HE染色檢測肝癌肺轉移率。MHCC97H細胞用華蟾素高、低劑量（2.5μL/mL、5μL/mL）干預，通過劃痕實驗、RT-PCR以及Western Blot檢測細胞遷移能力和EMT相關分子的表達。用CoCl2孵育模擬低氧環境誘導MHCC97H細胞，同時加入高、低劑量華蟾素干預，通過劃痕實驗和Western Blot檢測華蟾素對低氧誘導的細胞遷移能力和EMT的影響。使用轉錄組學分析華蟾素對MHCC97H細胞的效應機制。用Western Blot檢驗華蟾素干預對MHCC97H細胞的蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（P-AKT）表達水平的影響。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用成組t檢驗。結果華蟾素干預組裸鼠較對照組肝癌肺轉移率下降。與對照組相比，華蟾素干預使MHCC97H細胞劃痕愈合率減小、上皮型分子表達上調（t=2.860，Plt;0.05），并使EMT轉錄因子和基質型分子下調（t值分別為3.545、2.022、2.852、2.341，P值均lt;0.05）。低氧誘導上調MHCC97H細胞劃痕愈合率和基質型分子、EMT轉錄因子表達水平（P值均lt;0.05），華蟾素干預逆轉EMT變化并抑制劃痕愈合（P值均lt;0.05）。肝癌細胞轉錄組學分析顯示，華蟾素組與對照組存在顯著的基因差異，華蟾素主要影響了腫瘤、代謝、免疫和信號傳導相關基因表達，其中AKT信號轉導通路中的差異基因數量最多。進一步檢測發現華蟾素干預可下調HCC細胞AKT、P-AKT和P-AKT/AKT的水平（t值分別為2.434、3.401、2.258，P值均lt;0.05）。結論華蟾素可抑制肝癌轉移，尤其對于低氧環境誘導的肝癌轉移具有顯著抑制作用，調控AKT信號轉導通路介導的HCC細胞EMT可能是其部分作用機制。

關鍵詞：癌，肝細胞；腫瘤轉移；華蟾素；上皮-間質轉化

基金項目：上海市青年科技英才揚帆計劃項目（20YF1450000）；龍華醫院科技創新項目（CX202205）；上海市衛生健康委衛生行業臨床研究專項（202040223）

Mechanism of action of cinobufotalin in inhibiting lung metastasis of hepatocellular carcinoma by regulating AKT-mediated epithelial-mesenchymal transition in a nude mouse model

YANG Yue1a，XU Siyu1a，WANG Jue1a，DU Shilin2，ZHANG Chunlei1a，SONG Haiyan1a.（1.a.Institute of Digestive Diseases，b.Department of Emergency，Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China；2.Department of Emergency，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai 200032，China）

Corresponding authors：SONG Haiyan，songhy@126.com（ORCID：0000-0003-2155-8110）；ZHANG Chunlei，clzhang213@163.com（ORCID：0000-0002-3934-7816）

Abstract：Objective To investigate the effect and mechanism of cinobufotalin in inhibiting hepatocellular carcinoma（HCC）metastasis by regulating epithelial-mesenchymal transition（EMT）.Methods A total of 36 male BALB/cnude mice，aged 6 weeks，were given injection of MHCC97H cells via the caudal vein to establish a model of HCC lung metastasis，and then the mice were randomly divided into high-and low-dose cinobufotalin groups and control group.Since the day of modeling，the mice in the high-and low-dose cinobufotalin groups were given intraperitoneal injection of cinobufotalin at a dose of 120μL/kg and 60μL/kg，respectively，and those in the control group were given intraperitoneal injection of normal saline，twice a week.After 8 weeks，HE staining was performed for lung tissue to measure the lung metastasis rate of HCC.MHCC97H cells were treated with high-dose（2.5μL/mL）or low-dose（5μL/mL）cinobufotalin for 24 hours，and wound healing assay，RT-PCR，and Western blot were used to measure cell migration ability and the expression of EMT-related molecules.MHCC97H cells were induced in a simulated hypoxic environment with CoCl2 incubation，with high-and low-dose cinobufotalin added for intervention，and wound healing assay and Western blot were used to investigate the effect of cinobufotalin on cell migration ability and EMT induced by hypoxia.Transcriptome analysis was used to investigate the effect mechanism of cinobufotalin on MHCC97H cells，and Western blot was used to observe the effect of cinobufotalin on the expression levels of protein kinase B（AKT）and phosphorylated AKT（P-AKT）in MHCC97H cells.A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups，and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups；the independent-samples t test was used for comparison of categorical data between two groups.Results Compared with the control group，the cinobufotalin group had a significant reduction in the lung metastasis rate of HCC.Compared with the control group，cinobufotalin intervention reduced the wound healing rate of MHCC97H cells，upregulated the expression of epithelial-type molecules（t=2.860，Plt;0.05），and downregulated the expression of EMT transcription factors（EMT-TFs）and mesenchymal molecules（t=3.545，2.022，2.852，and 2.341，all Plt;0.05）.Hypoxia induction upregulated the wound healing rate of MHCC97H cells and the expression levels of mesenchymal molecules and EMT-TFs（Plt;0.05），and cinobufotalin intervention reversed EMT change and inhibited wound healing（Plt;0.05）.The transcriptome analysis of MHCC97H cells showed significant gene differences between the cinobufotalin group and the control group，and cinobufotalin mainly affected the expression of genes associated with tumor，metabolism，immunity，and signal transduction，with the largest number of differentially expressed genes in the AKT signal transduction pathway.Further measurement showed that cinobufotalin intervention downregulated the expression levels of AKT，P-AKT，and P-AKT/AKT in MHCC97H cells（t=2.434，3.401，and 2.258，all Plt;0.05）.Conclusion Cinobufotalin can inhibit the metastasis of HCC，especially hypoxia-induced HCC metastasis，and regulation of EMT mediated by the AKT signal transduction pathway in HCC cells might be one of its mechanisms of action.

Key words：Carcinoma，Hepatocellular；Neoplasm Metastasis；Hua Chan Su；Epithelial-Mesenchymal Transition

Research funding：Shanghai Youth Technology Talents Sailing Program（20YF1450000）；Longhua Hospital Technology Innovation Project（CX202205）；Clinical Research Special Project of Shanghai Municipal Health Commission（202040223）

肝癌是全球第六常見癌癥和第三癌癥相關死亡原因，在我國占癌癥死因的第二位，肝細胞癌（HCC）是其中最常見的類型［1-2］。HCC進展迅速，且具有高度侵襲轉移能力，易發生肝內外轉移，能通過手術切除患者僅占10%～15%，并且術后轉移復發率高［3-4］，導致大多數HCC患者預后較差。近年來研究［5-6］顯示，腫瘤細胞上皮間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是其侵襲轉移能力增強的重要機制，成為現代抗腫瘤轉移治療研究的關鍵靶標。有多種因素可誘導HCC細胞發生EMT，如炎性微環境、肝纖維化、代謝應激等，其中低氧是包括HCC在內的實體瘤EMT的常見誘因［7］。

中醫藥在我國HCC治療中效果確切，單獨或聯合其他治療具有抑制進展、減少復發轉移、延長生存期等作用。中醫學認為肝癌主要病機為本虛標實、正虛邪實，正虛以脾虛為突出，邪實以邪氣內蘊、熱毒血瘀等為突出，運用清熱解毒、疏肝理氣、活血散結等治法。蟾蜍在《新修本草》記載：“主邪氣，破癥堅血，癰腫，陰瘡，服之不患熱病”。華蟾素自中華大蟾蜍提取，是我國自行研制的二類新藥和國家中藥保護品種，具有清熱解毒、化瘀潰堅、利水消腫、止痛等功效，廣泛應用于包含HCC在內的中晚期腫瘤的治療。華蟾素聯合肝動脈插管灌注化療栓塞療效優于常規藥物，并且能夠減輕肝癌患者肝臟炎癥，改善生存質量［8-9］。實驗研究［10-11］發現華蟾素可以抑制HCC的生長和轉移，但其相關機制研究目前仍然缺乏。因此，本研究擬基于EMT調控，通過體內外實驗研究華蟾素抑制HCC轉移的作用和相關機制。

1實驗方法

1.1動物實驗

1.1.1實驗動物和藥物5周齡雄性BALB/c裸鼠36只，

購自上海靈暢生物科技有限公司［許可證號為SCXK（滬）2018-0003；合格證編號為20180003031851］，飼養于龍華醫院SPF級動物房裸鼠室，飼養室內溫度為（24±2）℃，濕度（55±10）%，光照時間12 h（8∶00—20∶00）。華蟾素注射液為安徽華潤金蟾藥業股份有限公司產品（國藥準字Z34020273，批號：22G110-1）。根據華蟾素的人常規劑量按照人鼠體表面積換算為低劑量，高劑量為低劑量的2倍。鑒于既往文獻［11］更低劑量無明顯效應，因此本研究未使用更低劑量。ALT和肌酐檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司（貨號：C009-2-1，C011-2-1）。

1.1.2 HCC肺轉移裸鼠模型及藥物干預裸鼠適應性飼養1周后，尾靜脈注射1×106個MHCC97H細胞以建立HCC肺轉移模型［12］。隨機分為3組：華蟾素高劑量組（n=12）、華蟾素低劑量組（n=10）、對照組（n=12），建模當日起分別腹腔注射華蟾素高（120μL/kg）、低劑量（60μL/kg）或生理鹽水，每周2次，持續8周。

1.1.3肺組織HE染色8周后麻醉處死裸鼠，取肺組織置于4%中性福爾馬林中固定24 h，隨后脫水、石蠟包埋，并進行連續切片，厚度為5μm/片。切片脫蠟后用蘇木素染色2 min，伊紅染色20 s，自來水沖洗后封片，在顯微鏡下拍攝。

1.1.4小鼠血清生化指標檢測依據試劑盒說明檢測小鼠血清ALT和肌酐含量。

1.2細胞實驗

1.2.1實驗材料DMEM培養基、青霉素-鏈霉素（美國賽默飛世爾科技公司，貨號：11965092、15140122）、CoCl2（AR滬試，貨號：10007216）、Trizol（美國Life Technologies公司，貨號：15596018）、RNA逆轉錄試劑盒、RNA擴增試劑盒（艾科瑞生物，貨號：AG11706、AG11740）、RIPA蛋白裂解液（碧云天生物技術有限公司，貨號：P0013B）、微量BCA蛋白定量試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，貨號：CW0014S）、ECL發光底物（美國Millipore公司，貨號WBKLS0500）。抗體來源：vimentin、AKT、P-AKT、N-cadherin、Snail、EPCAM均購自武漢proteintech公司，貨號分別為10366-1-AP、10176-2-AP、66444-1-Ig、22018-1-AP、13099-1-AP、21050-1-AP；Slug、β-actin、HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）購于武漢ABclonal公司，貨號分別為A1057、AC026、AS014。

1.2.2細胞培養人肝癌細胞MHCC97H購于復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所，培養于含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養基，置于37℃、95％空氣濕度和5％CO2條件下培養。用含有150μmol/L CoCl2培養基誘導細胞，模擬低氧環境。

1.2.3劃痕實驗將5×105個MHCC97H細胞種植于6孔板中，待鋪滿后用10μL tip頭進行劃痕。加入高（5μL/mL）、低劑量（2.5μL/mL）華蟾素干預肝癌細胞。低氧實驗中加入CoCl2同時孵育，模擬低氧環境。24 h后觀察劃痕愈合情況，于顯微鏡下拍照并用Image J分析各組細胞遷移情況。

1.2.4 RT-PCR檢測提取細胞總RNA，運用Evo M-MLVRT Master Mix逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成，序列如下：hActin F：TGACGTGGACATCCGCAAAG，R：CTGGAAGGTGGACAGCGAGG；hE-cadherin F：AATTGC TCACATTTCCCAACTC，R：GATTTGATCTGAACCAGGTT TTTAG；hVimentin F：AAATGGCTCGTCACCTTCG，R：CAGATTAGTTTCCCTCAGGTTCA。應用SYBR Green Pro Taq HSqPCR試劑盒在Stepone Plus儀器（美國Applied Biosystems公司）上進行PCR擴增，以β-actin為內參，應用2?△△Ct方法計算基因mRNA表達水平。

1.2.5 Western Blot檢測用RIPA裂解液超聲下裂解細胞提取蛋白，用BCA法檢測濃度。蛋白加入上樣緩沖液，經95℃變性后用10%的SDS-PAGE電泳分離條帶。條帶轉至PVDF膜，封閉后加入抗β-actin（1∶50 000稀釋）、vimentin、N-cadherin（1∶5 000稀釋）、AKT、Snail、EpCAM、Slug（1∶1 000稀釋）或P-AKT（1∶2 000稀釋）抗體于4℃孵育過夜。然后膜加入二抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h，于ECL發光液反應后用Tanon 4600生物發光成像儀（上海天能科技有限公司）進行條帶采集分析。1.3基因轉錄組學分析華蟾素（5μL/mL）干預24 h的MHCC97H細胞及對照細胞，加入Trizol輕柔吹打后凍存，委托上海伯豪生物技術有限公司進行mRNA測序分析。RNA抽提質檢合格后構建測序文庫，使用Illumina NovaSeq6000平臺，用PE150（Pair-end 150 bp）模式進行測序。1.4統計學方法用SPSS 24.0和Graphpad Prism 9.0軟件進行數據統計分析和作圖，計量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用成組t檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1華蟾素抑制HCC轉移裸鼠尾靜脈注射MHCC97H細胞并干預8周后，圖1a、b顯示肺組織連續切片HE染色結果。對照組裸鼠多數出現肺轉移灶，其肺轉移率為83%（12只裸鼠中10只出現轉移），華蟾素低劑量組肺轉移率60%（10只中有6只轉移），高劑量組肺轉移率50%（12只中有6只轉移），表明華蟾素對裸鼠HCC肺轉移具有干預作用。圖1c、d顯示，和對照組相比，用藥組血清ALT活力和肌酐含量的差異均無統計學意義（P值均gt;0.05），表明華蟾素對裸鼠無肝腎毒性。

MHCC97H細胞劃痕實驗（圖2）顯示，劃痕24 h后，對照組細胞間隙明顯縮小；與對照組相比，華蟾素干預組劃痕愈合程度均減少（P值均lt;0.01）。提示華蟾素可抑制HCC細胞的遷移能力。

2.2華蟾素調節HCC細胞EMT相關分子的表達水平為探索華蟾素影響肝癌轉移的機制，檢測了EMT相關分子的表達水平。RT-PCR結果顯示，與對照組相比，華蟾素高劑量干預的MHCC97H細胞E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的mRNA表達升高（Plt;0.05）、波形蛋白（vimentin）mRNA水平下降（Plt;0.05），華蟾素低劑量干預僅有降低趨勢（圖3a）。因此，后續實驗主要選用華蟾素高劑量。Western Blot結果如圖3b、c所示，與對照組相比，華蟾素處理的HCC細胞上皮型標志物上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的表達水平升高（t=2.860，Plt;0.01），而EMT轉錄因子Snail、Slug表達水平以及基質型標志物vimentin和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達水平降低（t值分別為3.545、2.022、2.852、2.341，P值均lt;0.05）。

2.3華蟾素對低氧誘導的HCC細胞遷移及EMT的作用肝癌作為一種實體瘤，瘤組織中往往存在血供不足造成的低氧微環境，這與EMT發生密切相關［7］，因此本研究進行了低氧誘導下細胞遷移能力及EMT相關檢測。劃痕實驗顯示，低氧誘導的MHCC97H細胞劃痕愈合率增加（Plt;0.05），華蟾素干預使其下調（P值均lt;0.05）（圖4a、b）。同時，低氧誘導使肝癌細胞EMT相關基質型分子N-cadherin、vimentin和EMT轉錄因子Snail表達上調（P值均lt;0.05）；華蟾素可逆轉這些表達變化（P值均lt;0.05）（圖4c、d）。

2.4華蟾素干預的HCC細胞轉錄組學分析mRNA sequence數據聚類分析熱圖顯示華蟾素組和對照組MHCC97H細胞間存在顯著的基因表達差異（圖5a）。火山圖顯示華蟾素干預后共有3 112個基因表達差異，其中2 346個基因上調、766個基因下調（圖5b）。KEGG富集分析顯示，華蟾素主要影響了肝癌細胞與腫瘤、細胞生長運動、代謝、免疫和信號傳導等相關基因的表達（圖5c）。在信號傳導通路中，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號轉導相關差異基因數量最多，有75個基因在華蟾素干預后表達發生改變，包括磷脂酰肌醇3-激酶調節亞基1（1PIK3R1）、磷酸酶PTEN、磷酸酶PHLPP2等表達上調，纖維連接蛋白1、血管內皮生長因子α、血小板源性生長因子β等表達下調。

2.5華蟾素抑制HCC細胞PI3K/AKT信號轉導通路基于轉錄組學分析，對MHCC97H細胞PI3K/AKT信號轉導通路活化水平進行檢測。結果顯示，和對照相比，華蟾素處理的HCC細胞中AKT、磷酸化AKT（phospho-AKT，P-AKT）及P-AKT/AKT水平均下調（t值分別為2.434、3.401、2.258，P值均lt;0.05）（圖6）。

3討論

臨床研究［13-14］顯示，華蟾素在肝癌、胰腺癌、肺癌、淋巴瘤等中晚期腫瘤中均表現出抑制腫瘤復發轉移的作用，可延長患者生存期，改善中晚期腫瘤患者生活質量。另外，Meta分析［15］表明，與單獨TACE治療的HCC患者相比，TACE聯合華蟾素注射液輔助治療能夠顯著延長患者總生存期，提高患者生活質量。華蟾素聯合解毒顆粒可推遲肝癌術后腫瘤復發和轉移，提高術后生存率［16］。通過體內實驗，本研究也證實華蟾素抑制裸鼠肝癌肺轉移的作用，體外實驗表明該作用可能由于其抑制HCC細胞的遷移能力。

研究［17］表明EMT與腫瘤細胞侵襲和遷移能力密切相關。EMT是上皮型細胞轉換為具有運動能力的間充質型細胞表型并伴隨有細胞黏附分子的表達和細胞骨架的改變［18］。在此過程中，受EMT轉錄因子Snail、Slug、Twist等調控，腫瘤細胞逐漸丟失上皮細胞的部分特征，如E-鈣黏蛋白水平下降，導致細胞的黏附力降低，同時獲得間質細胞的某些特殊屬性，vimentin、N-cadherin等表達升高，使細胞骨架改變形態趨向紡錘形，細胞運動遷移能力增強，從而促進腫瘤細胞的擴散和轉移［19-21］。本研究發現華蟾素干預可下調EMT轉錄因子Snail、Slug及基質型相關分子的表達，上調上皮型分子的表達水平，表明華蟾素可以抑制HCC細胞的EMT變化。

腫瘤生長迅速，對氧及能量物質需求增加，且腫瘤組織內往往血液供應不足，有90%的實體腫瘤存在低氧微環境，其中HCC是低氧最嚴重的惡性腫瘤之一［22-23］。研究［24］發現低氧能夠上調血管擴張劑刺激磷酸化蛋白（vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP）表達，VASP通過激活AKT和ERK信號通路促進EMT和基質金屬蛋白的表達，促進HCC侵襲轉移。低氧誘導CSN8（COP9 signalosome subunits 8）在結直腸細胞中高表達，通過調控EMT促進結直腸細胞侵襲和轉移能力［25］。本研究應用CoCl2模擬低氧環境，發現低氧誘導使HCC細胞遷移能力較對照組增加，華蟾素干預使其明顯下調。并且低氧誘導加劇HCC細胞EMT，華蟾素干預使其逆轉。

為進一步探討華蟾素對肝癌的效應機制，進行HCC細胞基因轉錄組學分析。結果顯示，華蟾素影響了肝癌代謝、免疫、細胞生長運動等多方面，差異基因KEGG富集分析發現華蟾素干預對PI3K/AKT信號通路影響顯著。PI3K/AKT被認為是抑制腫瘤細胞EMT的重要信號通路［26-27］，激活該通路可調控EMT轉錄因子促進腫瘤細胞EMT轉化［28-29］。其中AKT是該信號傳導通路的關鍵激酶。研究［30］發現，Osteoglycin（OGN）通過抑制PI3K/Akt信號激活，從而抑制乳腺癌細胞EMT，降低乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。PI3K/AKT信號通路也是TGF-β誘導肺癌細胞EMT轉化的關鍵，抑制該通路可抑制EMT進而抑制肺癌轉移［31］。此外，藥物可通過調控PI3K/AKT信號介導抑制EMT效應。如野黃芩苷可下調PI3K/AKT活化抑制黑色素瘤細胞EMT和血管生成［32］。蟾毒靈、黃酮苷可通過誘導PI3K/AKT信號失活從而抑制肝癌細胞EMT，發揮抗肝癌轉移的作用［33-34］。本研究結果顯示華蟾素干預HCC細胞可下調AKT的表達和活化水平。另外，PTEN及PHLPP2可下調AKT活化通路中的第二信使而具有負調控作用［35］，本研究中轉錄組學檢測到在華蟾素干預組上調這兩種蛋白磷酸酶。這些結果提示該藥物可能通過對PI3K/AKT信號調控抑制HCC細胞EMT。

綜上，本研究結果表明，華蟾素可抑制肝癌的轉移，尤其對于低氧環境誘導的肝癌轉移具有顯著抑制作用，其機制可能與通過調控AKT信號轉導通路介導的HCC細胞EMT有關。本研究有助于闡釋華蟾素對肝癌效應機制的認識，為中醫藥治療肝癌提供科學依據。中藥提取物作用靶點廣泛復雜，因此后續本課題組將依據轉錄組學及體內外實驗結果，對華蟾素調控EMT及其他肝癌生長和轉移相關的分子機制進一步深入探討。

倫理學聲明：本研究方案于2019年4月18日經由上海中醫藥大學附屬龍華醫院實驗動物倫理委員會審批，批號：LHERAW-19017，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：楊悅、續嗣鈺、王玨、杜施霖參與收集數據，資料分析；楊悅負責撰寫論文；張春蕾、宋海燕負責課題設計，指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2023-12-20；錄用日期：2024-01-23

本文編輯：王亞南

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